一種提高青霉產纖維素酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高青霉產纖維素酶的方法。該方法是將PDA培養基中復壯的青霉孢子接種到青霉種子培養基中培養，得到一級種子培養液；然后再將一級種子培養液接種到添加了蕎麥提取液的發酵培養基中培養。本發明利用蕎麥提取液作為青霉發酵培養基的添加劑，大幅度的提高青霉產纖維素酶酶活，方法簡單易行，成本相對低廉，效果良好。
【專利說明】一種提高青霉產纖維素酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及提高酶活的方法，尤其涉及的是一種提高青霉產纖維素酶的方法。
【背景技術】
[0002]隨著傳統能源儲備日漸衰竭，能源危機成為制約各國高速發展的重要因素，尋找并大力發展可持續再生資源成為全球熱點問題之一。纖維素是全球數量最大的可再生資源，主要存在于植物的細胞壁中，每年全球光合作用產生的植物生物量高達1.145X IO12噸，而纖維素資源占地球總生物量的60%~80%。利用纖維素生產新型清潔能源及其他生物化學副產物是當今研究開發的熱點。
[0003]我國擁有豐富的纖維素資源，僅秸桿皮殼一項，每年可達7億多噸，其中玉米秸(35%)、小麥秸(21%)和稻草(19%)是我國的三大秸桿。2001年，我國開始實施燃料乙醇計劃，至今已成為世界上僅次于巴西和美國的第三大燃料乙醇生產國。2007年，中國政府頒布的《可再生能源中長期發展規劃》中指出，大力發展以非糧物質為燃料乙醇的生產原料，預計到2020年生物燃料乙醇的年利用量為1000萬噸。
[0004]纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協同作用分解纖維素產生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖。纖維素酶的復合酶系主要有3個成分，內切葡聚糖酶(1，4_β -D-glucangiucanohydrolase 或 endo-1，4_β -D-glucanase，E.C3.2.1.4，來自真菌簡稱 EG);外切葡聚糖酶(I, 4_β -D-glucan cel1biohydrolase 或exo-1,4_ β -D-glucanase, E.C3.2.1.91,來自真菌簡稱 CBH ;來自細菌簡稱 Cex)。β -葡萄糖苷酶(i3-l，4-g lucOS1-daSe，E.C3.2.1.21，簡稱86)。葡聚糖內切酶和葡聚糖外切酶主要溶解纖維素，β-葡萄糖苷酶主要是將纖維二糖、纖維三糖轉化生成葡萄糖。經過多年的研究，纖維素酶已廣泛運用于各個行業，如食品、紡織、釀酒、飼料、石油勘探、中藥成分提取等。特別是在新能源、洗滌、造紙、紡織等行業占據著舉足輕重的地位。
[0005]纖維素酶來源廣泛，細菌、放線菌、絲狀真菌等均能產生纖維素酶。其中真菌所產的纖維素酶酶系結構較全，且多為胞外酶，提取純化較容易，產酶量較高，成本相對較低，是現在工業的王要囷種。研究較多的有木霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬和漆斑霉屬。
[0006]蕎麥中富含蛋白質、淀粉、礦物質、維生素及豐富的黃酮類化合物，這些物質作為生長因子能刺激纖維素產生菌的生長及纖維素酶的產生。目前，提高產纖維素酶菌酶活的主要方法是誘變育種及利用基因工程構建高產纖維素降解菌，這些方法步驟繁瑣、代價較聞。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術在提高纖維素酶菌酶活中存在的問題，提供了一種提高青霉產纖維素酶的方法。
[0008]本發明的技術方案如下:
[0009]一種提高青霉產纖維素酶的方法，其步驟如下:[0010](I)蕎麥提取液的制備
[0011]將蕎麥加入蒸餾水中浸泡Ih后，用電爐加熱至沸騰，保持微沸30min，冷卻至室溫，用超聲波破碎儀處理后，7000r/min離心15分鐘，取上清液，即得到蕎麥提取液；
[0012](2)—級種子培養
[0013]在無菌環境中，接種一環PDA培養基中復壯的青霉孢子至100ml青霉種子培養基中，在28°C，190r/min條件下培養48h，得到一級種子培養液；其中，青霉種子培養基的成分為:每IOOmL蒸懼水中含蛋白胨0.5g,葡萄糖1.0g,酵母浸出膏0.4g,硫酸鎂0.05g,磷酸二氫鉀0.2g,磷酸氫二鉀0.4g ；
[0014](3)發酵培養
[0015]在無菌環境中，將(2)中制得的一級種子培養液接種至發酵培養基中，在28°C，185r/min條件下培養6d ;其中，發酵培養基的成分為:每100ml蒸懼水中含蛋白胨0.4g,酵母浸出膏0.05g,硫酸銨0.2g，磷酸二氫鉀0.4g，淀粉3.0g,硫酸鎂0.03g,微晶纖維素
3.6g，氯化鈣0.03g,蕎麥提取液IOml。
[0016]所述的方法，步驟(1)中，蕎麥和蒸餾水的質量體積比為1:10。
[0017]所述的方法，步驟(1)中，超聲破碎的處理參數為:總時間30min，超聲波時間5s，間歇時間3s，功率50%。
[0018]所述的方法，步驟(3)中，一級種子培養液和發酵培養基的體積比為1:11。
[0019]本發明有益效果為:蕎麥熬煮后體積`膨大，種皮破裂，有利于超聲波破碎，超聲波處理后，蕎麥營養成分大部分溶解于水中，離心去除細胞壁細胞器等成分，得到較純的蕎麥提取液。本發明材料廉價易得，方法簡單易行，蕎麥提取液作為青霉發酵培養基的添加劑能有效的提高青霉產纖維素酶的酶活。
【具體實施方式】
[0020]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0021]實施例1蕎麥提取液的制備
[0022]稱取20g蕎麥，加入200ml蒸餾水浸泡Ih后，電爐加熱至沸騰，調整加熱溫度，保持微沸狀態30min，此時蕎麥已膨大變白。蕎麥初提取液冷卻至室溫后進行超聲波破碎，超聲波破碎儀設定參數為功率50%、總時間30min、超聲波時間5s，間歇時間3s。最后，在7000r/min下離心15min,取上清，即得到蕎麥提取液。
[0023]實施例2 —級種子培養
[0024]準確稱量蛋白胨0.5g、酵母膏1.0g、硫酸鎂0.05g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸二氫鉀
0.4g于250ml錐形瓶中并用80ml蒸餾水溶解，稱取葡萄糖1.0g, 20ml蒸餾水溶解，兩者滅菌冷卻后，在超凈工作臺中，將葡萄糖溶液倒入250ml錐形瓶，并接種一環PDA培養基上的青霉孢子，在28°C, 190r/min條件下培養48h,得一級種子培養液。
[0025]實施例3發酵培養
[0026]準確稱量蛋白胨0.2g，酵母浸出膏0.025g，硫酸銨0.lg，磷酸二氫鉀0.2g，淀粉
1.5g，硫酸鎂0.015g，氯化鈣0.015g，蒸餾水50ml、微晶纖維素1.8g、蕎麥提取液5ml，至于250ml錐形瓶中，依此做三個重復。滅菌冷卻后，在無菌環境中，接種5ml實施例2制得的一級種子液，至于搖床中，280C，185r/min條件下培養6d。收集粗酶液后，測定CMC酶活為156.65U/ml，濾紙酶活為 24.78U/ml。
[0027]實施例4發酵培養
[0028]實施步驟如實施例3，只是培養基中不加入蕎麥提取液，測定CMC酶活為58.48U/ml,濾紙酶活為9.66U/ml。
[0029]應當理解的是，對 本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
【權利要求】
1.一種提高青霉產纖維素酶的方法，其特征是，其步驟如下: (1)蕎麥提取液的制備 將蕎麥加入蒸餾水中浸泡Ih后，用電爐加熱至沸騰，保持微沸30min，冷卻至室溫，用超聲波破碎儀處理后，7000r/min離心15分鐘，取上清液，即得到蕎麥提取液； (2)—級種子培養 在無菌環境中，接種一環PDA培養基中復壯的青霉孢子至100ml青霉種子培養基中，在28°C,190r/min條件下培養48h，得到一級種子培養液；其中，青霉種子培養基的成分為:每IOOmL蒸懼水中含蛋白胨0.5g,葡萄糖1.0g,酵母浸出膏0.4g,硫酸鎂0.05g,磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鉀0.4g ； (3)發酵培養 在無菌環境中，將(2)中制得的一級種子培養液接種至發酵培養基中，在28°C，185r/min條件下培養6d ;其中，發酵培養基的成分為:每100ml蒸懼水中含蛋白胨0.4g,酵母浸出膏0.05g，硫酸銨0.2g，磷酸二氫鉀0.4g，淀粉3.0g，硫酸鎂0.03g，微晶纖維素3.6g，氯化鈣0.03g，蕎麥提取液10ml。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是，步驟(1)中，蕎麥和蒸餾水的質量體積比為1:10。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是，步驟(1)中，超聲破碎的處理參數為:總時間30min，超聲波時間5s，間歇時間3s，功率50%。
4.根據權利要求1所·述的方法，其特征是，步驟(3)中，一級種子培養液和發酵培養基的體積比為1:11。
【文檔編號】C12N9/42GK103820422SQ201410066355
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月26日 優先權日:2014年2月26日
【發明者】曾柏全, 馮金儒 申請人:中南林業科技大學