一種肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量pcr檢測方法和檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量PCR檢測方法和檢測試劑盒。這種試劑盒及檢測方法以轉基因調控元件CaMV35S啟動子、NOS終止子以及標記基因NPTII為檢測對象，同時針對多個基因片段進行檢測，可以有效應對肉制品等深加工產品中DNA遭受破壞的問題，降低假陰性幾率，而且解決了轉基因源不確定性的問題，同時滿足目前的快速、靈敏、操作簡便、高通量、低成本的檢測要求，實現對該類產品植物源性轉基因成分有效分析、監控。
【專利說明】-種肉制品中植物源性轉基因成分多重焚光定量PCR檢測 方法和檢測試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種本發明涉及一種肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量PCR 檢測方法和檢測試劑盒，屬于分子生物學領域。
【背景技術】
[0002] 目前，我國肉制品產量和消費量均居世界首位。在現代肉類產品加工過程中，為 改善肉制品的品質、優化產品質量、確保營養均衡，植物源的成份如植物蛋白、淀粉、膳食纖 維、食用膠、植物油以及各種調味品等被運用到肉制品的加工中。隨著轉基因植物的大規模 商品化，多種轉基因作物豆、水稻、玉米、油菜籽等及其加工產品已廣泛應用于食品制造業， 因此，在肉制品年加工過程中植物源成分被添加的同時，轉基因成分間接地、不可避免地會 滲入到肉制品的領域。因此，敏感、快速、準確的轉基因食品定性及定量檢測方法的研究日 益受到重視。核酸檢測方法是最常用以及最適用的檢測轉基因食品的方法，主要有定性PCR 方法、熒光定量PCR，其中熒光定量PCR是近年來發展起來的一種分子生物學檢測技術，由 于具有高靈敏度、高特異性、可計量性、自動化程度高，被廣泛運用在轉基因食品、病原微生 物、疾控等檢測領域。但是，其檢測皆是以單一的目標為檢測對象，經過復雜的加工程序， DNA會受到物理、化學或酶因子等因素的影響，導致不同程度的破壞。這給目前現行的單 一檢測對象的方法帶來很大的挑戰和風險，且被引入的轉基因成分來源具有很大的不確定 性，采用單一的檢測方法--進行，勢必操作復雜、費時費力且成本較大。總之，單一目標的 檢測方法在肉制品等深加工產品轉基因檢測中，具有很大的漏洞和弊端，很難有效地對這 類產品進行監測。多重熒光定量PCR在此基礎上應運而生，但是目前的技術還不完善，其運 用領域也有很多空白。多重熒光定量PCR是基于Taqman探針法熒光定量PCR的基礎上，通 過使用多對引物和相應的標記有不同的熒光信號的探針，在同一個反應體系中對多個目標 序列進行同時檢測，實現高通量、低成本的檢測需求。因此，針對轉基因技術常用的通用元 件和標記基因，開發多重熒光PCR檢測技術，對多個目標片段進行檢測是當務之急，以彌補 目前的許多運用領域的空白。
【發明內容】
[0003] 本發明的一個目的是提供一種新的肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量 PCR檢測方法和檢測試劑盒。
[0004] 本發明的目的是提供一種肉制品中植源性轉基因成分的多重熒光定量PCR檢測 方法，包括DNA提取和PCR檢測兩個步驟，其特征在于：所述的DNA提取步驟為將肉制品樣 品經剪碎或研磨均質后，按照組織基因組DNA提取方法進行DNA抽提；所述的PCR檢測步驟 為將CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標記基因 NPTII的特異性引物和探針、預混熒光定量 PCR反應體系、DNA模板和CldH2O按一定比例用量加入熒光定量PCR反應管，再將熒光定量 PCR反應管放入熒光定量PCR儀進行擴增，擴增結束后搜集熒光信號，同時進行平行試驗。
[0005] 進一步的，所述的CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標記基因 NPTII的特異性引物 和探針的喊基排列順序為： CaMV 35S 反向引物：5' - CGACAGTGGTCCCAAAGA - 3' 正向引物：5' - AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC - 3' 探針：5，FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-TAMRA3' ； NOS 反向引物：5' - TCT TAAGATTGAA TCCTGTT - 3' 正向引物：5' - ATTGCGGGACTCTAATCATA - 3' 探針：5，HEX-CAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGTCC -TAMRA3，； NPT II 反向引物：5' - AGGATCTCGTCGTGACCCAT - 3' 正向引物：5' - GCACGAGGAAGCGGT - 3' 探針：5, R0X-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA3'。
[0006] 進一步的，所述的PCR檢測步驟中各組分的加入量如下表所示：
【權利要求】
1. 一種肉制品中植源性轉基因成分的多重熒光定量PCR檢測方法，包括DNA提取和 PCR檢測兩個步驟，其特征在于：所述的DNA提取步驟為將肉制品樣品經剪碎或研磨均質 后，按照組織基因組DNA提取方法進行DNA抽提；所述的PCR檢測步驟為將所屬CaMV 35S 啟動子、NOS終止子和標記基因 NPTII的特異性引物和探針、預混熒光定量PCR反應體系、 DNA模板和CldH2O按一定比例用量加入熒光定量PCR反應管，再將熒光定量PCR反應管放入 熒光定量PCR儀進行擴增，擴增結束后搜集熒光信號，同時進行平行試驗。
2. 根據權利要求1所述的肉制品中植源性轉基因成分的多重熒光定量PCR檢測方法， 其特征在于：所述的所屬CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標記基因 NPTII的特異性引物和 探針的喊基排列順序為： CaMV 35S 反向引物：5' - CGACAGTGGTCCCAAAGA - 3' 正向引物：5' - AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC - 3' 探針：5，FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-TAMRA3' ； NOS 反向引物：5' - TCT TAAGATTGAA TCCTGTT - 3' 正向引物：5' - ATTGCGGGACTCTAATCATA - 3' 探針：5，HEX-CAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGTCC -TAMRA3，； NPT II 反向引物：5' - AGGATCTCGTCGTGACCCAT - 3' 正向引物：5' - GCACGAGGAAGCGGT - 3' 探針：5, R0X-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA3'。
3. 根據權利要求1所述的肉制品中植源性轉基因成分的多重熒光定量PCR檢測方法， 其特征在于：所述的PCR檢測步驟中各組分的加入量如下表所示：
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4. 根據權利要求1所述的肉制品中植源性轉基因成分的多重熒光定量PCR檢測方法， 其特征在于：所述的DNA模板為標準品或提取的DNA ;所述DNA模板為標準品時作為陽性對 照管；所述DNA模板為提取的DNA時作為測試管。
5. 根據權利要求1所述的肉制品中植源性轉基因成分的多重熒光定量PCR檢測方法， 其特征在于：所述標準品序列應包含以下序列： CaMV 35S ：AAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCT CGTGGGTGGG GGTCCATCTTTGGGACCACTGTCG ； NOS:TCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATTAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCA TGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGA TTAGAGTCCC GCAATTA ； NPT II ：GCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCA CGGGTAGCCAACGCTA TGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATA TTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTC ACGACGAGAT CCT〇
6. 根據權利要求1所述的肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量PCR檢測方法， 其特征在于：所述的熒光定量PCR儀設置的反應參數為95°C變性lmin30s，以95°C 5s， 58°C 30s，72°C 30 s擴增40個循環，設置58°C結束后開始收集熒光信號。
7. -種權利要求1所述的肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量PCR檢測方法 中使用的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括轉基因調控元件、預混熒光定量PCR反應體 系、標準品和CldH2O ;所述的轉基因調控元件包括所屬CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標記 基因 NPTII的特異性引物和探針；所述的標準品包括CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標記 基因 NPTII的目標擴增片段。
8. 根據權利要求7所述的肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量PCR檢測方法 中使用的試劑盒，其特征在于：所述的所屬CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標記基因 NPTII 的特異性引物和探針為肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量PCR檢測方法中的所 屬CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標記基因 NPTII的特異性引物和探針。
9. 根據權利要求7所述的肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量PCR檢測方法中 使用的試劑盒，其特征在于：所述的CaMV 35S啟動子、NOS終止子和標記基因 NPTII的目標 擴增片段為肉制品中植物源性轉基因成分多重熒光定量PCR檢測方法中的CaMV 35S啟動 子、NOS終止子和標記基因 NPTII的目標擴增片段。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388539SQ201410033119
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2014年1月24日
【發明者】邵彪, 黃偉東, 季葛振, 羅鑫 申請人:南通市產品質量監督檢驗所