高活力谷胱甘肽過氧化物酶gpx2突變體及其制備方法

高活力谷胱甘肽過氧化物酶gpx2突變體及其制備方法
【專利摘要】高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體及其制備方法，屬于生物【技術領域】。本發明以人GPX2為模板，通過計算機模擬和定點突變，得到一種新型的高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體，其由203個氨基酸組成，與人GPX2相比較，其不含有半胱氨酸，具有較高的GPX活力和更好的穩定性，其是將人GPX2中所有半胱氨酸突變成絲氨酸，但第40位仍然是硒代半胱氨酸（SeCys）。其是用基因工程技術在哺乳動物細胞株或營養缺陷型原核表達系統及其SPP低溫表達系統中直接表達具有高酶活性的GPX2突變體蛋白的方法。本方法不需化學修飾即可制備具有極高GPX活力的新型人工酶。本發明方法在生物制藥方面具有廣闊的應用前景。
【專利說明】高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體及其制備方法。
【背景技術】
[0002]含硒的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基團是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物體內，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)—起構成了機體抗氧化防御體系。GPX在該體系中發揮著重要的作用，它以底物GSH為還原劑，分解體內的過氧化氫和各類氫過氧化物，因而能清除體內活性氧(R0S)，防止脂質過氧化，治療由活性氧引起的各種疾病，如衰老、紫外線輻射、心腦血管疾病、白內障、腫瘤等。與其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，還能降解脂質過氧化物，防止細胞過氧化損傷，這種獨特的保護細胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然GPX的來源相當有限、穩定性差，致使它的人工產物及其模擬物的研究備受關注。
[0003]小分子模擬物主要有PZ51 (ebSelen)、AL3823A、BXT系列產品，它們的弱點是活力低，僅為天然GPX的千分之一左右。大分子的模擬物主要有抗體酶(中國專利94102481.4和96112628.0)和以谷胱甘肽硫轉移酶(GST)為蛋白模板制備的GPX模擬酶，其活力顯著高于小分子模擬物。顯然，以具有谷胱甘肽(GSH)結合部位的蛋白為模板制備的大分子GPX模擬酶收到了更好的效果，因此開發制備這些高活力的GPX模擬酶制備技術就成了學術界的研究熱點，對于分子生物學、生物工程學及醫學等領域具有廣闊的應用前景。迄今已成功開發的方法有:用化學法(中國專利94102481.4,96112628.0)或營養缺陷型原核表達系統(中國專利200810050556.6)在非GPX類模板蛋白中引入GPX的催化基團硒代半胱氨酸(SeCys)。
[0004]中國專利94102481.4,96112628.0,99104234.4,200810050556.6 公開的各類含
硒抗體酶的制備方法就是應用化學突變(修飾)法在抗體類模板蛋白中引入GPX的催化基團SeCys，有以下缺點:(I)在制備過程中，僅化學突變(修飾)這一步就會損失20_40%的酶蛋白，導致模擬酶產率顯著下降；(2)制備模擬酶的周期長，操作繁瑣，時間長；(3)在化學突變過程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，這些物質為有毒性的物質；(4)缺乏靶向性，對于大的蛋白分子而言，一次化學反應常在不同位點引入多個非特異性催化基團，因此化學突變引入催化基團無法達到基因突變法那樣的專一性。
[0005]中國專利200810050556.6也公開了人源單鏈含硒抗體酶的另一種制備方法，是用營養缺陷型原核表達系統(大腸桿菌)和基因突變法引入催化基團，但其僅限于人源單鏈含硒抗體酶的制備，不包括谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)突變體及其它GPX模擬酶的制備方法。具有GPX活性的谷胱甘肽硫轉移酶(GST)的制備方法(Yu，H.J.，Liu，J.Q.，Bock,A.，Li, J.，Luo, G.M.，and Shen, J.C.J.Biol.Chem.2005，280，11930-11935)亦見報道，這種方法雖然也采用營養缺陷型原核表達系統和基因突變法引入催化基團，但其僅限于以GST為模板蛋白制備GPX模擬酶，不包括以天然GPX為模板制備GPX突變體。用營養缺陷型原核表達系統在非GPX類模板蛋白中引入催化基團制備模擬酶的方法是將催化基團引入到與GPX有相同底物GSH結合部位的它種蛋白中使其產生GPX活力。
[0006]然而由于這些模板蛋白不具備天然GPX自身的催化基團，因此很難找到理想而準確的催化基團的位置；同時由于這些模板蛋白中也沒有象天然GPX那樣理想的催化三聯體，因此這類模擬酶的催化效率不高。如果以天然GPX為模板用基因工程方法來制備GPX突變體則可克服這些缺點。由于編碼GPX的催化基團SeCys的密碼子UGA是終止密碼子，在普通原核表達系統中，需在GPX基因的開放閱讀框內、緊鄰SeCys的密碼子UGA下游引入頸環結構才能將UGA翻譯成SeCys而不是終止密碼子，而開放閱讀框內頸環的引入必然會引起GPX空間構象的改變，進而影響酶活性。因此普通原核表達系統不適于直接表達具有GPX活性的含硒蛋白。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于提供一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體及其制備方法。
[0008]應用基因工程技術、細胞培養技術、營養缺陷型原核表達技術和SPP (Singleprotein production,單一蛋白生產)系統低溫表達技術制備具有極高GPX活力的GPX2突變體，是用基因工程技術在哺乳動物細胞株或營養缺陷型原核表達系統及其SPP低溫表達系統中直接表達具有高酶活性的GPX2突變體蛋白的方法。本方法不需化學修飾即可制備具有極高GPX活力的新型人工酶。本發明方法在生物制藥方面具有廣闊的應用前景。
[0009]本發明以人GPX2 (參見NCBI，NM_002083.3)為模板，通過計算機模擬和定點突變，得到一種新型的高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體，其由203個氨基酸組成，與人GPX2相比較，其不含有半胱氨酸，具有更高的GPX活力和更好的穩定性，其是將人GPX2中所有半胱氨酸突變成絲氨酸，但第40位仍然是硒代半胱氨酸(SeCys,單字母縮寫為U，序列表中寫成Xaa)。所述的GPX2突變體的氨基酸序列(SEQ ID No:1)如下所示:
[0010]MAFIAKSFYDLSAISLDGEKVDFNTFRGRAVLIENVASLUGTTTRDFTQLNELQSRFPRRLVVLGFPSNQFGHQENSQNEEILNSLKYVRPGGGYQPTFTLVQKSEVNGQNEHPVFAYLKDKLPYPYDDPFSLMTDPKLIIWSPVRRSDVAWNFEKFLIGPEGEPFRRYSRTFPTINIEPDIKRLLKVAI
[0011]進一步，所述的GPX2突變體的具體氨基酸序列還包括，將上述氨基酸序列中任何一個或多個丙氨酸(Ala)突變為絲氨酸(Ser)所形成的任何一個新型GPX2突變體。比如將117位丙氨酸(Ala)突變為絲氨酸(Ser)，所形成的序列為SEQ ID No:2 (實施例9)。
[0012]進一步，所述的GPX2突變體的具體氨基酸序列還包括，將上述氨基酸序列中第55、68、77、105位4個絲氨酸的任何一個或多個被丙氨酸取代后所形成的任何一個新型GPX2突變體。比如第77位絲氨酸被丙氨酸取代后所形成的序列SEQ ID No:3(實施例10)。
[0013]進一步，所述的GPX2突變體的具體氨基酸序列還包括，由于使用了便于靶蛋白純化的pColdl (TAKARA公司)等分泌型原核或真核表達載體而在上述氨基酸序列的氨基端或羧基端引入該分泌型原核或真核表達載體上的組氨酸純化標簽和其它的氨基酸等所形成的任何一個新型GPX2突變體。比如在序列SEQ ID No: 1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:3的氨基端引入pColdl (TAKARA公司)原核表達載體的組氨酸純化標簽和凝血因子Xa切割位點的氨基酸后所形成的序列SEQ ID No:4, SEQ ID No:5和SEQ ID No:6 (實施例11)。[0014]本發明的制備高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體的方法，具體包括如下方法:
[0015]方法1:
[0016]先合成靶基因并組裝到分泌型原核表達載體上或先將GPX2基因組裝到分泌型原核表達載體上，用基因突變(或氨基酸替換)法獲取靶基因，再通過營養缺陷型原核表達系統或通過營養缺陷型原核和SPP低溫聯合表達系統，將GPX的催化基團硒代半胱氨酸(SeCys)引入到GPX2突變體的底物結合部位，因而在該蛋白上既有GPX的底物結合部位，又有GPX的催化基團和催化三聯體，結果賦予其極高的GPX的活性，就產生了高活力的谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體。
[0017]方法2:
[0018]或先將編碼GPX2突變體的基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載 體上，再將硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2)組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上，將兩種載體共轉染同一哺乳類細胞株，然后用篩選得到的同時含有GPX2突變體和SBP2兩種基因的陽性細胞株制備GPX2突變體蛋白，就在體外產生了高活力的基因工程谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體，從而解決天然GPX來源有限的問題。
[0019]本發明的第一種方法是先在生物公司用DNA合成儀人工合成能夠表達本發明所述的GPX2突變體蛋白的基因，確保基因中不含ACA序列，再用單一蛋白生產系統和營養缺陷型原核表達系統聯合制備GPX2突變體蛋白。
[0020]I)、表達載體的構建:根據本發明所述GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養缺陷型菌株中表達GPX2突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的40位硒代半胱氨酸(SeCys)的編碼序列替換為半胱氨酸(Cys)的密碼子(可以是TGC等)，且基因全長不含有ACA序列；具體的基因序列可以是將GPX2基因(參見NCBI, NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，第40位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子，并根據密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將基因中所有的ACA序列全部替換為非ACA序列所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種能在營養缺陷型菌株中表達GPX2突變體蛋白，且全長不含有ACA序列的編碼基因(由于密碼子的簡并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX2突變體基因和分泌型原核表達載體(如PCold系列等)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而GPX2突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0021]2)、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化:
[0022]用步驟I)中構建的含有GPX2突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將含有表達核酸內切酶MazF的pMazF (TAKARA, Cat#3367)質粒轉化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養基篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經IPTG低溫4-25°C誘導表達，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得GPX2突變體蛋白純品。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定目標蛋白。
[0023]該方法通過低溫下誘導營養缺陷型原核表達系統在GPX2突變體的底物結合部位引入了催化基團，因而產生高活力的GPX2突變體。
[0024]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0025]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000-12000g離心15_30min。
[0026]本發明的第二種方法是先擴增GPX2基因，然后以其為模板，用基因突變法獲得能表達本發明所述的GPX2突變體蛋白的基因，并在保證其氨基酸序列不變的前提下突變掉基因中的ACA序列，獲得不含ACA的GPX2突變體基因，再用單一蛋白生產系統和營養缺陷型原核表達系統聯合制備GPX2突變體蛋白。
[0027]I)、表達載體的構建:
[0028]根據基因文庫中公開的GPX2的基因序列(參見NCBI，NM_002083.3)設計引物，擴增其編碼基因，在設計引物時，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點；用相同的限制性核酸內切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因組裝到分泌型原核表達載體上(如pCold系列等)；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為半胱氨酸的40位硒代半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點`突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在原核表達載體上的GPX2基因中的硒代半胱氨酸的編碼序列突變成半胱氨酸的密碼子；同理，用上述定點突變的方法在確保不引入ACA序列的前提下，將GPX2基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子，再根據密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將GPX2基因中所有ACA序列突變掉；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能在營養缺陷型菌株中表達本發明所述的GPX2突變體蛋白；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0029]2)陽性轉化子的篩選及突變體蛋白的表達與純化
[0030]用步驟I)中構建的含有GPX2突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含半胱氨酸的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將表達核酸內切酶MazF的質粒pMazF轉化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養基篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有硒代半胱氨酸、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β -D-半乳糖苷低溫4-25°C誘導表達，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用半胱氨酸的密碼子合成硒代半胱氨酸，直接表達出在底物谷胱甘肽的結合部位含有硒代半胱氨酸的重組GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得含GPX2突變體的上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0031]該方法通過低溫下誘導營養缺陷型原核表達系統聯合SPP單一蛋白生產系統在GPX2突變體的底物結合部位引入了催化基團，因而產生高活力的GPX2突變體蛋白。
[0032]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX2突變體，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0033]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000_12000g離心15_30min。
[0034]本發明的第三種方法是先在生物公司用DNA合成儀人工合成能夠表達本發明所述的GPX2突變體蛋白基因，再用營養缺陷型原核表達系統制備GPX2突變體蛋白。
[0035]I)、表達載體的構建:
[0036]根據本發明所述GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養缺陷型菌株中表達GPX2突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)，3,端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的40位硒代半胱氨酸(SeCys)的編碼序列替換為半胱氨酸(Cys)的密碼子(可以是TGC等);具體的基因序列可以是將GPX2基因(參見NCBI，NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，第40位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種能在營養缺陷型菌株中表達GPX2突變體蛋白的編碼基因(由于密碼子的簡并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX2突變體基因和分泌型原核表達載體(如pCold系列等)，再用DNA連接`酶通過特定的酶切位點將GPX2突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有而GPX2突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0037]2)、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化:
[0038]用步驟I)中構建的含有GPX2突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)誘導，營養缺陷型菌株_BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX2突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得GPX2突變體蛋白純品。
[0039]該方法通過基因突變和營養缺陷型原核表達系統在GPX2突變體的底物結合部位引入了催化基團，因而產生高活力的GPX2突變體蛋白。
[0040]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0041]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000-12000g離心15_30min。
[0042]本發明的第四種方法是先擴增GPX2基因，然后以其為模板，用基因突變法獲得能表達本發明所述的GPX2突變體蛋白的基因，再用營養缺陷型原核表達系統制備GPX2突變體蛋白。
[0043]I)、表達載體的構建:
[0044]根據基因文庫中公開的GPX2的基因序列(參見NCBI，NM_002083.3)設計引物，擴增其編碼基因，在設計引物時，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點；用相同的限制性核酸內切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因組裝到分泌型原核表達載體上(如pCold系列等);在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為半胱氨酸(Cys)的40位SeCys和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp ;用定點突變引物和快速定點突變試劑盒(InvitiOgen公司，按試劑盒說明書操作)，將構建在原核表達載體上的GPX2基因中的SeCys的編碼序列突變成Cys的密碼子(比如TGC);同理，用上述定點突變的方法將GPX2基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能在營養缺陷型菌株中表達本發明所述的GPX2突變體蛋白；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0045]2)、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化:
[0046]用步驟I)中構建的含有GPX2突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)誘導，營養缺陷型菌株_BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX2突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析`凍干后即得GPX2突變體蛋白純品。
[0047]該方法通過基因突變和營養缺陷型原核表達系統在GPX2突變體的底物結合部位引入了催化基團，因而產生高活力的GPX2突變體蛋白。
[0048]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0049]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000_12000g離心15_30min。
[0050]第五種方法:用合成的靶基因和哺乳細胞表達系統制備GPX2突變體蛋白
[0051]I)、表達載體的構建:
[0052]根據本發明所述的GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX2突變體的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_002083.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點；具體的基因序列可以是將GPX2基因(參見NCBI, NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種編碼GPX2突變體蛋白的基因(由于密碼子的簡并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)，但靶基因的3'端必須含有GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_002083.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS);用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX2突變體基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司),再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2突變體基因連同其3'端非翻譯區或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2，見NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點，用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0053]2)、陽性細胞株的篩選:
[0054]用含有SBP2和GPX2突變體基因的載體在轉染試劑的介導下共轉染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養板逐級放大培養陽性克隆，最終獲得同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPX2突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0055]3)、靶蛋白的表達與純化:
[0056]在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里，用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0057]所述的檢測GPX2突變體蛋白的表達量，可以用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測；
[0058]所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0059]本發明的第六種方法是分步用含有SBP2基因的載體和含有GPX2突變體基因的載體轉染同一哺乳類細胞。
[0060]I)、表達載體的構建:
[0061]根據本發明所述的GPX2突變體的氨基酸序列在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX2突變體的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_002083.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點；具體的基因序列可以是將GPX2基因(參見NCBI, NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種編碼GPX2突變體蛋白的基因(由于密碼子的簡并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)，但靶基因的3'端必須含有GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_002083.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS);用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX2突變體基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司),再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2突變體基因連同其3'端非翻譯區或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2，見NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點，用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0062]2)、陽性細胞株的篩選:
[0063]先用含有SBP2基因的載體轉染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩定表達SBP2的細胞株。再用含有GPX2突變體基因的載體轉染穩定表達SBP2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX2突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0064]3)、靶蛋白的表達與純化:
[0065]在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0066]在陽性細胞株的篩選中，所述的陽性細胞株的篩選，也可先轉染GPX2突變體基因，后轉染SBP2基因，再用兩個`載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株。所述的檢測GPX2突變體蛋白的表達量，可以用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測。
[0067]所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0068]第七種方法:用擴增的靶基因和哺乳細胞表達系統制備GPX2突變體蛋白
[0069]I)、表達載體的構建:
[0070]根據基因文庫中GPX2基因序列(參見NCBI, NM_002083.3)設計引物擴增GPX2的編碼基因及其3'端非翻譯區的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI, NM_002083.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因連同其3'端非翻譯區組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為絲氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在真核表達載體上的GPX2基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能編碼本發明所述的GPX2突變體蛋白。根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2，見NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512個氨基酸的基因序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，端含有終止密碼子和特定的酶切位點；同樣經酶切連接后用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0071]2)、陽性細胞株的篩選:
[0072]用含有SBP2和GPX2突變體基因的載體在轉染試劑的介導下共轉染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養板逐級放大培養陽性克隆，最終獲得同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋 白的陽性細胞株；檢測GPX2突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0073]3)、靶蛋白的表達與純化:
[0074]在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX2 突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里，用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0075]所述的檢測GPX2突變體蛋白的表達量，可以用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測；
[0076]所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5，50mmoI/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0077]本發明的第八種方法是分步用含有SBP2基因的載體和含有GPX2突變體基因的載體轉染同一哺乳類細胞。
[0078]I)、表達載體的構建:
[0079]根據基因文庫中GPX2基因序列(參見NCBI, NM_002083.3)設計引物擴增GPX2的編碼基因及其3'端非翻譯區的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI, NM_002083.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因連同其3'端非翻譯區組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為絲氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在真核表達載體上的GPX2基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能夠編碼本發明所述的GPX2突變體蛋白。根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2，見NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512個氨基酸的基因序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，端含有終止密碼子和特定的酶切位點；同樣經酶切連接后用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0080]2)、陽性細胞株的篩選:[0081]先用含有SBP2基因的載體轉染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩定表達SBP2的細胞株；再用含有GPX2突變體基因的載體轉染穩定表達SBP2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX2突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0082]3)、靶蛋白的表達與純化:
[0083]在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0084]在陽性細胞株的篩選中，所述的陽性細胞株的篩選，也可先轉染GPX2突變體基因，后轉染SBP2基因，再用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株。所述的檢測GPX2突變體蛋白的表達量，可以用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測。
[0085]所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體，是用ρΗ7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0086]本發明的第九種方法與第一種方法完全相同，只是合成GPX2突變體的編碼基因時將第117位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，最后獲得的GPX2突變體蛋白的第117位是絲氨酸(SEQ ID No:2)，而不是丙氨酸，其它步驟與第一種方法完全相同。
[0087]本發明的第十種方法與第一種方法完全相同，只是合成GPX2突變體的編碼基因時將第77位絲氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子，最后獲得的GPX2突變體蛋白的第77位是丙氨酸(SEQ ID No:3)，而不是絲氨酸，其它步驟與第一種方法完全相同。
[0088]本發明的第十一種方法與第一種方法完全相同，只是由于使用了便于靶蛋白純化的pColdl (TAKARA公司)等分泌型原核或真核表達載體而在靶蛋白的氨基端或羧基端引入該載體上的組氨酸純化標簽和其它的氨基酸等所形成的任何一個新型GPX2突變體。比如在序列 SEQ ID No: K SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 的氨基端引入 pColdl (TAKARA 公司)原核表達載體的組氨酸純化標簽和凝血因子Xa切割位點的氨基酸后所形成的序列SEQ IDNo:4, SEQ ID No:5, SEQ ID No:6。本發明具有以下特點:
[0089]⑴本發明使用簡單的基因合成或擴增、基因突變和表達等基因工程技術，制備方法簡單。
[0090]⑵本發明方法制備的GPX2突變體蛋白活力高，已達到天然GPX活力的同一個數量級，細胞生物學實驗已證實對過氧化氫損傷的心肌細胞有更強的保護作用。
[0091]⑶本發明所述的GPX2突變體蛋白具有超強的穩定性，不易失活，這一特性彌補了天然GPX的缺陷。
[0092]⑷本發明使用的分泌型表達載體，能將GPX2突變體蛋白以可溶性形式表達并分泌到大腸桿菌的周質腔或哺乳類細胞的體外，引導蛋白分泌表達的前導信號肽由菌體或細胞自動切除，所表達的蛋白為可溶性，具有天然蛋白的空間構象和更高的活性，不需復性，可避免包涵體復性過程造成的產率下降和失活，因而生產周期短。
[0093](5)本發明使用的SPP低溫表達系統能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無ACA序列的蛋白質，因此新合成的蛋白主要是外源蛋白，從而提高產率和Cys向SeCys的轉化率，因此具有活力高、產率高的雙重優勢。
[0094](6)本發明所用的真核表達直接使用GPX自身的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)，不需另外引入SECIS進入表達載體，因而操作簡單且可用常規真核表達載體實施。
[0095]這些優點均有利于大規模生產，為今后的實際應用打下了堅實的基礎，解決了天然GPX來源不足、性質不穩定和活力低的問題，在生物制藥方面有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0096]圖1:純化得到的GPX2突變體蛋白的SDS-PAGE (上)和Western blot (下)結果:其中M是蛋白分子量Marker，1-11泳道是實施例1~11制備的靶蛋白。
【具體實施方式】
[0097]實施例1:用合成 的基因聯合SPP和營養缺陷型原核表達系統制備基因工程人GPX2突變體蛋白
[0098]根據本發明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養缺陷型菌株中表達序列I (SEQ ID No:1)所述的GPX2突變體蛋白的基因，確保GPX2突變體基因的5/端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，
端含有終止密碼子和Hind III酶切位點，GPX2突變體基因的第40號SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC)，且基因全長不含有ACA序列；具體的靶基因序列是將GPX2基因(參見NCBI, NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的密碼子替換為絲氨酸的編碼序列(依次是:AGC、AGC、AGT、AGT)，第40位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的編碼序列(TGC)，再根據密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將GPX2基因中所有ACA序列突變掉，獲得無ACA序列的GPX2突變體基因，確保該基因能編碼本發明序列I(SEQ ID No:1)所述的GPX2突變體蛋白，且靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點；用限制性核酸內切酶Nde I和HindIII雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold III (TAKARA，Cat.#3369)載體上。
[0099]用裝有GPX2突變體基因的載體(pCold II1-GPX2突)轉化營養缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株。再將表達核酸內切酶MazF的質粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)轉化到該陽性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mL Kana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養基中篩選陽性轉化子。將陽性轉化子接種于1.2L M9缺陷表達培養基(在M9培養基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50yg/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續振蕩培養45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。用0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清，重復該步驟。然后用生產培養基(在M9培養基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養16-72h，使GPX2突變體蛋白以可溶性形式表達在菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達。收集菌體(6000rpm，IOmin)并用等體積的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPX2突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為20.9kDa，且與抗GPX2抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第I泳道。其GPX活力為2636U/μ mo I，達到天然GPX同一個數量級。 [0100]本實施例使用的SPP低溫表達系統能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無ACA序列的蛋白質，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產率和Cys向SeCys的轉化率，因此具有高活高產雙重優勢。
[0101]實施例2:用基因擴增及突變法和SPP聯合營養缺陷型原核表達系統制備基因工程人GPX2突變體蛋白
[0102]用mRNA 小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN_10)從人 H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取mRNA，在逆轉錄酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈反應)將其轉錄成cDNA。根據基因文庫中公開的人GPX2的基因(參見NCBI，NM_002083.3)序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5 '端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點；具體的 5 '端引物是 5 ’ -GGAATTC CATATGGCTTTCATTGCCAAGTCCT-3，，3 '端引物是 5 ’ -CGGAAGCTTCTATATGGCAACTTTAAGGAGG-3’。用限制性核酸內切酶 Nde I 和 Hind III 雙酶切后，用DNA連接酶連接到同樣酶切的pCold III (TAKARA，Cat.#3369)載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據49號SeCys比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，引物長25-50bp，以40號SeCys的密碼子(TGA)為中心，正義引物的序列是5’-GAATGTGGCTTCGCTCTGCGGCACGACCACCCGGGAC-3’。用這兩條完全互補的引物和快速定點突變試劑盒(Invitrogen公司，按試劑盒說明書操作),將構建在原核表達載體pCold III上的GPX2基因的第40號SeCys的編碼序列TGA突變成Cys的密碼子(TGC)，通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生。用同樣方法將人GPX2基因中其它所有Cys的密碼子突變成Ser的密碼子；對應的正義引物分別是:C55S 5 ’ _GCTCAACGAGCTGCAAT￡CCGCTTTCCCAGGCGCCTG-3，， C68S 5，-GTGGTCCTTGGCTTCCCTTCCAACCAATTTGGCCATCAGGAG-3，,C77S 5’-CAGGAGAACT￡TCAGAATGAGGAGATCCTGAA:￡AGTCTCAAGTATG-3’，C105S 5’-CTTCACCCTTGTCCAAAAAT￡TGAGGTGAATGGGCAGAAC-3’。最后在保持GPX2突變體氨基酸序列不變的前提下突變掉基因中所有ACA序列，即將第363、507、531和543號堿基C全部突變為T，共用3條引物，其正義序列分別是 5’-GTCTTCGCCTACCTGAAGGAIAAGCTCCCCTACCCTTATGATG-3’，5’-GGAGAGCCCTTCCGACGCTAJ；AGCCGCACCTTCCCAACC-3’，5’ -CCTTCCCAACCATCAATATTGAGCCTGA1ATCAAGCGCCTCC-3’;通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能編碼本發明序列I (Seql)所述的GPX2突變體蛋白。
[0103]用裝有GPX2突變體基因的載體(pCold II1-GPX2突)轉化營養缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株。再將表達核酸內切酶MazF的質粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)轉化到該陽性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mLAmp >25 μ g/mL Kana和25μ g/mL的M9-CAA固體培養基中篩選陽性轉化子。將陽性轉化子接種于1.2L M9缺陷表達培養基(在M9培養基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續振蕩培養45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清，重復該步驟。然后用生產培養基(在M9培養基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養16-72h，使GPX2突變體蛋白以可溶性形式表達在菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達。收集菌體(6000rpm，IOmin)并用等體積的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPX2突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為20.9kDa，且與抗GPX2抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第2泳道。其GPX活力為2360U/μ mo I，達到天然GPX同一個數量級。
[0104]本實施例使用的SPP低溫表達系統能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無ACA序列的蛋白質，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產率和Cys向SeCys的轉化率，因此具有高活高產雙重優勢。
[0105]實施例3:用合成的基因和營養缺陷型原核表達系統制備基因工程人GPX2突變體蛋白
[0106]根據本發明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養缺陷型菌株中表達序列I (SEQ ID No:1)所述的GPX2突變體蛋白的基因，確保GPX2突變體基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind 111酶切位點，GPX2突變體基因的第49號SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC);具體的靶基因序列是將GPX2基因(參見NCBI, NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的密碼子替換為絲氨酸的編碼序列(依次是:AGT、AGC、AGC、AGT、AGT)，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的編碼序列(TGC)所得到的能編碼本發明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPX2突變體蛋白的基因，且靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點；用限制性核酸內切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold 11K TAKARA, Cat.#3369)
載體上。
[0107]用裝有GPX2突變體基因的載體(pCold II1-GPX2突)轉化營養缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子。將陽性轉化子接種于1.2L M9缺陷表達培養基(在M9培養基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.1，培養至0D600約為0.3-1，加入終濃度0.1-1mM的IPTG，IOmin后加入終濃度10 μ g/ml的氯霉素。加入氯霉素五分鐘后培養液離心，低溫6000rpm離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩次，每次用1.2L，然后用生產培養基(在M9培養基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸，并向培養基中補充終濃度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。繼續培養2_12h，使GPX2以可溶性形式表達在菌體的周質腔里。收集菌體(6000rpm，10min)并用等體積的bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPX2突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為20.9kDa，且與抗GPX2抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第3泳道。其GPX活力為512U/ μ mo I，達到天然GPX的數量級水平。
[0108]營養缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3) Cys來源于題目為“Structure of theCathelicidin Motif of Protegrin~3Precursor: Structural Insights into theActivation Mechanism of an Antimicrobial Protein”的文章，2002年發表在Structure第10卷，1363 - 1370頁。該菌種的獲取可以由文章作者或August Bock教授贈予。
[0109]實施例4:用基因擴增及突`變法和營養缺陷型原核表達系統制備基因工程人GPX2突變體蛋白
[0110]用mRNA 小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN_10)從人 H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取mRNA，在逆轉錄酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈反應)將其轉錄成cDNA。根據基因文庫中公開的人GPX2的基因(參見NCBI，NM_002083.3)序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5 '端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點；具體的 5 '端引物是 5 ’ -GGAATTC CATATGGCTTTCATTGCCAAGTCCT-3，，3 '端引物是 5 ’ -CGGAAGCTTCTATATGGCAACTTTAAGGAGG-3’。用限制性核酸內切酶 Nde I 和 Hind III 雙酶切后，用DNA連接酶連接到同樣酶切的pCold III (TAKARA，Cat.#3369)載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據40號SeCys比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，引物長25-50bp，以40號SeCys的密碼子(TGA)為中心。用這兩條完全互補的引物和快速定點突變試劑盒(Invitrogen公司，按試劑盒說明書操作),將構建在原核表達載體pCold III上的GPX2基因的第40號SeCys的編碼序列TGA突變成Cys的密碼子(TGC)，通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，用同樣方法將人GPX2基因中其它所有Cys的編碼序列突變成Ser的密碼子，將117位Ala的編碼序列突變為Ser的密碼子(TCC)，對應的正義引物分別是:C55S 5’ -GCTCAACGAGCTGCAATCCCGCTTTCCCAGGCGCCTG-3’，C68S 5’-GTGGTCCTTGGCTTCCCTT￡CAACCAATTTGGCCATCAGGAG-3’，C77S 5’-CAGGAGAACTCTCAGAATGAGGAGATCCTGM1AGTCTCAAGTATG-3，，C105S 5，-CTTCACCCTTGTCCAAAAATCTGAGGTGAATGGGCAGAAC-3，和 Al 17S5，-GAACGAGCATCCTGTCTTCTCCTACCTGAAGGATAAG-3，。通過 DNA 測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能編碼本發明序列2(SEQID No:2)所述的GPX2突變體蛋白。
[0111]用裝有GPX2突變體基因的載體(pCold II1-GPX2突)轉化營養缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子。將陽性轉化子接種于1.2L M9缺陷表達培養基(在M9培養基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.1，培養至0D600約為0.3-1，加入終濃度0.1-1mM的IPTG，IOmin后加入終濃度10 μ g/ml的氯霉素。加入氯霉素五分鐘后培養液離心，低溫6000rpm離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩次，每次用 1.2L，然后用生產培養基(在M9培養基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸，并向培養基中補充終濃度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。繼續培養2_12h，使GPX2以可溶性形式表達在菌體的周質腔里。收集菌體(6000rpm，10min)并用等體積的bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPX2突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為20.9kDa，且與抗GPX2抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第4泳道。其GPX活力為507U/ μ mo I，達到天然GPX的數量級水平。(本方法也可用于制備87位Ala不突變為絲氨酸即具有序列I (SEQ ID No:l)的氨基酸序列的GPX2突變體，具體方法除省去將87位Ala的編碼序列突變為Ser的密碼子這一步外，其它與本法完全相同。)
[0112]實施例5:用合成的基因和哺乳細胞表達系統一步轉染制備人GPX2突變體蛋白
[0113]1.人GPX2突變體蛋白表達載體的構建:根據本發明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPX2突變體的氨基酸序列在生物試劑公司用DNA合成儀人工合成GPX2突變體基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點，3'端在人GPX2突變體基因終止密碼子下游GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_002083.3)，并在GPX2基因的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入BamHI酶切位點；具體的靶基因序列是將GPX2基因(參見NCBI, NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的密碼子替換為絲氨酸的編碼序列(依次是46(:、46(:、461\461')所得到的能編碼本發明序列1 (SEQ ID No:1)所述的GPX2突變體蛋白的基因，且靶基因的3'端含有GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI, NM_002083.3)，并在GPX2基因的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入BamHI酶切位點。用先酶切后連接的方法，通過Hind III/BamHI酶切位點將GPX2突變體基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理根據基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2，NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點。用先酶切后連接的方法，通過Xbal/EcoRI酶切位點將SBP2的羧基端(343_854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內型哺乳類細胞表達載體pcDNA3.1/myc-His A(Invitrogen公司)上。
[0114]2.人GPX2突變體基因陽性細胞株的篩選:當細胞生長到IXlO6Ail的密度時，用含有SBP2和GPX2突變體基因的表達載體在Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen，按說明書使用)介導下共轉染293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉染后72小時將細胞轉入培養皿中開始貼壁培養，貼壁培養48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養液，篩選具有兩種抗性即同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418和Zeocin濃度分別從800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步遞減,每次分別減200 μ g/ml和100 μ g/ml，每個濃度使用5天，2-3天換一次培養液，篩選培養20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養板逐級放大培養。用抗GPX2多克隆抗體和ELISA技術檢測GPX2突變體蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養和凍存。
[0115]3.人GPX2突變體蛋白的表達與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養基中擴培養2中篩選獲得的同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPX2突變體蛋白以可溶性形式表達并分泌于培養基中，每48小時收集一次培養液。培養液經IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPX2突變體蛋白，收集含有GPX4的洗脫液，透析除去小分子物質，凍干即得人GPX2突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為20.9kDa，且與抗GPX2抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第5泳道。其GPX活力為2653υ/μπι01，達到天然GPX同一個數量級。
[0116]實施例6:用合成的基因和哺乳細胞表達系統分步轉染制備人GPX2突變體蛋白
[0117]1.人GPX2突變體蛋白表達載體的構建:根據本發明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPX2突變體的氨基酸序列在生物試劑公司用DNA合成儀人工合成GPX2突變體基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點，3'端在人GPX2突變體基因終止密碼子下游GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，ΝΜ_002083.3)，并在GPX2基因的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入BamHI酶切位點；具體的靶基因序列是將GPX2基因(參見NCBI, ΝΜ_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的密碼子替換為絲氨酸的編碼序列(依次是46(:、46(:、461\461')所得到的能編碼本發明序列1 (SEQ ID Νο:1)所述的GPX2突變體蛋白的基因，且靶基因的3'端含有GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI, ΝΜ_002083.3)，并在GPX2基因的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入BamHI酶切位點。用先酶切后連接的方法，通過Hind III/BamHI酶切位點將GPX2突變體基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理根據基因文庫中人硒代半胱 氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2，NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點。用先酶切后連接的方法，通過Xbal/EcoRI酶切位點將SBP2的羧基端(343_854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內型哺乳類細胞表達載體pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen公司)上。
[0118]2.人GPX2突變體基因陽性細胞株的篩選:當細胞生長到lX106/ml的密度時，用含有SBP2基因的表達載體在Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉染293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉染后72小時將細胞轉入培養皿中開始貼壁培養，貼壁培養48 (通常2-50)小時后換含有G418的培養液，篩選具有G418抗性即穩定表達SBP2的陽性細胞克隆，期間G418濃度從800 μ g/ml逐步遞減到200 μ g/ml，每次減200 μ g/ml，每個濃度使用5天，2-3天換一次培養液，篩選培養20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養板逐級放大培養。再用含有GPX2突變體基因的表達載體在lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉染穩定表達SBP2的293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉染后72小時將細胞轉入培養皿中開始貼壁培養，貼壁培養48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養液篩選具有兩種抗性即同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418濃度維持在200 μ g/ml,Zeocin濃度從400 μ g/ml逐步遞減到100 μ g/ml,每次減100 μ g/ml,每個濃度使用5天，2-3天換一次培養液，篩選培養20天后將具有兩種抗性的陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養板逐級放大培養。用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA技術檢測GPX2突變體蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養和凍存。
[0119]上述方法也可以先轉染GPX2突變體基因，后轉染SBP2基因。
[0120]3.人GPX2突變體的表達與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養基中擴培養2中篩選獲得的同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293F細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPX2突變體以可溶性形式表達并分泌于培養基中，每48小時收`集一次培養液。培養液經IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPX2突變體，收集含有GPX2突變體的洗脫液，透析除去小分子物質，凍干即得人GPX2突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為20.9kDa，且與抗GPX2抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第6泳道。其GPX活力為2538υ/μπι01，達到天然GPX同一個數量級。
[0121]實施例7:用擴增的靶基因和和哺乳細胞表達系統一步轉染制備人GPX2突變體蛋白
[0122]1.人GPX2突變體蛋白表達載體的構建:用mRNA小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN-10)從人H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取mRNA，在逆轉錄酶(AMVRT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈反應)將其轉錄成cDNA。根據基因文庫中公開的人GPX2的基因序列(參見NCBI，NM_002083.3)設計引物擴增GPX2的編碼基因及其3'端非翻譯區的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的
端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_002083.3)和EcoRI酶切位點；用相同的限性核酸內切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因連同其3'端非翻譯區組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；具體的5'端引物是5’-CCC AAG CTT CAT CAT CATCAT CAT CAT ATG GCT TTC ATT GCC-3，，3'端引物是 5，-CG GAA TTC GGT CTC TTC TAGCAG AGT G-3’。用先酶切后連接的方法，通過Hind III/EcoRI酶切位點將GPX2基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為絲氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在原核表達載體上的人GPX2基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；具體的正義引物分別是:C55S 5，-GCTCAACGAGCTGCAAT￡CCGCTTTCCCAGGCGCCTG-3，，C68S 5，-GTGGTCCTTGGCTTCCCTTCCMCCAATTTGGCCATCAGGAG-3，, C77S 5，-CAGGAGAACTCTCAGAATGAGGAGATCCTGMTAGTCTCAAGTATG-3，，C105S 5，-CTTCACCCTTGTCCAAAAATCTGAGGTGAATGGGCAGAAC-3，;通過 DNA 測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能編碼本發明序列1(SEQID No:1)所述的GPX2突變體蛋白。根據基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2(SBP2,NCBI,NM_024077.3)羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列，設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點；具體的Y端引物是5 ’ -GCTCTAGAATGGAAGCTTTATCTTC-3 ’，3 ^端引物是5’-CGGAATTCTAAATTCAAATTC-3’。用先酶切后連接的方法，通過Xbal/EcoRI酶切位點將SBP2的羧基端(343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內型哺乳類細胞表達載體pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen 公司)上。 [0123]2.人GPX2突變體基因陽性細胞株的篩選:當細胞生長到lX106/ml的密度時，用含有SBP2和GPX2突變體基因的表達載體在Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen，按說明書使用)介導下共轉染293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉染后72小時將細胞轉入培養皿中開始貼壁培養，貼壁培養48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養液，篩選具有兩種抗性即同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418和Zeocin濃度分別從800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步遞減,每次分別減200 μ g/ml和100 μ g/ml，每個濃度使用5天，2-3天換一次培養液，篩選培養20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養板逐級放大培養。用抗GPX2多克隆抗體和ELISA技術檢測GPX2突變體蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養和凍存。
[0124]3.人GPX2突變體蛋白的表達與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養基中擴培養2中篩選獲得的同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPX2突變體蛋白以可溶性形式表達并分泌于培養基中，每48小時收集一次培養液。培養液經IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPX2突變體蛋白，收集含有GPX4的洗脫液，透析除去小分子物質，凍干即得人GPX2突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為20.9kDa，且與抗GPX2抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第7泳道。其GPX活力為263?υ/μπι01，達到天然GPX同一個數量級。
[0125]實施例8:用擴增的靶基因和和哺乳細胞表達系統分步轉染制備人GPX2突變體蛋白
[0126]1.人GPX2突變體蛋白表達載體的構建:用mRNA小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN-10)從人H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取mRNA，在逆轉錄酶(AMVRT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈反應)將其轉錄成cDNA。根據基因文庫中公開的人GPX2的基因序列(參見NCBI，NM_002083.3)設計引物擴增GPX2的編碼基因及其3'端非翻譯區的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的
端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列(從GPX2基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_002083.3)和EcoRI酶切位點；用相同的限性核酸內切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因連同其3'端非翻譯區組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；具體的5'端引物是5’-CCC AAG CTT CAT CAT CATCAT CAT CAT ATG GCT TTC ATT GCC-3，，3'端引物是 5，-CG GAA TTC GGT CTC TTC TAGCAG AGT G-3’。用先酶切后連接的方法，通過Hind III/EcoRI酶切位點將GPX2基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為絲氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在原核表達載體上的人GPX2基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；具體的正義引物分別是:C55S 5，-GCTCAACGAGCTGCAATgXGCTTTCCCAGGCGCCTG-3，，C68S 5，-GTGGTCCTTGGCTTCCCTTCCAACCAATTTGGCCATCAGGAG-3 ' C77S 5 ’-CAGGAGAACTCTCAGAATGAGGAGATCCTGAATAGTCTCAAGTATG-3，，C105S 5，-CTTCACCCTTGTCCAAAAATCTGAGGTGAATGGGCAGAAC-3，;通過 DNA 測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能編碼本發明序列1(SEQID No:1)所述的GPX2突變體蛋白。根據基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2(SBP2,NCBI,NM_024077.3)羧基`端343-854位的512個氨基酸的基因序列，設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點；具體的Y端引物是5 ’ -GCTCTAGAATGGAAGCTTTATCTTC-3 ’，3 ^端引物是5’-CGGAATTCTAAATTCAAATTC-3’。用先酶切后連接的方法，通過Xbal/EcoRI酶切位點將SBP2的羧基端(343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內型哺乳類細胞表達載體pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen 公司)上。
[0127]2.人GPX2突變體基因陽性細胞株的篩選:當細胞生長到lX106/ml的密度時，用含有SBP2基因的表達載體在Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉染293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉染后72小時將細胞轉入培養皿中開始貼壁培養，貼壁培養48 (通常2-50)小時后換含有G418的培養液，篩選具有G418抗性即穩定表達SBP2的陽性細胞克隆，期間G418濃度從800 μ g/ml逐步遞減到200 μ g/ml，每次減200 μ g/ml，每個濃度使用5天，2-3天換一次培養液，篩選培養20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養板逐級放大培養。再用含有GPX2突變體基因的表達載體在Iipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉染穩定表達SBP2的293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉染后72小時將細胞轉入培養皿中開始貼壁培養，貼壁培養48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養液篩選具有兩種抗性即同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418濃度維持在200 μ g/ml,Zeocin濃度從400 μ g/ml逐步遞減到100 μ g/ml,每次減100 μ g/ml,每個濃度使用5天，2-3天換一次培養液，篩選培養20天后將具有兩種抗性的陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養板逐級放大培養。用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA技術檢測GPX2突變體蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養和凍存。
[0128]上述方法也可以先轉染GPX2突變體基因，后轉染SBP2基因。
[0129]3.人GPX2突變體的表達與純化:在大容量含有1_10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養基中擴培養2中篩選獲得的同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293F細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPX2突變體以可溶性形式表達并分泌于培養基中，每48小時收集一次培養液。培養液經IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPX2突變體，收集含有GPX2突變體的洗脫液，透析除去小分子物質，凍干即得人GPX2突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為20.9kDa，且與抗GPX2抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第8泳道。其GPX活力為2533υ/μπι01，達到天然GPX同一個數量級。
[0130]實施例9:
[0131]與實施例1制備方法完全相同，只是合成GPX2突變體的編碼基因時將第117位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPX2突變體蛋白的第117位是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列與第一種方法完全相同，即本發明序列2 (SEQ IDNo:2)所述的GPX2突變體蛋白。該突變體分子量僅有微小的變化，在SDS-PAGE和WesternBlot結果上沒有區別，見圖1的`第9泳道。但其GPX活力為2417υ/μπι01，略高于實施例1，達到天然GPX同一個數量級。
[0132]實施例10:
[0133]與實施例1制備方法完全相同，只是合成GPX2突變體的編碼基因時將第77位絲氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子，最后獲得的GPX2突變體蛋白的第77位是丙氨酸，而不是絲氨酸，其它氨基酸序列與第一種方法完全相同，即本發明序列3 (SEQ ID Νο:3)所述的GPX2突變體蛋白。該突變體分子量僅有微小的變化，在SDS-PAGE和Western Blot結果上沒有區別，見圖1的第10泳道。但其GPX活力為2695U/ym0l，高于實施例1，達到天然GPX同一個數量級。
[0134]實施例11:
[0135]除將實施例1所用的表達載體pCold III (TAKARA，Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標簽的PCold I (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實施例1完全相同，即最終將獲得本發明序列4 (SEQ ID No:4)所述的GPX2突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個組氨酸在內的16個外源氨基酸，因此分子量有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot結果上可以看到，見圖1的第11泳道，其優點是也可以用鎳親和層系純化靶蛋白。其GPX活力為2336U/ym0l，略低于實施例1，證明純化標簽對蛋白的活力沒有明顯影響，活力達到天然GPX同一個 數量級。
【權利要求】
1.一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.如權利要求1所述的一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體，其特征在于:將SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中任何一個或多個的丙氨酸Ala突變為絲氨酸Ser所形成的谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體。
3.如權利要求2所述的一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體，其特征在于:所形成的突變體的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
4.如權利要求1所述的一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體，其特征在于:SEQID如:1所示的氨基酸序列中第55、68、77、105位4個絲氨酸的任何一個或多個被丙氨酸取代后所形成的谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體。
5.如權利要求4所述的一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體，其特征在于:所形成的突變體的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。
6.一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體，其氨基酸序列如SEQ ID No:4、SEQID No:5 或 SEQ ID No:6 所示。
7.權利要求1所述的高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體的制備方法，其步驟如下: 1)、表達載體的構建:根據本發明所述GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養缺陷型菌株中表達GPX2突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子ATG， 3，端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的40位硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，第40位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子，并根據密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將基因中所有的ACA序列全部替換為非ACA序列所得到的編碼基因；或其它任何一種能在營養缺陷型菌株中表達GPX2突變體蛋白，且全長不含有ACA序列的編碼基因；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX2突變體基因和分泌型原核表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點是表達載體的多克隆位點中含有的而GPX2突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化: 用步驟I)中構建的含有GPX2突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將含有表達核酸內切酶MazF的pMazF質粒轉化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養基篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經IPTG低溫4_25°C誘導表達，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得GPX2突變體蛋白純品； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 所述的將液體低溫離心，是在4°C，8000-12000g離心15_30min ； 或， 1)、表達載體的構建: 根據基因文庫中公開的GPX2的基因序列設計引物，擴增其編碼基因，在設計引物時，確保基因的5'端含有起始密碼子ATG，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點；用相同的限制性核酸內切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因組裝到分泌型原核表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為半胱氨酸的40位硒代半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在原核表達載體上的GPX2基因中的硒代半胱氨酸的編碼序列突變成半胱氨酸的密碼子；同理，用上述定點突變的方法在確保不引入ACA序列的前提下，將GPX2基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子，再根據密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將GPX2基因中所有ACA序列突變掉；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能在營養缺陷型菌株中表達本發明所述的GPX2突變體蛋白；所述的特定的酶切位點是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的喊基組成的DNA序列； 2)、陽性轉化子的篩選及突變體蛋白的表達與純化 用步驟I)中構建的含有GPX2突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含半胱氨酸的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將表達核酸內切酶MazF的質粒pMazF轉化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養基篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有硒代半胱氨酸、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β -D-半乳糖苷低溫4-25°C誘導表達，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用半胱氨酸的密碼子合成硒代半胱氨酸，直接表達出在底物谷胱甘肽的結合部位含有硒代半胱氨酸的重組GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里,而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得含GPX2突變體的上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX，透析凍干后即得酶蛋白純； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 所述的將液體低溫離心，是在4°C，8000-12000g離心15_30min ； 或 I)、表達載體的構建: 根據本發明所述GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養缺陷型菌株中表達GPX2突變體蛋白的基因，確保靶基因的5/端含有起始密碼子ATG，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的40位硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子；具體的基因序列是將GPX2基因中第55、.68,77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，第40位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子所得到的編碼基因；或是其它任何一種能在營養缺陷型菌株中表達GPX2突變體蛋白的編碼基因；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX2突變體基因和分泌型原核表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點是表達載體的多克隆位點中含有而GPX2突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化: 用步驟I)中構建的含有GPX2突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG誘導，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX2突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗漆、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得GPX2突變體蛋白純品； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 所述的將液體低溫離心，是在4°C，8000-12000g離心15_30min ； 或 1)、表達載體的構建: 根據基因文庫中公開的GPX2的基因序列設計引物，擴增其編碼基因，在設計引物時，確保基因的5'端含有起始密碼子ATG，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點；用相同的限制性核酸內切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因組裝到分泌型原核表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為半胱氨酸Cys的40位SeCys和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp ;用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在原核表達載體上的GPX2基因中的SeCys的編碼序列突變成Cys的密碼子；同理，用上述定點突變的方法將GPX2基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能在營養缺陷型菌株中表達本發明所述的GPX2突變體蛋白；所述的特定的酶切位點是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化: 用步驟I)中構建的含有GPX2突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β -D-半乳糖苷IPTG誘導，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX2突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗漆、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得GPX2突變體蛋白純品； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 所述的將液體低溫離心，是在4°C，8000-12000g離心15_30min ； 或 1)、表達載體的構建: 根據本發明所述的GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX2突變體的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點；具體的基因序列是將GPX2基因中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子所得到的編碼基因，或是其它任何一種編碼GPX2突變體蛋白的基因，但靶基因的3'端必須含有GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS ;用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX2突變體基因和哺乳類細 胞表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2突變體基因連同其3'端非翻譯區或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點，用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的特定的酶切位點是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽性細胞株的篩選: 用含有SBP2和GPX2突變體基因的載體在轉染試劑的介導下共轉染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養板逐級放大培養陽性克隆，最終獲得同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPX2突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株； 3)、靶蛋白的表達與純化: 在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里，用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品； 所述的檢測GPX2突變體蛋白的表達量，是以用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 或 I)、表達載體的構建:根據本發明所述的GPX2突變體的氨基酸序列在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX2突變體的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點；具體的基因序列是將GPX2基因中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子所得到的編碼基因，或是其它任何一種編碼GPX2突變體蛋白的基因或硒代半胱氨酸插入序列SECIS ;用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX2突變體基因和哺乳類細胞表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2突變體基因連同其3'端非翻譯區或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2羧基端的343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3/端含有終止密碼子和特定的酶切位點，用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的特定的酶切位點是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽性細胞株的篩選: 先用含有SBP2基因的載體轉染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩定表達SBP2的細胞株；再用含有GPX2突變體基因的載體轉染穩定表達SBP2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX2突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株； 3)、靶蛋白的表達與純化: 在搖瓶中將同時表達兩 種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品； 所述的檢測GPX2突變體蛋白的表達量，是用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測； 所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 或 I)、表達載體的構建: 根據基因文庫中GPX2基因序列設計引物擴增GPX2的編碼基因及其3'端非翻譯區的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因連同其3'端非翻譯區組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為絲氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在真核表達載體上的GPX2基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能編碼本發明所述的GPX2突變體蛋白；根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2羧基端的343-854位的512個氨基酸的基因序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點；同樣經酶切連接后用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的特定的酶切位點是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽性細胞株的篩選: 用含有SBP2和GPX2突變體基因的載體在轉染試劑的介導下共轉染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養板逐級放大培養陽性克隆，最終獲得同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPX2突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株； 3)、靶蛋白的表達與純化: 在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里，用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白 ，透析凍干后即得酶蛋白純品； 所述的檢測GPX2突變體蛋白的表達量，是用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 或 I)、表達載體的構建: 根據基因文庫中GPX2基因序列設計引物擴增GPX2的編碼基因及其3'端非翻譯區的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的5/端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3'端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX2基因連同其3'端非翻譯區組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX2中要突變為絲氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在真核表達載體上的GPX2基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能夠編碼本發明所述的GPX2突變體蛋白；根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2羧基端的343-854位的512個氨基酸的基因序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3/端含有終止密碼子和特定的酶切位點；同樣經酶切連接后用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的特定的酶切位點是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽性細胞株的篩選: 先用含有SBP2基因的載體轉染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩定表達SBP2的細胞株；再用含有GPX2突變體基因的載體轉染穩定表達SBP2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX2突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株； 3)、靶蛋白的表達與純化: 在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品； 所述的檢測GPX2突變體蛋白的表達量，是用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測； 所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
8.權利要求3所述的高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體的制備方法，其特征在于:在合成GPX2突變體的編碼基因時將第117位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，其它步驟與權利要求7第一種方法相同。
9.權利要求5所述的高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體的制備方法，其特征在于:在合成GPX2突變體的編碼基因時將第77位絲氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子，其它步驟與權利要求7第一種方法完全相同。
10.權利要求6所述的高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX2突變體的制備方法，其步驟如下:在序列SEQ ID No: 1、SEQ ID No: 2或SEQ ID No: 3的氨基端引入pColdl原核表達載體的組氨酸純化標簽和凝血 因子Xa切割位點的氨基酸后所形成的序列SEQ ID No:4,SEQ IDNo:5 或 SEQ ID No:6。
【文檔編號】C12N9/08GK103756984SQ201410054696
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月18日 優先權日:2014年2月18日
【發明者】魏景艷, 郭笑, 宋健 申請人:吉林大學