一種死谷芽孢桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種死谷芽孢桿菌（Bacillus?vallismortis）SZ-4，其保藏號為CGMCC?No.8273。所述菌株在牛肉膏蛋白胨（NB）培養基上單細胞繁殖生長形成的菌落圓形、乳白色、中心稍隆起、表面濕潤、透明；鏡檢呈桿狀，具鞭毛，大小為0.7～0.82×1.6～2.2μm，G+，有芽孢；在含有2%～5%的NaCl的牛肉膏蛋白胨（NB）培養基上均能生長；所述的牛肉膏蛋白胨（NB）培養基的配方為：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂17g，水1000ml，pH6.8～7.2。死谷芽孢桿菌SZ-4對引起人參根腐病、疫病、菌核病和灰霉病的病原菌均具有顯著拮抗作用。本發明還提供死谷芽孢桿菌SZ-4在防治植物真菌病害中的應用，或在制備防治植物真菌病害的微生物制劑中的應用。
【專利說明】一種死谷芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種死谷芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002]人參(Panax ginsengC.A.Mey)為五加科人參屬多年生宿根陰性雙子葉藥用植物，是我國的名貴藥材，有“百草之王”的美譽。人參在中國、韓國、朝鮮、俄羅斯等國家有大面積種植，其中，中國東北是人參的主產區，已成為當地的重要支柱產業之一。人參的長期人工種植和品種選育難度大導致人參種質退化、病害嚴重、質量差、產量低。化學農藥的大量使用，導致農藥殘留和環境污染，降低了人參藥材的安全性和商品價值。病害防控問題已成為制約人參產業可持續發展的重大問題之一。[0003]人參病害約有20~40種，其中，以下4類病原菌是導致人參常見病并限制人參產業發展的主要病原菌:由腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)引起的人參根腐病一般發病率在30%左右，嚴重時六年生人參根腐病造成的死亡率可達50%-80%，主要危害幼苗根部和根莖部(地表以下莖部)，腐爛的參根呈黑褐色濕腐狀，后期糟朽狀，僅存中空的根皮；由惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)引起的人參疫病發病率可達70%,其癥狀為發病輕時葉片上產生不規則的暗綠色斑，重者莖葉枯萎，根部腐爛，植株成片枯死，減產嚴重；由人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)引起的人參菌核病主要危害3年生以上參根，發病部位為芽苞、根和根莖，參根被害后，初期在表面生少許白色絨狀菌絲體，以后，內部迅速腐敗、軟化，細胞全部被消解殆盡，只留下壞死的外表皮，表皮內外形成許多鼠糞狀的菌核；由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的人參灰霉病發病初期在參根的芽胞上出現褐色斑點，從參根主根的外表上看不出異常現象，但用手掐時，參根內部的組織已變軟，發病后期芽孢和主根都表現為軟腐癥狀，并在病部產生灰色的絨毛狀霉層，有時可在病根上形成黑色的菌核。
[0004]化學農藥防治病蟲害對農業生產起到了十分重要的作用。但長期連續地使用化學農藥，已造成一系列嚴重后果，如殺傷害蟲天敵，并造成病菌、害蟲產生抗藥性，環境嚴重污染，人類健康受到威脅。而生物防治以生態學為基礎控制有害生物，避免了化學農藥使用帶來的一系列植保、環境和能源方面的問題，避免了農藥殘留對人畜的危害，并促進農業的可持續發展。利用人參根際土篩選出的大量有益微生物可調節改善土壤微環境，具有拮抗效果的微生物亦可對人參土傳病害進行生物防治。近年來，以拮抗細菌防治植物病害取得了較大的進展。在國外用放射土壤桿菌k84菌系防治果樹的根癌病是最成功的例子，并且已商品化。美國報道，用草生歐氏桿菌防治梨火疫病的效果與鏈霉素相當。江蘇省農科院植保所利用枯草芽孢桿菌，成功地開發出防治水稻紋枯病和稻曲病的生物殺菌劑，該項產品已進入農藥市場，推廣面積累計超過5000萬畝。其他報道的細菌殺菌劑還有用來防治黃瓜及煙草炭疽病菌的地衣芽孢桿菌，防治棉花枯萎病、甘藍黑腐病的枯草芽孢桿菌，以及防治水稻紋枯病的假單孢菌等。由于細菌的種類多、數量大、繁殖速度快，且易于人工培養和控制，因此，細菌生防殺菌劑的研究和開發具有較大的前景。
[0005]拮抗細菌是否發揮其生防作用，主要取決于是否能有效的定殖。[0006]芽孢桿菌由于具有抑制植物病害的能力，又是自然界中廣泛存在的非致病細菌，對人畜無害，不污染環境，因而備受關注。目前，已應用的生防細菌芽孢桿菌主要有枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、甲基營養型芽抱桿菌(Bacillus methylotrophicus)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)等。國內已開發成功并投入生產的枯草芽孢桿菌商品制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、依天得、根腐消等。云南農業大學和中國農業大學共同研制的微生物農藥百抗(10億個/g活芽孢枯草芽孢桿菌可濕性粉劑)獲得農業部登記注冊，已在多個省推廣使用，推廣面積約4667hm2，主要防治水稻紋枯病、三七根腐病、煙草黑脛病。百抗的主要有效成分是枯草芽孢桿菌B908，百抗對水稻紋枯病防效70%以上，其抑菌機制為營養競爭、位點占領等。南京農業大學研發的麥豐寧是由枯草芽孢桿菌菌株B3制成的活體生物殺菌劑，對小麥紋枯病田間防效達50%~80%，其防病機制主要表現在產生抑制小麥紋枯病病菌菌絲生長、菌核形成和菌核萌發的抗菌物質。
[0007]芽孢桿菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其種類多分布廣，是土壤和植物微生態系統中的優勢種群。該類微生物通過分泌抗生物質和生長競爭，在防治植物病害方面發揮多種有益作用。目前尚未見利用死谷芽孢桿菌防治人參真菌性病害專利報道。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在 于，針對人參生產上的主要真菌性病害，尤其是人參土傳病害發生面積日益擴大，化學藥劑防治除易造成環境污染和農藥殘留外，防效也不理想的實際情況，提出一種死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)菌株SZ-4及其在防控人參根腐病(由腐皮鐮孢菌Fusarium solani引起)、人參疫病(由惡疫霉菌Phytophthora cactorum引起)、人參菌核病(由人參核盤菌Sclerotinia schinseng引起)和人參灰霉病(由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起)上的應用。
[0009]本發明提供了一種防控上述人參根腐病、疫病、菌核病和灰霉病的死谷芽孢桿菌SZ-4，該菌株的保藏名稱為死谷芽孢桿菌SZ-4，分類命名為Bacillus vallismortis SZ-4,保藏單位為:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期:2013年9月25日，保藏編號:CGMCC N0.8273，其16SrDNA序列長度為1454bp，具體如SEQ ID No:1所示。應用BLAST軟件和DNAMAN軟件等進行分析，將所測16SrDNA序列通過BLAST比對，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與SZ-4菌株相似性最高的是Bacillus vallismortis,同源性達到99%。根據MEGA5.10Beta2軟件以UPGMA法構建系統發育樹發現,SZ-4與Bacillus vallismortis同屬一個遺傳分枝，親緣關系十分接近，親源性達到了 99%。結合形態學和生理生化性狀的鑒定結果，可以確認本發明的菌株SZ-4為死谷芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)。
SEQ ID No:1 如下:
CGGGGGCTGC GTGCTAATAA TGCAAGTCGA GCGGACAGAT
GGGAGCTTGC TCCCTGATGT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA
ACACGTGGGT AACCTGCCTG TAAGACTGGG ATAACTCCGG
GAAACCGGGG CTAATACCGG ATGGTTGTTT GAACCGCATG
【權利要求】
1.一種死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)SZ-4,其特征在于,其保藏號為CGMCCN0.8273。
2.如權利要求1所述的死谷芽孢桿菌SZ-4，其特征在于， 該菌株在牛肉膏蛋白胨(NB)培養基上單細胞繁殖生長形成的菌落圓形、乳白色、中心稍隆起、表面濕潤、透明；鏡檢呈桿狀，具鞭毛，大小為0.7~0.82 X 1.6~2.2μ m，G+，有芽孢。其能在25°C~40°C的溫度下生長，其最適生長溫度為32°C ;其生長pH范圍為6.5~7.5，最適生長pH為6.8 ; 需氧生長。硝酸鹽還原反應生成紅色化合物；接觸酶測定、脂肪酶反應為陰性；酪蛋白、酪氨酸反應呈陽性；能利用D-葡萄糖、D-木糖；淀粉水解試驗鏡檢有糊精生成；明膠液化試驗呈陽性。檸檬酸鹽利用試驗培養基呈堿性(藍色)。V-P (pH7.0)測定生成紅色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇檢測呈陽性；在含有2%~5%的NaCl的牛肉膏蛋白胨(NB)培養基上均能生長。 所述的牛肉膏蛋白胨(NB)培養基的配方為:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0gJlC月旨 17g，水 1000mL, ρΗ6.8 ~7.2。
3.如權利要求1或2所述的死谷芽孢桿菌SZ-4在防治植物真菌病害中的應用，或在制備防治植物真菌病害的微生物制劑中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述植物為人參。 優選地，所述真菌為引起人參根腐病的腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)、引起人參疫病的惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)、引起人參菌核病的人參核盤菌(Sclerotiniaschinseng)和引起人參灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)中的一種或多種。
5.一種微生物制劑，其特征在于，含有死谷芽孢桿菌SZ-4的全培養液培養物和死谷芽孢桿菌SZ-4的孢子。
6.如權利要求5所述的微生物制劑，其特征在于，其是通過以下制備方法制備得到的: (O將如權利要求1所述的死谷芽孢桿菌SZ-4試管種接種于用1000mL三角瓶裝的300mL肉膏蛋白胨酵母膏(BPY)培養液中，在180r/min，32°C下培養24小時，獲得發酵菌液； (2)將發酵菌液在以種子罐體積15%接種于種子罐中的發酵培養液中發酵培養，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，種子罐的溫度30~34°C，接種發酵菌液4小時后，每隔2小時對種子罐中的發酵液進行發酵質量檢測，直到發酵液菌體生長比較飽滿即將出現芽孢時，獲得發酵菌種，種子罐中的發酵時間為12~16小時； (3)將種子罐中發酵菌種的10%接種于發酵罐中的BPY培養液中發酵培養，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，發酵罐的溫度30~34°C，接種發酵菌種4小時后，每隔2小時對發酵罐中的發酵液進行發酵質量檢測，觀察菌含量，直到發酵罐中發酵液中的最終培養物(包含菌和芽孢)生物量為109cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于90%時，立即將發酵液出罐進行分裝，獲得SZ-4微生物制劑；發酵罐中的發酵時間為24~36小時。
7.如權利要求6所述的微生物制劑，其特征在于，所述的BPY培養液的配方為:牛肉膏5g,蛋白胨IOg,酵母浸膏5g，葡萄糖5g, NaC15g,蒸懼水1000mL, pH6.8~7.0 ;所述的發酵培養液的配方以重量百分比計為:豆餅粉2.0%，淀粉1.5%，酵母浸膏0.5%，玉米漿0.5%，NaCl0.5%, KH2PO40.2%，MgSO4.7H200.2%, MgSO4.H2O0.5%，Ca (HCO3) 20.2%，余量為水，ρΗ6.5 ~7.0。優選地，所述的BPY培養液通過如下方法配制:稱取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL蒸餾水中，充分混勻后將pH調整至6.8~7.0, 1000mL三角瓶中裝量為300mL，用雙層封口膜封好三角瓶口，121°C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后備用。 優選地，所述的發酵培養液通過如下方法配制:在種子罐中加入所需的水，按比例加入豆餅粉、淀粉、酵母浸膏、玉米漿、NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H20、MgSO4.H2O, Ca(HCO3)2，充分攪拌，將發酵培養液PH調整到6.5~7.0，密封加料孔，用高溫蒸汽滅菌2小時，冷卻后立即接種。
8.如權利要求5-7中任一項所述的微生物制劑，其特征在于， 在種子罐或發酵罐的發酵中，當出現較多泡沫時，加入消泡劑，所述的消泡劑為有機娃，加入量以種子--或發酵--中的泡沫不&出為準；發酵中發酵完成后，在發酵te中加入占罐中液體總體積萬分之二的苯甲酸防腐劑，攪拌均勻，任選地，再出罐進行分裝。
9.如權利要求5-8任一項所述的微生物制劑在防治人參真菌病害中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述真菌為引起人參根腐病的腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)、引起人參疫病的惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)、引起人參菌核病的人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)和引起人參灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)中的一種或多種。 優選地，在人參真菌性病害發病初期，將所述微生物制劑的稀釋液均勻地施加到土壤中，所述的稀釋液中微 生物制劑與水的稀釋體積比為1:200。 更優選地，所述的稀釋液中還添加了助劑有機硅，所述助劑有機硅與稀釋液的體積比為 1:5000。
【文檔編號】C12R1/07GK103952329SQ201410045778
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年2月8日 優先權日:2014年2月8日
【發明者】楊利民, 孫卓, 韓梅, 韓忠明 申請人:吉林農業大學