一種檢測egfr基因外顯子19缺失突變的試劑盒和方法

一種檢測egfr基因外顯子19缺失突變的試劑盒和方法
【專利摘要】本發明涉及分子生物學領域，具體為檢測人表皮生長因子受體基因EGFR外顯子19缺失突變的PCR引物、TaqMan探針、PNA探針及試劑盒和檢測方法；以數字PCR為平臺，在反應體系中加入與野生型非突變模板序列互補的PNA探針，利用PNA探針的阻遏作用，使得只有發生了EGFR外顯子19缺失突變的樣本才能被擴增；并且利用TaqMan探針作為熒光定量標記，根據熒光檢測判斷樣品中是否存在突變的模板及數量和比例。
【專利說明】—種檢測EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒和方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域和核酸檢測領域，具體為檢測表皮生長因子受體EGFR基因外顯子19缺失突變的方法。
【背景技術】
[0002]隨著個體化醫療觀念的不斷深入，檢測特定基因突變可以給醫生的個體化診療提供靶向用藥的參考。受體酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是近年來肺部腫瘤治療的熱點靶向藥物，與傳統放化療藥物相比，可明顯延長腫瘤患者生存期，改善生存質量。
[0003]表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶區域發生突變，可使酪氨酸激酶抑制劑治療晚期非小細胞肺癌的有效率達到80%以上。由于EGFR基因突變是一種體細胞遺傳突變，迄今為止的資料證明此類突變僅發生在癌細胞中，正常組織細胞均屬于無突變的野生型。
[0004]EGFR蛋白酪氨酸激酶功能區由EGFR基因外顯子18_24編碼，其中外顯子18_20編碼N-Lobe，外顯子21~24編碼C_Lobe。迄今為止發現的EGFR突變主要位于外顯子19至21 ;非小細胞肺癌EGFR突變90%以上發生為exonl9的缺失突變及exon21的L858R點突變。
[0005]尤其是人表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子19發生突變的非小細胞肺癌患者，對該類藥物敏感，即受體酪氨酸激酶抑制劑藥物對這些患者有療效。外顯子19缺失突變占約46%，主要是發生9、12、15、18、24個核苷酸的框內缺失突變。因此EGFR外顯子exonl9缺失突變的檢測，可以為篩選靶向治療患者提供參考；同時可用于癌癥患者，特別是肺癌患者的高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測。
[0006]目前基因變異的檢測技術主要有直接測序法(亦稱Sanger測序法)和ARMS法。現分別簡介于下:
[0007]Sanger測序法，即Sanger(桑格)雙脫氧鏈終止法是Frederick Sanger于1975年發明的。測序過程需要先做一個聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR過程中，雙脫氧核糖核苷酸可能隨機的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸多脫了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。目前最普遍最先進的方法，是將雙脫氧核糖核苷酸進行不同熒光標記。將PCR反應獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發出熒光。由于ddATP，ddGTP, ddCTP, ddTTP (4種雙脫氧核糖核苷酸)熒光標記不同，計算機可以自動根據顏色判斷該位置上堿基究竟是A，T，G，C中的哪一個。直接測序法耗時長且靈敏度低，僅能檢出突變比例在10%~20%以上的突變。
[0008]ARMS 法也稱擴增阻礙突變系統(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)、等位基因特性PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)等，即等位基因特異性擴增法(Allele Specific Amplif ication, ASA)建立于 1989 年,是 PCR 技術應用的發展。
[0009]ARMS法主要用于對已知突變基因進行檢測。首先設計兩個5’端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補。對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3’端引物進行兩個平行PCR，只有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產物。如果錯配位于上游引物的3’端，則引物與模板DNA不配對，導致PCR不能延伸，因此這種方法稱為ARMS，可選擇性地擴增野生型或突變型基因。
[0010]上述現有技術存在以下問題:
[0011]1.均為定性檢測，也就是說只能給出基因變異是否存在的結論。但無法測定攜帶基因變異的DNA量的比例，也就是說難以進行定量檢測。
[0012]2.均給出模擬圖結果，需要人工進行判讀，判讀方面相對比較主觀。無法直接得到數字化的客觀結果。
[0013]3.靈敏度比較差，目前方法的靈敏最好為1%，無法滿足某些特定的臨床檢測需求。
[0014]目前的檢測一般需要通過有創性組織活檢，且不易重復獲取。研究表明，在血液、胸腔積液、唾液、糞便等樣本中，會有少量混雜于大量野生型基因組DNA中的突變腫瘤細胞DNA。從這些低含量樣本中檢測突變的基因，需要找一種靈敏性高、特異性強、簡便易行、結果判定簡單的突變檢測方法，用于癌癥患者，特別是肺癌患者的靶向用藥指導、高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測等。

【發明內容】

[0015]本發明的目的在于提 供一種檢測EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒及方法，為個體化用藥提供參考。
[0016]肽核酸(P印tide Nucleic Acid, PNA)是一類以中性酰胺鍵(假肽鍵)代替DNA中的糖-磷酸二酯鍵作為骨架的脫氧核糖核酸類似物，保留其中的堿基部位。PNA的特殊結構，使之可以不被蛋白酶或者核酸酶降解，有很高的穩定性，是一種非離子、非手性、不易被水解和酶切的分子。
[0017]PNA與DNA模板結合能力高于普通寡核苷酸，可作為阻遏物置于引物前面，并與PCR引物部分重合；SPNA與模板正確配對時可阻止聚合酶鏈反應，野生型模板無法擴增；若發生錯配(例如模板為發生突變的DNA)，則結合能力迅速下降，失去阻遏作用。此時可用來擴增突變模板。
[0018]數字PCR是一種核酸分子絕對定量方法，基于單分子PCR方法來進行計數，主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于I個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。
[0019]本發明以數字PCR為平臺，在反應體系中加入與野生型非突變模板序列互補的PNA探針，利用PNA探針的阻遏作用，使得只有發生了 EGFR外顯子19缺失突變的樣本才能被擴增；并且利用TaqMan探針作為熒光定量標記，根據熒光檢測判斷樣品中是否存在突變的模板。
[0020]本發明技術方案如下。
[0021]一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的PCR擴增引物，為反向PCR擴增引物和正向PCR擴增引物，可擴增含有EGFR外顯子19上c.2230-c.2260序列的片段；正向PCR擴增引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.1~5)中的一種:
[0022]F1:5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
[0023]F2:5 ’ -GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3，，
[0024]F3:5，-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3，，
[0025]F4:5 ’ -GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，，
[0026]F5:5， -AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，；
[0027]反向PCR擴增引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.6~10)中的一種；
[0028]Rl:5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，，
[0029]R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3，，
[0030]R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，
[0031 ] R4:5，-CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，
[0032]R5:5，-CCACAC AGCAAAGCAGAA-3，。
[0033]優選的，正向PCR擴增引物為SEQ ID N0.1~5之一的核苷酸序列；反向PCR擴增引物為SEQ ID N0.6~10之一的核苷酸序列；
[0034]更優選的，PCR擴增引物選自以下各組序列之一:
[0035](I)正向:F1:5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3 ’，
[0036]反向Rl: 5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3 ’，或者，
[0037](2 )正向:F2:5，-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3 ’，
[0038]反向R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3 ’，或者，
[0039](3 )正向:F3:5，-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3 ’，
[0040]反向R3:5 ’ -ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，或者，
[0041 ] (4 )正向:F4:5，-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，，
[0042]反向R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3 ’，或者，
[0043](5 )正向:F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，，
[0044]反向R5:5，-CCACACAGCAAAGCAGAA-3 ’。
[0045]一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的標記TaqMan探針，能夠與缺失位點下游的DNA模板結合，是連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，其中熒光基團選自6-羧基熒光素、六氣 _6_ 竣基突光素、Cy5 (美國 Life Technologies)、Cy3 (美國 Life Technologies)或VIC (美國Life Technologies)，猝滅基團選自6-羧基四甲基若丹明、BHQl (美國LifeTechno1gies)>BHQ2 (美國 Life Technologies)或 MGB (美國 Life Technologies);標記TaqMan探針核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一種(SEQ ID N0.11~15):
[0046]P1:5，-ACTCACATCGAGGATTTCC-3’，
[0047]P2:5 ’ -TCACATCGAGGATTTCCTT-3，，
[0048]P3:5，-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，，
[0049]P4:5 ’ -ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，，
[0050]P5:5 ’ -AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
[0051]優選的，這種檢測EGFR外顯子19缺失突變的標記TaqMan探針的核苷酸部分是SEQ ID N0.11~15核昔酸序列中的一種。[0052]一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的PNA探針，與野生型未突變的EGFR外顯子19的DNA互補，含有以下核苷酸序列之一(SEQ ID N0.16~20):
[0053]PNA1:5，-GAATTAAGAGAAGCA-3 ’，
[0054]PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，，
[0055]PNA3:5，-TAAGAGAAGCAACAT-3，，
[0056]PNA4:5，-AGAGAAGCAACATCT-3，，
[0057]PNA5:5，-AGAAGCAACATCTCC-3，。
[0058]優選的，這種檢測EGFR外顯子19缺失突變的PNA探針核苷酸是SEQ ID N0.16~20序列中的一種。
[0059]上述的標記TaqMan探針、PNA探針和PCR擴增引物可以用于制備試劑盒，基于數字PCR平臺用來檢測EGFR外顯子19缺失突變，為靶向治療篩選患者提供參考，也可用于癌癥患者，特別是肺癌患者的高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測。
[0060]一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的試劑盒，含有以下物質中的至少一種:
[0061](I)上述的PCR擴增引物，
[0062](2)上述的 TaqMan 探針，
[0063](3 )上述的PNA探針。
[0064]上述試劑盒中還包括正向和反向的質控PCR引物和質控TaqMan探針；
[0065]所述的質控PCR弓丨物用于擴增含EGFR基因DNA模板上保守序列(優選為EGFR外顯子2);質控TaqMan探針為連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，其熒光基團與標記TaqMan探針的熒光基團不同；質控TaqMan探針與質控PCR引物所擴增的序列結合。
[0066]優選的，所述正向和反向的質控PCR弓丨物及質控TaqMan探針的核苷酸部分選自以下各組序列中的一組:
[0067](I)正向引物:CF1:GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC (SEQ ID N0.21)，
[0068]反向引物:CRl:TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA(SEQ ID N0.23)，
[0069]質控TaqMan 探針的核苷酸部分:CP1:TCACGCAGTTGGGCAC (SEQ ID N0.25);或者，
[0070](2)正向引物:CF2:GCCAAGGCACGAGTAACAAGC (SEQ ID N0.22)，
[0071]反向引物:CR2:CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT(SEQ ID N0.24)，
[0072]質控TaqMan 探針的核苷酸部分:CP2:ACGCAGTTGGGCACTT (SEQ ID N0.26)。
[0073]這種試劑盒可以基于數字PCR平臺檢測位于EGFR外顯子19上c.2230-c.2260范圍內的若干個堿基(通常為15~19個堿基)的缺失突變。
[0074]本發明檢測EGFR外顯子19缺失突變的方法，步驟包括:
[0075]1.將待測的DNA模板、正向和反向的PCR擴增引物、標記TaqMan探針、PNA探針、正向和反向的質控PCR引物、質控TaqMan探針與PCR預混液混合，制備得到數字PCR混合液；
[0076]正向和反向的PCR擴增引物可用于擴增含有EGFR外顯子19上c.2230-c.2260序列的片段；
[0077]正向PCR擴增引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.1~5)之一:
[0078]Fl: 5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
[0079]F2:5，-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3，，[0080]F3:5 ’ -AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’，
[0081 ]F4:5，-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，，
[0082]F5:5， -AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，；
[0083]反向PCR擴增引物含有以下核苷酸序列之一(SEQ ID N0.6~10):
[0084]Rl:5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，，
[0085]R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3，，
[0086]R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，
[0087]R4:5，-CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，
[0088]R5:5，-CCACACAGCAAAGCAGAA-3，；
[0089]優選的，正向PCR擴增引物為SEQ ID N0.1~5之一的核苷酸序列；反向PCR擴增引物為SEQ ID N0.6~10之一的核苷酸序列；
[0090]更優選的，正向和反向PCR擴增引物選自以下各組序列之一:
[0091](I)正向:F1:5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
[0092]反向Rl: 5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3 ’，或者，
[0093](2 )正向:F2:5，-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3 ’，
[0094]反向R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3 ’，或者，
[0095](3 )正向:F3:5，-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3 ’，
[0096]反向R3:5 ’ -ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，或者，
[0097](4 )正向:F4:5，-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，，
[0098]反向R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3 ’，或者，
[0099](5 )正向:F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，，
[0100]反向R5:5 ’ -CCACACAGCAAAGCAGAA-3，。
[0101]標記TaqMan探針能夠與缺失位點下游的DNA模板結合，為連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，其中核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一種(SEQ IDN0.11~15):
[0102]P1:5 ’ -ACTCACATCGAGGATTTCC-3，，
[0103]P2:5 ’ -TCACATCGAGGATTTCCTT-3，，
[0104]P3:5，-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，，
[0105]P4:5 ’ -ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，，
[0106]P5:5 ’ -AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
[0107]優選的，TaqMan探針上的核苷酸部分為SEQ ID N0.11~15核苷酸序列中的一種。TaqMan探針上的熒光基團選自6_羧基熒光素(FAM)、六氯_6_羧基熒光素(HEX)、Cy5、Cy3、VIC,熒光猝滅基團選自6-羧基四甲基若丹明(TAMARA)、BHQU BHQ2或MGB。
[0108]PNA探針與野生型未突變的EGFR外顯子19的DNA互補，含有以下核苷酸序列之一(SEQ IDN0.16 ~20):
[0109]PNAl: 5，-GAATTAAGAGAAGCA-3 ’
[0110]PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，
[0111]PNA3:5，-TAAGAGAAGCAACAT-3，
[0112]PNA4:5，-AGAGAAGCAACATCT-3，
[0113]PNA5:5，-AGAAGCAACATCTCC-3，。[0114]優選的，PNA探針為SEQ ID.N0.16~20之一的核苷酸。
[0115]所述的正向和反向質控PCR引物用于擴增含EGFR外顯子19的DNA模板上保守序列(優選為EGFR外顯子2);質控TaqMan探針為連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，其熒光基團與標記TaqMan探針的突光基團不同；質控TaqMan探針與質控PCR引物所擴增的序列
結合?
[0116]所述的質控PCR引物用于擴增EGFR外顯子19所在DNA模板上的保守序列，優選為，擴增EGFR外顯子2 ;
[0117]所述的質控PCR引物及質控TaqM an探針的核苷酸部分選自以下各組序列中的一組:
[0118](I)正向引物:CF1:GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC (SEQ ID N0.21)，
[0119]反向引物:CRl:TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA(SEQ ID N0.23)，
[0120]質控TaqMan 探針的核苷酸部分:CP1:TCACGCAGTTGGGCAC (SEQ IDN0.25);或者，
[0121](2)正向引物:CF2:GCCAAGGCACGAGTAACAAGC (SEQ ID N0.22)，
[0122]反向引物:CR2:CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT(SEQ ID N0.24)，
[0123]質控TaqMan 探針的核苷酸部分:CP2:ACGCAGTTGGGCACTT (SEQ ID N0.26)。
[0124]上述引物和探針是針對EGFR外顯子19缺失設計優化的，尤其是針對數字PCR平臺的檢測。在數字PCR混合液中，待測樣品的DNA模板含量為0.25~Ing/ μ L (優選為
0.4~0.6ng/ μ L)，正向和反向PCR擴增引物含量分別為500~700nM，標記TaqMan探針以及PNA探針含量分別為200~400nM ;正向和反向質控PCR引物含量分別為500~700nM，質控TaqMan探針含量為200~400nM。
[0125]更優選的，數字PCR混合液中，待測樣品的DNA模板的含量為0.5ng/l.! L，正向和反向PCR引物含量分別為600nM，標記TaqMan探針以及PNA探針含量分別為300nM，正向和反向質控PCR引物含量分別為600nM，質控TaqMan探針含量為300nM。
[0126]2.數字PCR混合液制作PCR微反應液滴，再進行PCR擴增反應，條件為:93~97°C預變性3~15分鐘；93~97°C變性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共進行20~60個循環，2~10°C終止反應；
[0127]優選的PCR擴增條件為:93.5~95°C預變性3~6分鐘；93.5~95°C變性8~15秒，64.5~66°C退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共進行30~35個循環，6~10°C終止反應。
[0128]更優選的PCR擴增條件為:94°C預變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進行32個循環，10°C終止反應。
[0129]優選的，數字PCR混合液制作PCR微反應液滴的方法為，將數字PCR混合液加入微滴發生器，生成10000~20000個微反應液滴。
[0130]3.收集信號并進行結果判斷:對PCR擴增反應后的產物進行信號收集，根據熒光信號的類型判斷則待測樣品中是否含有EGFR外顯子19缺失突變的DNA模板，還可確定其中EGFR基因外顯子19缺失突變的DNA模板數量和含量。
[0131]可用QuantaSoft (Biorad)軟件進行數據分析,計算樣品中發生突變的拷貝數和含量，確定突變DNA樣本的比例。
[0132]由于質控PCR引物的作用，PCR微反應液滴中只要含有樣品DNA模板，不論是否發生缺失突變，都會發生擴增反應，并且結合了質控TaqMan探針，因此會有熒光信號。發生了缺失突變的DNA模板,加入PCR引物擴增后,還結合了標記TaqMan探針。質控與標記TaqMan探針的熒光基團類型不同，因此根據不同的熒光信號可以分辨出樣品中是否含有EGFR基因外顯子19缺失突變的DNA模板。再根據發生了突變的熒光信號數量以及總的熒光信號數量，可確定EGFR基因外顯子19缺失突變的DNA模板含量，進行定量分析。
[0133]通過上述方法，可以檢測位于EGFR外顯子19上c.2230-c.2260范圍內的10~19個堿基的缺失突變。
[0134]與現有技術比較，本發明的優點在于:
[0135]1.結果判讀方式:以前的技術方法結果的判讀需要人工參與，肉眼依據相關圖形作出最后的判斷，這種判讀的方式嚴重依賴經驗，速度慢且很容易產生假陽性和假陰性的判讀結果。我們的技術方式給出的是數據信息，可以借助軟件完全自動化的進行結果判讀，從而加快了數據分析的速度，也減少了產生假陰性和假陽性判讀的可能。
[0136]2.結果描述的方式:以前的技術方式對基因變異的描述是定性的方式，也就是說，只是描述某個特異的基因變異是否存在于檢測樣本。本技術方法對基因變異的描述是絕對定量的方式，可以給出樣本所攜帶某種特異基因變異DNA的絕對數量和比例。而且準確率高，即使在突變樣本含量較低的情況下，定量分析的誤差也很小。[0137]3.檢測靈敏度(數值越小靈敏度越好):以前技術方法的靈敏度一般在1%— 50%之間，而我們提出的技術方法對基因變異的檢測靈敏度提升非常明顯，為1/2500。可以在非常高背景的野生DNA中檢測出極其微量的攜帶基因變異的DNA。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0138]圖1為實施例1中，不同含量突變樣本的熒光檢測結果。
【具體實施方式】
[0139]實施例1
[0140](I)準備待測DNA樣品:含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外顯子19缺失的突變陽性DNA以及野生型與突變DNA混合樣本(其中突變體與野生型的含量比分別為1/100、1/1000、1/2500)。DNA來源可以是血清、血漿、外周血、口腔黏膜、胸腔積液、體液或者組織等。突變DNA來源于攜帶EGFR19突變的陽性細胞系。其中EGFR19外顯子上c.2238 —
c.2255位的片段缺失突變。
[0141](2)室溫融解用于檢測EGFR外顯子19缺失的PCR擴增引物及對應的標記TaqMan探針和PNA探針，融解用于擴增EGFR外顯子2的正向和反向質控PCR引物及質控TaqMan探針。
[0142]正向和反向PCR擴增引物的序列為:
[0143]Fl: 5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，
[0144]Rl:5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，
[0145]標記TaqMan探針的序列包括熒光基團、核苷酸部分及猝滅基團，熒光基團和猝滅基團分別為FAM和MGB，核苷酸部分如SEQ ID N0.11所示，標記TaqMan探針為:P1:FAM -ACTCACATCGAGGATTTCC-MGB。[0146]PNA 的序列如 SEQ ID N0.16 所示，PNAl: 5’ -GAATTAAGAGAAGCA-3’。
[0147]正向和反向質控PCR引物的序列為:
[0148]CF2:5，-GCCAAGGCACGAGTAACAAGC-3 ’
[0149]CR2:5，-CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT-3’
[0150] 質控TaqMan探針的熒光基團和猝滅基團分別為VIC和MGB，核苷酸部分如SEQ IDN0.26所示,質控TaqMan探針為:
[0151]CP2:VIC-ACGCAGTTGGGCACTT - MGB。
[0152](3)按照以下配比制備PCR反應液:2X數字PCR預混液(Biorad，#186-3022)與PCR擴增引物和質控PCR引物(600nM)、標記和質控TaqMan探針(300nM)以及PNA探針(300nM)與待檢測DNA (IOng)配制成數字PCR混合液，用雙蒸水補足至終體積為20 μ L。配制的數字PCR混合液中，正向和反向PCR擴增引物含量分別為600ηΜ、標記TaqMan探針含量為300ηΜ，ΡΝΑ探針含量300ηΜ ;正向和反向質控PCR引物含量分別為600ηΜ，質控TaqMan探針含量為300ηΜ。
[0153](4)配制好的20μ L數字PCR混合液加入到8-道的液滴制作板內，然后加入60μ L液滴制作油到制作板，再放入QX200微滴發生器中，用于制備PCR微反應液滴。
[0154](5)將制備好的PCR微反應液滴轉移至96孔反應板，并用封板膜進行熱封，生成的微反應液滴數量為10000~20000個。
[0155](6)將96孔PCR板放入PCR儀按照下面條件進行擴增反應:
[0156]94°C預變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進行32個循環，10°C終止反應。
[0157](7)PCR擴增反應后將PCR反應板放置于PCR微反應液滴信號讀取儀(QX200微滴熒光信號收集系統)中進行信號收集，結果如圖1。用QuantaSoft (Biorad)軟件進行數據分析，得出樣本中突變DNA的絕對含量以及相對野生型DNA的比例。
[0158]通過上述步驟檢測，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出突變。
[0159]含有突變型DNA模板的微反應液滴中，同時出現FAM和VIC熒光信號，記為一個信號數；含未發生突變的野生型DNA模板的微反應液滴中，僅出現VIC熒光信號。
[0160]定量檢測結果，突變型DNA模板含量不同的樣本中，突變陽性信號數(即FAM信號數)與總信號數即總微反應液滴的數量比例如下:
[0161]1/1樣品 6477/13028計算值突變/野生=0.989/1，誤差1.2%
[0162]1/100樣品186/18700 計算值突變/野生=0.01/1，誤差0.2%
[0163]1/1000 樣品 23/19854 計算值突變 / 野生=0.00116/1，誤差 16%
[0164]1/2500 樣品 11/19928 計算值突變 / 野生=0.00055/1，誤差 37%
[0165]突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時，定量檢測誤差低于2%。
[0166]選用以下各組之一的正向和反向PCR擴增引物時，按上述步驟檢測，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出突變，且突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時，定量檢測誤差低于2%:
[0167](I)正向 F2:5，-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3 ’
[0168]反向R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3 ’
[0169](2 )正向 F3:5 ’ -AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3 ’[0170]反向R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3 ’
[0171](3 )正向 F4:5，-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3 ’
[0172]反向R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3 ’
[0173](4 )正向 F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，
[0174]反向R5:5 ’ -CCACACAGCAAAGCAGAA-3，。
[0175]改用以下序列之一的PNA探針時(SEQ ID N0.17~20)，按上述步驟檢測，效果相同，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出突變:
[0176](I) PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，
[0177](2) PNA3:5，-TAAGAGAAGCAACAT-3，
[0178](3) PNA4:5，-AGAGAAGCAACATCT-3，
[0179](4) PNA5:5，-AGAAGCAACATCTCC-3，。
[0180]當所使用的標記TaqMan探針的核苷酸部分改用以下序列之一(SEQ ID N0.12~16)時，效果相同。在 突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出突變:
[0181](I)P2:5，-TCACATCGAGGATTTCCTT-3，
[0182](2 ) P3:5，-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，
[0183](3) P4:5，-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，
[0184](4) P5:5，-AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
[0185]通過上述方法，可以檢測EGFR19外顯子上c.2238 — c.2255位缺失突變，檢出限達到 1/2500。
[0186]將突變型的DNA樣品換為在EGFR19外顯子上c2238 — c.2250位片段缺失突變的DNA,用上述方法檢測，檢出限也可達到1/2500，且突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時，定量誤差低于5%。
[0187]正向和反向的質控PCR引物，以及質控TaqMan探針可改用以下序列，效果相同。
[0188]正向質控PCR 引物 CFl: 5 ’ -GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC-3 ’
[0189]反向質控PCR 引物 CRl: 5 ’ -TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA-3 ’
[0190]質控TaqMan 探針 CP1VIC-TCACGCAGTTGGGCAC-MGB。
[0191]對照例
[0192]一、使用不同PCR引物、PNA探針或者TaqMan探針
[0193]1、按照實施例1的方法，區別在于使用的PCR擴增引物不同，是按照熒光定量PCR技術設計的正反向引物。
[0194]正向和反向PCR擴增引物的序列分別為:
[0195]F1，:5， -GGGACTCTGGATCCCAGAAGGTG-3’
[0196]R1，:5， -CTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’
[0197]在突變樣本含量為1/100時有檢出結果，突變樣本含量為1/1000時，約一半樣本有檢出結果；突變樣本含量為1/2500時不能檢出。
[0198]2、按照實施例1的方法，區別于在按熒光定量PCR技術設計的標記TaqMan探針的核苷酸序列為:P1’:5’ -AAAGCAGAAACTCACATCG-3’。
[0199]標記TaqMan探針上連接的熒光基團和猝滅基團為FAM和MGB。
[0200]在突變樣本含量為1/100時有檢出結果，突變樣本含量為1/1000時，約一半樣本有檢出結果；突變樣本含量為1/2500時不能檢出。
[0201]3、按照實施例1的方法，區別在于使用的PNA的序列為:PNAI’:5’ -AGCAACATCTCCGA-3，。
[0202]定性檢測:在突變樣本含量為1/100時有檢出結果，突變樣本含量為1/1000時，約一半樣本有檢出結果；突變樣本含量為1/2500時不能檢出。
[0203]突變樣本含量為1/100的樣品進行定量檢測，誤差為15%以上。
[0204]二、使用不同濃度的PCR擴增引物、探針
[0205]1、按照實施例1的方法，區別在于，數字PCR混合液中的正向和反向PCR擴增引物分別為ΙΟΟηΜ。此時僅當突變含量為1/100時可檢出突變，突變樣本含量為1/1000和1/2500時均無法檢出突變。
[0206]2、按照實施例1的方法，區別在于，數字PCR混合液中的正向和反向PCR擴增引物含量分別為ΙΟΟηΜ，標記TaqMan探針和PNA探針含量分別為ΙΟΟηΜ。此時僅當突變含量為1/100時可檢出突變，突變樣本含量為1/1000和1/2500時均無法檢出突變。
[0207]3、按照實施例1的方法，區別在于，數字PCR混合液中的正向和反向PCR擴增引物、正向和反向質控PCR引物標記TaqMan探針、質控TaqMan探針和PNA探針含量分別為1000nM。此時野生DNA樣品出現假陽性信號，檢測體系已無法給出準確結果。
[0208]三、使用熒光定量 PCR的方法檢測，檢出限為1/100，而且在突變樣本含量大于1%的情況下，定量分析的誤差大于10%。
【權利要求】
1.一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的P CR擴增引物，其特征在于，為反向PCR擴增引物和正向PCR擴增引物； 正向引物含有以下核苷酸序列中的一種:
Fl: 5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
F2:5 ’ -GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3，，
F3:5 ’ -AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3，，
F4:5 ’ -GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，， F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，； 反向引物含有以下核苷酸序列中的一種；
Rl: 5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，，
R2:5 ’ -GGACCCCCACACAGCAAA-3，，
R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，
R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，
R5:5，-CCACACAGCAAAGCAGAA-3，。
2.權利要求1所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的PCR擴增引物，其特征在于，正向PCR擴增引物選自以下核苷酸序列中的一種:
Fl: 5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，，
F2:5 ’ -GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3，，
F3:5 ’ -AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3，，
F4:5 ’ -GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3，， F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，； 反向PCR擴增引物選自以下核苷酸序列中的一種:
Rl: 5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，，
R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3，，
R3:5，-ACCCCCACACAGCAAAGC-3，，
R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，
R5:5，-CCACACAGCAAAGCAGAA-3，。
3.權利要求1所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的PCR引物，其特征在于，PCR擴增引物選自以下各組引物中的一組: (1)正向:Fl:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’， 反向 Rl: 5 ’ -ATGGACCCCCACACAGCA-3，，或者， (2)正向:F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’ 反向 R2:5’ -GGACCCCCACACAGCAAA-3’，或者， (3)正向:F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’， 反向 R3:5’ -ACCCCCACACAGCAAAGC-3’，或者， (4)正向:F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’， 反向 R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3，，或者， (5)正向:F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3，， 反向 R5:5’ -CCACACAGCAAAGCAGAA-3’。
4.一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的標記TaqMan探針，其特征在于，所述標記TaqMan探針為連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，其中核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一種:
Pl: 5，-ACTCACATCGAGGATTTCC-3，，
P2:5 ’ -TCACATCGAGGATTTCCTT-3，，
P3:5 ’ -ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，，
P4:5 ’ -ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，，
P5:5 ’ -AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
5.權利要求4所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的標記TaqMan探針，其特征在于，所述標記TaqMan探針的熒光基團選自6_羧基熒光素、六氯_6_羧基熒光素、Cy5、Cy3或VIC，猝滅基團選自6-羧基四 甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。
6.權利要求4所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的標記TaqMan探針，所述核苷酸部分選自以下核苷酸序列中的一種:
Pl: 5，-ACTCACATCGAGGATTTCC-3，，
P2:5 ’ -TCACATCGAGGATTTCCTT-3，，
P3:5 ’ -ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，，
P4:5 ’ -ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，，
P5:5 ’ -AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
7.—種檢測EGFR外顯子19缺失突變的PNA探針，其特征在于，含有以下核苷酸序列之
PNAl:5，-GAATTAAGAGAAGCA-3，，
PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，，
PNA3:5， -TAAGAGAAGCAACAT-3，，
PNA4:5， -AGAGAAGCAACATCT-3，，
PNA5:5， -AGAAGCAACATCTCC-3，。
8.權利要求7所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的PNA探針，其特征在于，選自以下核苷酸序列之一:
PNAl:5，-GAATTAAGAGAAGCA-3，，
PNA2:5，-ATTAAGAGAAGCAAC-3，，
PNA3:5， -TAAGAGAAGCAACAT-3，，
PNA4:5， -AGAGAAGCAACATCT-3，，
PNA5:5， -AGAAGCAACATCTCC-3，。
9.一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的試劑盒，其特征在于，含有以下物質中的至少一種: (1)權利要求1、2或3所述的PCR擴增引物； (2)權利要求4或5所述的標記TaqMan探針； (3)權利要求6、7或8所述PNA探針。
10.權利要求9所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的試劑盒，其特征在于，還包含正向和反向的質控PCR引物和質控TaqMan探針；所述的質控PCR引物用于擴增含EGFR基因DNA模板上保守序列；質控TaqMan探針為連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，其熒光基團與標記TaqMan探針的熒光基團不同；質控TaqMan探針與質控PCR引物所擴增的序列結合。
11.權利要求10所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的試劑盒，其特征在于，所述的質控PCR引物用于擴增EGFR外顯子2。
12.權利要求10或11所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的試劑盒，其特征在于，所述的質控PCR引物及質控TaqMan探針的核苷酸部分選自以下各組序列中的一組: (I)正向引物:CFl:GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC, 反向引物:CRl: TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA, 質控TaqMan探針的核苷酸部分:CP1: TCACGCAGTTGGGCAC ;或者， (2 )正向引物:CF2: GCCAAGGCACGAGTAACAAGC， 反向引物:CR2: CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT， 質控TaqMan探針的核苷酸部分:CP2: ACGCAGTTGGGCACTT。
13.一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)制備數字PCR混合液:將待檢測樣品、權利要求1~3任一項所述的PCR擴增引物、權利要求4或5所述標記TaqMan探針、權利要求6或7所述PNA探針、正向和反向質控PCR引物和質控TaqMan探針以及PCR預混液混合，制備得到數字PCR混合液； 所述的質控PCR引物用于擴增含EGFR基因的DNA模板上保守序列；質控TaqMan探針為連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，其熒光基團與標記TaqMan探針的熒光基團不同；質控TaqMan探針與質控PCR引物所擴增的序列結合； (2)數字PCR混合液制作PCR微反應液滴，再進行PCR擴增反應； PCR擴增條件為:93~97°C預變性3~15分鐘；93~97°C變性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共進行20~60個循環，2~10°C終止反應； (3)收集信號并進行結果判斷:對PCR擴增反應后的產物進行信號收集，根據熒光信號的類型判斷則待測樣品中是否含有EGFR外顯子19缺失突變的DNA模板及其數量和含量。
14.權利要求13所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的方法，其特征在于，在數字PCR混合液中，DNA模板的含量為0.25~Ing/μ L，正向和反向PCR擴增引物含量分別為500~700ηΜ，標記TaqMan探針和PNA探針含量分別為200~400ηΜ ;正向和反向質控PCR引物含量分別為500~700ηΜ，質控TaqMan探針含量分別為200~400ηΜ。
15.權利要求13所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的方法，其特征在于，在數字PCR混合液中，待測樣品的DNA模板含量為0.5ng/ μ L，正向和反向PCR擴增弓丨物含量分別為600ηΜ，標記TaqMan探針以及PNA探針含量分別為300ηΜ，正向和反向質控PCR引物含量分別為600ηΜ，質控TaqMan探針含量分別300ηΜ。
16.權利要求13所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的方法，其特征在于，PCR擴增條件為:93.5~95°C預變性3~6分鐘；93.5~95°C變性8~15秒，64.5~66°C退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共進行30-35個循環，6~10°C終止反應。
17.權利要求13所述檢測EGFR外顯子19缺失突變的方法，其特征在于，PCR擴增條件為:94°C預變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進行32個循環，10°C終止反應。
【文檔編號】C12N15/11GK103923975SQ201410041188
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年1月27日 優先權日:2014年1月27日
【發明者】王世亨 申請人:上海涌泰生物醫藥科技有限公司