一種維生素c磷酸化酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種維生素C磷酸化酶及其應用，包括有a)序列為SEQ?ID?NO：1酶；b)在a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本發明提供的維生素C磷酸化酶能特異性作用于維生素C的C2位上進行磷酸化，生成相應的維生素C-2磷酸酯。因此可以利用維生素C磷酸化酶應用于工業化生產維生素C-2磷酸酯，具有很大的商業價值。
【專利說明】一種維生素C磷酸化酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程和酶工程領域，具體涉及一種維生素C磷酸化酶及其應用。【背景技術】
[0002]維生素C憐酸化酶(L-ascorbic acid phosphorylase)又稱為維生素C_2憐酸激酶，屬于酸性磷酸化酶類，是一類可以在親核之間可以催化轉移磷酸基團的酶。維生素C磷酸化酶能立體特異性作用于維生素C的C2位上進行磷酸化，生成相應的維生素C-2磷酸酯。維生素C-2磷酸酯作為維生素C的高附加值產品，克服了維生素C見光、受熱易分解的缺陷，隨著國內維生素C價格的持續走低，開發維生素C的高附加值產品成為了企業發展的新方向，其中維生素C-2磷酸酯就是其典型代表。目前，國內工業化生產維生素C-2磷酸酯主要是通過化學合成法，此法副產物多，產品的后提取資金投入大，而且還伴隨著環境的污染等問題。利用維生素C磷酸化酶轉化維生素C生產維生素C-2磷酸酯具有重要的工業應用價值。
[0003]1993 年，Tastsuro Fujio 等首次在 Pseudomonas azotocolligans ATCC12417 (即黃質桿菌)中發現了維生素C磷酸化酶從而實現了酶法生產維生素C-2磷酸酯的可能，但由于原菌 酶能力低，從而限制了其利用，因此利用基因工程策略構建維生素C磷酸化酶菌株，具有重要的現實意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種維生素C磷酸化酶，即一種具有工業應用價值的酶，為工業化生產維生素C磷酸酯提供了新的路徑。
[0005]本發明獲得的維生素C磷酸化酶基因，包含有756bp的基因，編碼一個由252個氨基酸組成的蛋白質。
[0006]本發明包含的維生素C磷酸化酶，包括有:
[0007]a)序列為 SEQ ID NO:1 的酶；
[0008]b)在a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有a)中所述酶的活性的，由a)衍生的酶
[0009]編碼上述維生素C磷酸化酶的核苷酸，其序列為SEQ ID NO:2。
[0010]本發明還提供用于表達上述維生素C磷酸化酶的重組表達質粒，是將序列為SEQID NO:2的核苷酸片段插入到原核表達載體中構建的。所述的原核表達載體為pET20b_。
[0011]本發明還涉及攜帶有表達上述維生素C磷酸化酶的重組表達質粒的重組菌。
[0012]本發明的維生素C磷酸化酶用于維生素C-2磷酸酯的應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]附圖1為本發明的維生素C磷酸化酶基因DNA電泳圖譜；
[0014]附圖2為利用維生素C磷酸化酶能催化維生素C合成維生素C-2磷酸酯；【具體實施方式】
[0015]一、維生素C磷酸化酶篩選及檢測
[0016]1、黃質桿菌(Sphingomonas trueperi)總 DNA 提取
[0017](I)將黃質桿菌(Sphingomonas trueperi)接種到MM培養基中，于30°C培養過夜。
[0018](2)按細菌基因組提取試劑盒上的方法提取。
[0019]2、編碼維生素C磷酸化酶基因的擴增
[0020]通過BLAST比對得到了來黃質桿菌編碼維生素C磷酸化酶的基因序列，即SEQ IDNO:1所示序列，設計一對寡核苷酸序列引物Pl和P2，其序列為:
[0021]Pl:5/ -CATGCCATGGCAATGATCCGCGGTGGCATCTTCG-3'；
[0022]P2:5/ -CCCAAGCTTTCACCAGGGGCGGACGCGAA-3'
[0023]以實例I提取的基因組DNA作為模板，擴增維生素C磷酸化酶基因。反應程序如下:95°C預變性 3min ；95°C 0.5min、60°C退火 0.5min、72°C延伸 lmin, 30 個循環；72°C延伸IOmin0得到的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結果如圖1。
[0024]3、表達載體及重組菌的構建
[0025]用限制性內切酶Hind III和NocI分別對載體pET20b_和質粒Τ-asp進行雙酶切，膠回收pET20b_線性載體和目標基因，用T4DNA Ligase在16°C條件下連接線性載體和目標基因過夜，連接產物轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞，涂布氨芐抗生素抗性平板，通過對轉化子菌落PCR和酶切驗證，確認獲得陽性克隆E.coli BL21 (DE3)/pET20b__asp。
[0026]4、重組菌的誘導表達和酶活力測定
[0027]接種實施例3中的重組子于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37°C，200rpm條件下培養至菌體OD值達到0.6時，添加0.4mmol/L的IPTG進行誘導，繼續培養3h。取發酵液ImL于1.5mL離心管中于8000rpm下離心5min后分離上清和沉淀,沉淀用500uL的去離子水重懸并利用超聲波破碎儀破碎(超4s間歇4s)，然后分別取200uL的破碎液和上清液作為粗酶液加入到800uL的酶活力測定液中，于42°C、200rpm條件下反應30min后測定菌體酶活力。
[0028]二、維生素C磷酸化酶用于合成維生素C-2磷酸酯
[0029]取30mL實施例4中培養的發酵液于50mL離心管中，于8000 Xg條件下離心5min,并收集菌體，菌體用無菌水洗滌兩次后直接加入到IOmL轉化液中(轉化液成分為:0.4mol/L維生素C、0.2mol/L的焦磷酸鈉，pH4.2)，于37°C條件下反應2.5h，每隔0.5h取樣測定維生素C和維生素C-2磷酸酯的產量，結果 如圖2。
【權利要求】
1.一種維生素C磷酸化酶，其特征在于，所述的維生素C磷酸化酶包括有: a)序列為SEQIDNO:1的酶; b)在a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有a)中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2.一種核苷酸，其特征在于所述氨基酸用于編碼權利要求1所述的維生素C磷酸化酶。
3.如權利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸序列為SEQID N0:2。
4.一種用于表達權利要求1所述的維生素C磷酸化酶的重組表達質粒，其特征在于，所述的重組表達質粒是將序列為SEQ ID NO:2基因插入到原核表達載體pET20b_上構建的。
5.一種重組菌，其特征在于，所述的重組菌含有權利要求4中所述的重組表達質粒。
6.權利要求1中的維生素C磷酸化酶用于工業化生產維生素C-2磷酸酯。
【文檔編號】C12N9/12GK103952382SQ201410054752
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年2月17日 優先權日:2014年2月17日
【發明者】劉立明, 董曉翔 申請人:江南大學