同時制備β-淀粉酶和大豆低聚糖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時制備β-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，包括以下步驟：（1）調節大豆蛋白廢水pH值，加入助濾劑和復合沉淀劑；（2）加入除鹽水，再加入鈣鹽；（3）采用超濾膜處理；（4）采用超濾膜處理，制得β-淀粉酶；（5）采用電滲析法降電導；（6）酵母菌發酵，超濾；（7）采用模擬移動床進行色譜分離，得到大豆低聚糖組分和果糖組分。本發明的同時制備β-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，具有以下有益效果：1、以大豆蛋白廢水為原料，不但充分利用了資源，而且節約了污水處理成本。2、得到的β-淀粉酶酶活高，而且酶的耐酸性和耐溫性好。3、工藝簡單，成本低，并且得到的大豆低聚糖產品純度高。
【專利說明】同時制備淀粉酶和大豆低聚糖的方法【技術領域】
[0001]本發明涉及一種同時制備(6-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，屬于大豆蛋白廢水的綜合應用領域。
【背景技術】
[0002]^ -淀粉酶是一種外切型淀粉酶，作用于淀粉時，從淀粉分子非還原端切斷生成麥芽糖，(6-淀粉酶廣泛存在于大麥、小麥、薯類和豆類等植物中，還有不少微生物能產生
淀粉酶。(6-淀粉酶在食品工業中主要用來生產麥芽糖漿，大豆(6-淀粉酶相對大麥和薯類來源的3 -淀粉酶具有耐酸性強、耐高溫和穩定性好等特點，在麥芽糖漿生產過程中利用其耐酸性能及耐溫性能，適當降低糖化時的PH，提高糖化溫度能有效地防止雜菌污染，降低生廣成本，提聞麥芽糖的生廣能力。
[0003]大豆低聚糖除含有功能組分水蘇糖和棉籽糖外，還含有蔗糖、葡萄糖和果糖等非功能組分，大豆低聚糖中蔗糖、葡萄糖和果糖等非功能組分含量越低，說明其質量越好。大豆低聚糖具有調節腸道菌群平衡、潤腸通便、預防癌癥、調節脂肪代謝、降低血壓、保護肝臟、提高人體免疫力等作用，在食品中有廣泛的應用。
[0004]大豆蛋白廢水中含有大量可溶性物質，如蛋白質、糖類、色素以及各種離子，其中蛋白質除了大豆蛋白外，還有部分淀粉酶和蛋白酶類等，糖類中含有水蘇糖、棉籽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖等，電導大約在5000uS/cm左右，另外，還有少部分異黃酮、卵磷脂和皂甙等。這些可溶性物質是大豆深加工企業廢水的主要污染源，由于其BOD和COD很高，處理起來不但成本高，而且效果較差，并且造成雙重的浪費。
[0005]中國專利2013101 77110.0提到利用大豆蛋白廢水生產P -淀粉酶的方法，但是沒有將其中的低聚糖進行有效的提取，大豆蛋白廢水綜合利用率低，并且該專利沒有將大豆蛋白廢水中大分子量的蛋白質與(6-淀粉酶進行分離，因此得到的(6-淀粉酶酶活低。
[0006]中國專利CN100439382C和CN101538291B均公開了高純度大豆低聚糖的純化方法，但是前者處理方法是間歇式操作，固定相和流動相用量大，分離產物濃度低，分離成本高，不適合工業化生產；后者采用模擬移動床提純大豆低聚糖，但是由于原料大豆低聚糖中不但含有功能組分水蘇糖和棉籽糖，還含有非功能組分蔗糖、葡萄糖和果糖，并且非功能組分種類較多，采用模擬移動床進行色譜分離時，同時將多種非功能組分與多種功能組分很好的分離難度較大，因此大豆低聚糖純度雖然較之前有了較大的提高，但是仍然不能滿足消費者對大豆低聚糖產品質量的需求。
【發明內容】
[0007]針對上述現有技術，針對大豆蛋白廢水處理以及3 -淀粉酶和大豆低聚糖生產現有技術存在的不足，本發明采用大豆蛋白廢水為原料生產高附加值的3-淀粉酶和大豆低聚糖，并提出了復合沉淀及兩級膜超濾生產3 -淀粉酶技術，以及發酵法協同模擬移動床提純大豆低聚糖技術。[0008]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0009]一種同時制備-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，包括以下步驟:
[0010](I)調節大豆蛋白廢水pH值至3.0~5.0 (優選pH值為4.0)，然后加入助濾劑和復合沉淀劑，靜置沉淀20~30min后過濾，得到濾餅和濾液；
[0011](2)將步驟(1)中得到的濾餅加入到5~10°C的除鹽水(采用低溫除鹽水的目的是防止濾餅在磨碎過程中產生熱量造成(6-淀粉酶的失活)中并磨碎分散，然后調PH至6.0~
8.0，溶解后再加入鈣鹽將溶出的復合沉淀劑進行沉淀，然后過濾，得到濾渣和濾液；
[0012](3)步驟(2)中得到的濾液采用截留分子量為80000~90000Da的一級超濾膜處理，從而將包括脂肪氧合酶在內的大分子量的蛋白質去除，得到透過液；
[0013](4)步驟(3)中得到的透過液采用截留分子量為10000~30000Da的二級超濾膜處理，去除小分子量的蛋白質和其它雜質，得到主要成分為(6-淀粉酶的濃縮液，然后向濃縮液中加入穩定劑和防腐劑，制得(6-淀粉酶產品；
[0014](5)步驟(1)中得到的濾液采用電滲析法降電導，然后進行反滲透濃縮，得濃縮液；
[0015](6)將步驟(5)中得到的濃縮液pH值調至4.0~6.0，滅菌后接入酵母菌進行發酵，以去除其中的葡萄糖和蔗糖(采用能發酵蔗糖和葡萄糖而不能發酵水蘇糖和棉籽糖的酵母將其中的蔗糖和葡萄糖去除，減少非功能組分的種類，提高后續模擬移動床色譜提純的分離效果)，發酵完成后離心，并將離心液采用截留分子量為3000~5000Da的超濾膜進行超濾，繼續去除菌體、蛋白以及其它雜質，得透過液；
`[0016](7)將步驟(6)中得到的透過液蒸發濃縮至固形物質量濃度為40~55%，然后采用模擬移動床進行色譜分離，得到大豆低聚糖組分和果糖組分，分別蒸發濃縮后，得到純度90%以上的大豆低聚糖產品和果糖產品。
[0017]所述步驟(1)中，大豆蛋白廢水為低溫豆柏分離蛋白廢水。低溫豆柏為經過低溫脫溶生產得到的豆柏，低溫豆柏蛋白質變性程度低，因此蛋白廢水中P -淀粉酶酶活高，適合用于(6-淀粉酶的生產。
[0018]所述步驟(1)中，助濾劑選自硅藻土或珍珠巖，添加量為大豆蛋白廢水質量的
0.5~1.0%，優選添加量為0.7%。助濾劑的作用一方面是加快過濾速度，另一方面是有利用濾餅溶解過程中3 -淀粉酶的分散，提高生產效率。
[0019]所述步驟(1)中，復合沉淀劑選自聚丙烯酸,添加量為大豆蛋白廢水質量的0.1~
0.3%，優選添加量為0.2%。
[0020]所述步驟(2)中，除鹽水的添加量為濾餅質量的5~8倍；鈣鹽選自氯化鈣或碳酸鈣，添加量為濾餅質量的3~6%。
[0021]所述步驟(3)中，超濾溫度維持在15~25°C，壓力為0.5~1.0MPa0
[0022]所述步驟(4)中，超濾溫度維持在15~25°C，壓力為0.5~1.0MPa，濃縮倍數為10~12倍。
[0023]所述步驟(5)中，電滲析條件為:電流密度為8~12mA/cm2，流量10~14L/h，溫度 15 ~35°C。
[0024]所述步驟(6)中，酵母菌選自面包酵母或啤酒酵母，接種時，接種活化后的種子液；發酵條件為:接種量為5% (種子液占發酵液的體積數)，溫度30~35°C，通氣量為1:0.1~1:0.4,攪拌轉速為50~100r/min,發酵時間為9~15h ;超濾膜進行超濾時,溫度為20~50°C，壓力為 0.5 ~1.0MPa0
[0025]所述步驟(7)中，模擬移動床色譜提純條件為:分離劑為ZGSPC106Na、DTF_02Na或DTF-02H型離子交換樹脂，洗脫劑為除鹽水，分離溫度為60~80°C，切換時間為15~20min，進料流速為2.5~3.5L/h。
[0026]本發明的同時制備P -淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，具有以下有益效果:
[0027]1、本發明以大豆蛋白廢水為原料，不但充分利用了資源，而且節約了污水處理成本，符合國家節能減排、循環經濟和廢棄物資源綜合利用政策。
[0028]2、本發明提出兩級膜對P -淀粉酶進行提純，得到的P -淀粉酶酶活高，而且酶的耐酸性和耐溫性好，大豆P -淀粉酶作用pH為4.5~6.0，作用溫度為55~64°C，大麥等其它來源的P -淀粉酶作用pH為5.1~6.0，作用溫度為55~60°C，特別適合超高麥芽糖漿的生產。
[0029]3、本發明提出利用發酵法及模擬移動床色譜法進行大豆低聚糖的提純，工藝簡單，成本低，并且得到的大豆低聚糖產品純度高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為本發明的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0031]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0032]實施例1以大豆蛋白廢水同時制備P -淀粉酶和大豆低聚糖
`[0033]步驟如下(工藝流程如圖1所示):
[0034](I)復合沉淀
[0035]取大豆蛋白廢水I噸,其中P -淀粉酶酶活為5237u/mL，調pH至5.0，加入大豆蛋白廢水質量1.0%的硅藻土，再加入大豆蛋白廢水質量0.3%的聚丙烯酸，20min后過濾，得到濾餅和濾液。
[0036](2)3-淀粉酶的分離
[0037]將步驟I中濾餅加入到8倍質量5~10°C的除鹽水中進行研磨分散，然后調pH至
8.0溶解，再加入濾餅質量6%的氯化鈣對加入的聚丙烯酸進行沉淀，然后過濾得到濾液和濾渣。
[0038](3) —級超濾
[0039]將步驟I中濾液通過截留分子量為80000~90000Da的超濾膜，超濾溫度為25°C，壓力為1.0MPa，得到透過液，通過酶活測定得知P -淀粉酶的透過率為87.1%。
[0040](4) 二級超濾
[0041]將步驟3中的透過液通過截留分子量為10000~30000Da的超濾膜，超濾溫度為25°C，壓力為1.0MPa，得到濃縮倍數為12倍的濃縮液，P -淀粉酶的截留率為83.3%，向濃縮液中加入穩定劑和防腐劑制得P -淀粉酶產品9.6公斤，收率為68.5%，酶活為93.7萬u/
mLo
[0042](5)電滲析降電導[0043]將步驟I中的濾液采用電滲析法降電導，電流密度為12mA/cm2，流量為14L/h，溫度為35°C，通過電滲析濾液電導率有由6430us/cm降至835us/cm，離子去除率達到87%，然后采用反滲透將濾液濃縮至干物質質量濃度12.5%。
[0044](6)發酵
[0045]將步驟5反滲透的濃縮液滅菌后接入酵母菌進行發酵，接種量為5%，發酵溫度350C，通氣量為1:0.4，攪拌轉速為100r/min，發酵15h后離心，并經截留分子量為3000~5000Da的超濾膜超濾后得透過液，測定透過液中大豆低聚糖含量由原來的54.2%升高至78.8%。
[0046](7)模擬移動床提純
[0047]將步驟6中的透過液蒸發濃縮至質量濃度為55%，采用ZGSPC106Na型離子交換樹脂進行分離，進料流速為3.5L/h，分離溫度為80°C，采用去離子水洗脫，每20min切換一次，提純得到大豆低聚糖純度為95.2%，收率為92%，蒸發濃縮后得到大豆低聚糖產品8.6公斤。
[0048]實施例2以大豆蛋白廢水同時制備P -淀粉酶和大豆低聚糖
[0049]步驟如下:
[0050](I)復合沉淀
[0051]將大豆蛋白廢水I噸,其中(6-淀粉酶酶活為5237u/mL，調pH至4.0，加入大豆蛋白廢水質量0.7%的珍珠巖，再加入大豆蛋白廢水質量0.2%的聚丙烯酸，20min后過濾，得到濾餅和濾液。
[0052](2)3-淀粉酶的分離
`[0053]將步驟I中濾餅加入到6倍質量5~10°C的除鹽水中進行研磨分散，然后調pH至
7.0溶解，再加入濾餅質量4%的碳酸鈣對加入的聚丙烯酸進行沉淀，然后過濾得到濾液和濾渣。
[0054](3) —級超濾
[0055]將步驟I中濾液通過截留分子量為80000~90000Da的超濾膜，超濾溫度為20°C，壓力為0.8MPa，得到透過液，通過酶活測定得知P -淀粉酶的透過率為85.4%。
[0056](4) 二級超濾
[0057]將步驟3中的透過液通過截留分子量為10000~30000Da的超濾膜，超濾溫度為20°C，壓力為0.8MPa，得到濃縮倍數為10倍的濃縮液，P -淀粉酶的截留率為85.9%，向濃縮液中加入穩定劑和防腐劑制得P -淀粉酶產品10.4公斤，收率為74%，酶活為91.2萬u/
mLo
[0058](5)電滲析降電導
[0059]將步驟I中的濾液采用電滲析法降電導，電流密度為10mA/cm2，流量為12L/h，溫度為25°C，通過電滲析濾液電導率有由6430us/cm降至707us/cm，離子去除率達到89%，然后采用反滲透將濾液濃縮至干物質質量濃度13%。
[0060](6)發酵
[0061]將步驟5反滲透的濃縮液滅菌后接入酵母菌進行發酵，接種量為5%，發酵溫度33°C，通氣量為1:0.3，攪拌轉速為75r/min，發酵12h后離心，并經截留分子量為3000~5000Da的超濾膜超濾后得透過液，測定透過液中大豆低聚糖含量由原來的54.2%升高至76.38%o[0062]( 7 )模擬移動床提純
[0063]將步驟6中的透過液蒸發濃縮至質量濃度為50%，采用DTF_02Na型離子交換樹脂進行分離，進料流速為3.0L/h,分離溫度為70°C，采用去離子水洗脫，每ISmin切換一次，提純得到大豆低聚糖純度為97.6%，收率為90.2%，蒸發濃縮后得到大豆低聚糖產品8.1公斤。
[0064]實施例3以大豆蛋白廢水同時制備P -淀粉酶和大豆低聚糖
[0065]步驟如下:
[0066](I)復合沉淀
[0067]將大豆蛋白廢水I噸,其中P -淀粉酶酶活為5237u/mL，調pH至3.0，加入大豆蛋白廢水質量0.5%的硅藻土，再加入大豆蛋白廢水質量0.1%的聚丙烯酸，30min后過濾，得到濾餅和濾液。
[0068](2)3-淀粉酶的分離
[0069]將步驟I中濾餅加入到5倍質量5~10°C的除鹽水中進行研磨分散，然后調pH至
6.0溶解，再加入濾餅質量3%的碳酸鈣對加入的聚丙烯酸進行沉淀，然后過濾得到濾液和濾渣。
[0070](3) —級超濾
[0071]將步驟I中濾液通過截留分子量為80000~90000Da的超濾膜，超濾溫度為15°C，壓力為0.5MPa，得到透過液，通過酶活測定得知P -淀粉酶的透過率為82.9%。
[0072](4) 二級超濾
`[0073]將步驟3中的透過液通過截留分子量為10000~30000Da的超濾膜，超濾溫度為15°C，壓力為0.5MPa，得到濃縮倍數為11倍的濃縮液，@ -淀粉酶的截留率為87.1%，向濃縮液中加入穩定劑和防腐劑制得P -淀粉酶產品8.7公斤，收率為62%，酶活為90.3萬u/
mLo
[0074](5)電滲析降電導
[0075]將步驟I中的濾液采用電滲析法降電導，電流密度為8mA/cm2，流量為10L/h，溫度為15°C，通過電滲析濾液電導率有由6430us/cm降至707us/cm，離子去除率達到86%，然后采用反滲透將濾液濃縮至干物質質量濃度12%。
[0076](6)發酵
[0077]將步驟5反滲透的濃縮液滅菌后接入酵母菌進行發酵，接種量為5%，發酵溫度30°C，通氣量為1:0.1，攪拌轉速為50r/min，發酵9h后離心，并經截留分子量為3000~5000Da的超濾膜超濾后得透過液，測定透過液中大豆低聚糖含量由原來的54.2%升高至73.33%。
[0078](7)模擬移動床提純
[0079]將步驟6中的透過液蒸發濃縮至質量濃度為40%，采用DTF-02H型離子交換樹脂進行分離，進料流速為2.5L/h，分離溫度為60°C，采用去離子水洗脫，每15min切換一次，提純得到大豆低聚糖純度為91.2%，收率為87.3%，蒸發濃縮后得到大豆低聚糖產品10.7公斤。
【權利要求】
1.一種同時制備3 -淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)調節大豆蛋白廢水PH值至3.0~5.0，然后加入助濾劑和復合沉淀劑，靜置沉淀20~30min后過濾,得到濾餅和濾液；(2)將步驟(1)中得到的濾餅加入到5~10°C的除鹽水中并磨碎分散，然后調pH至6.0~8.0，溶解后再加入鈣鹽將溶出的復合沉淀劑進行沉淀，然后過濾，得到濾渣和濾液； (3)步驟(2)中得到的濾液采用截留分子量為80000~90000Da的一級超濾膜處理，得到透過液； (4)步驟(3)中得到的透過液采用截留分子量為10000~30000Da的二級超濾膜處理，得到濃縮液，然后向濃縮液中加入穩定劑和防腐劑，制得(6-淀粉酶； (5)步驟(1)中得到的濾液采用電滲析法降電導，然后進行反滲透濃縮，得濃縮液； (6)將步驟(5)中得到的濃縮液pH值調至4.0~6.0，滅菌后接入酵母菌進行發酵，發酵完成后離心，并將離心液采用截留分子量為3000~5000Da的超濾膜進行超濾，得透過液； (7)將步驟(6)中得到的透過液蒸發濃縮至固形物質量濃度為40~55%，然后采用模擬移動床進行色譜分離，得到大豆低聚糖組分和果糖組分，分別蒸發濃縮后，得到大豆低聚糖和果糖。
2.根據權利要求1所述的同時制備3-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(1)中，大豆蛋白廢水為低溫豆柏分離蛋白廢水。
3.根據權利要求1所述的同時制備3-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(1)中，助濾劑選自硅藻土或珍珠巖，添加量為大豆蛋白廢水質量的0.5~1.0%。
4.根據權利要求1所述的同時制備3-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(1)中，復合沉淀劑選自聚丙烯酸，添加量為大豆蛋白廢水質量的0.1~0.3%。
5.根據權利要求1所述的同時制備3-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，除鹽水的添加量為濾餅質量的5~8倍；鈣鹽選自氯化鈣或碳酸鈣，添加量為濾餅質量的3~6%。
6.根據權利要求1所述的同時制備3-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，超濾溫度維持在15~25°C，壓力為0.5~1.0MPa0
7.根據權利要求1所述的同時制備3-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，超濾溫度維持在15~25°C，壓力為0.5~1.0MPa，濃縮倍數為10~12倍。
8.根據權利要求1所述的同時制備3-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(5)中，電滲析條件為:電流密度為8~12mA/cm2，流量10~14L/h，溫度15~35。。。
9.根據權利要求1所 述的同時制備3-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(6)中，酵母菌選自面包酵母或啤酒酵母，接種時，接種活化后的種子液；發酵條件為:接種量為5%，溫度30~35°C，通氣量為1:0.1~1:0.4，攪拌轉速為50~IOOr/min，發酵時間為9~15h ;超濾膜進行超濾時，溫度為20~50°C，壓力為0.5~1.0MPa0
10.根據權利要求1所述的同時制備(6-淀粉酶和高純度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(7)中，模擬移動床色譜提純條件為:分離劑為ZGSPC106Na、DTF_02Na或DTF-02H型離子交換樹脂，洗脫劑為除鹽水，分離溫度為60~80°C，切換時間為15~20min，進料流速為2 .5~3.5L/h。
【文檔編號】C12N9/24GK103756987SQ201410054913
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月18日 優先權日:2014年2月18日
【發明者】任尚美, 信成夫, 景文利, 于麗, 劉建, 范靜, 張延秀 申請人:山東綠健生物技術有限公司