具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片的制備方法，該方法首先分離骨髓間充質干細胞，然后進行骨髓間充質干細胞傳代擴增培養，最后實現間充質干細胞片的培養，得到具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片；本發明通過采用細胞片層技術分離培養BMSCs，收獲的BMSCs是含有細胞外基質的完整片狀結構，并具有骨向分化和血管發生潛能。由于移植到體內的只有由純細胞構成的組織，避免了支架等載體的使用以及其所帶來的不良反應。且BMSCs細胞片層保留了重要的細胞表面蛋白，如離子通道、連接蛋白等，細胞間可以更好地進行信號傳遞，保持功能的協調一致。大大提高了細胞的利用率和轉移細胞的活性。
【專利說明】具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于移植領域，尤其涉及一種用于組織修復再生的細胞片的制備方法。
【背景技術】
[0002]目前，組織工程最主要使用的方法是利用可降解生物材料制成與所需組織形狀相仿的三維支架，并在其上培育特定細胞，細胞在支架上生長成所需組織后，將組織與支架一起移植入母體內以替換病變或受損組織。如今，科學家們已經通過此類方法獲得了許多種類的組織并為再生醫學做出了巨大貢獻，例如軟骨，骨骼和血管等的修復。然而，組織工程的發展也遇到了一些問題。首先，支架的生物相容性需要驗證，某些生物支架會造成植入部位附近組織出現炎性增生，生物可降解支架的降解也會引起炎癥反應。其次，支架降解會留下一定空間，而這些空間通常會被增殖的細胞以及大量的胞外基質填滿，但是過多的胞外基質以及支架降解殘留物又會造成組織纖維化，從而產生病變。
[0003]骨髓來源的間充質干細胞(BMSCs)易于分離提取和體外培養擴增，無免疫排斥反應，誘導后可以向多種細胞組織分化，已成為組織工程中理想的種子細胞。傳統的組織工程學在收獲和轉移細胞方面仍存在諸多不足，限制了組織工程學的發展。胰蛋白酶在消化細胞的過程中難以控制細胞的消化程度，造成細胞外基質破壞、細胞活性降低和細胞染色體突變機會的增加。單細胞懸液移植BMSCs的方法，細胞上架率和細胞密度低，難以形成致密的目標組織。因此，組織工程學要構建出具有致密組織且血供豐富的大塊組織，必須解決種子細胞收獲和轉移方面存在的問題。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片的制備方法。本發明通過細胞層片技術，制備BMSCs細胞片，使植入體內的BMSCs更好地與周圍組織結合，共同參與修復損傷組織，并減少因植入外物的損傷，提高細胞的利用率和轉移細胞的活性。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:一種具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片的制備方法，包括以下步驟:
(O骨髓間充質干細胞的分離:健康成年大鼠，麻醉后處死，用體積濃度為75%的酒精浸泡約lOmin，無菌條件下取四肢長骨，除去骨表面附著的軟組織，用PBS緩沖液清洗干凈；將兩端干骺端切除，顯露骨髓腔；用體積濃度為10%的FBS的低糖DMEM培養液徹底沖洗骨髓腔，然后依次用7號針頭和5號針頭的注射器反復沖打沖出的骨髓，使骨髓細胞充分分散，制成單細胞懸液，再接種于培養瓶內，在37°C、體積濃度為5% C02培養箱中培養12h后更換培養液，棄去未貼壁細胞，之后每2-3天換液I次；貼壁細胞融合80%以上后，結束原代培養；
(2)骨髓間充質干細胞傳代擴增培養:將步驟I原代培養后的細胞用Iml質量體積比為0.25%胰蛋白酶消化約2min，待細胞形態開始皺縮，用含體積濃度為10%的胎牛血清的DMEM培養液3ml終止消化，移入離心管，1500rpm離心約5min，棄上清，加入含體積濃度為10%胎牛血清的低糖DMEM培養液，按1:3比例傳代培養，得到第一代骨髓間充質干細胞，繼續傳代培養至得到第三代骨髓間充質干細胞；
(3)間充質干細胞片的培養:將步驟2得到的第三代骨髓間充質干細胞用Iml質量體積比為0.25%胰蛋白酶消化2min后接種在培養瓶中，接種密度為IX IO4 cells/cm2，在a-MEM培養液，37 °C恒溫、體積濃度為5 % C02飽和濕度培養箱內培養7天后，細胞在底部形成了層狀結構，將融合的細胞從培養瓶上分離下來得到即得到具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片。
[0006]本發明的有益效果是，本發明通過采用細胞片層技術分離培養BMSCs，收獲的BMSCs是含有細胞外基質的完整片狀結構，并具有骨向分化和血管發生潛能。由于移植到體內的只有由純細胞構成的組織，避免了支架等載體的使用以及其所帶來的不良反應。且BMSCs細胞片層保留了重要的細胞表面蛋白，如離子通道、連接蛋白等，細胞間可以更好地進行信號傳遞，保持功能的協調一致。大大提高了細胞的利用率和轉移細胞的活性。
【具體實施方式】
[0007]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
本發明具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片的制備方法，包括以下步驟:
1、骨髓間充質干細胞(MSCs)的分離
健康成年Sprague-Dawley大鼠,麻醉后處死,用體積濃度為75%的酒精浸泡IOmin,無菌條件下取四肢長骨，除去骨表面附著的軟組織，用PBS緩沖液清洗干凈。用咬骨鉗將兩端干骺端切除，顯露骨髓腔。`用體積濃度為10%的FBS的低糖DMEM培養液徹底沖洗骨髓腔，然后依次用7號針頭和5號針頭的注射器反復沖打沖出的骨髓，使骨髓細胞充分分散，制成單細胞懸液。I只大鼠股骨和脛骨骨髓細胞接種于I個T-25cm2塑料培養瓶內，在37°C、體積濃度為5% C02培養箱中培養12h后更換培養液，棄去未貼壁細胞，之后每2-3天換液I次。貼壁細胞融合80%以上后，結束原代培養。
[0008]2、骨髓間充質干細胞傳代擴增培養
將原代培養后的細胞用Iml質量體積比為0.25%胰蛋白酶消化2min，待細胞形態開始皺縮，用含體積濃度為10%的胎牛血清的DMEM培養液3ml終止消化，反復輕輕吹打，移入離心管，1500rpm離心5min，棄上清，加入含體積濃度為10%胎牛血清的低糖DMEM培養液，按1:3比例傳代培養，得到第一代骨髓間充質干細胞，繼續傳代培養至第三代骨髓間充質干細胞，用于體外實驗。
[0009]3、間充質干細胞片的培養
將第三代骨髓間充質干細胞用Iml質量體積比為0.25%胰蛋白酶消化2min后接種在培養瓶中，接種密度為IX IO4 cells/cm2，在常規a -MEM培養液，37°C恒溫、體積濃度為5%C02飽和濕度培養箱內培養7天后，細胞在底部形成了層狀結構，即細胞片，可以使用細胞刮刀將融合的細胞從培養瓶上分離下來得到細胞片。
[0010]通過PCR方法檢測MSC細胞片與MSCs在基因表達上的差異，發現骨髓間充質干細胞細胞片高表達BMP-2與VEGF，說明MSC細胞片具有骨向分化和血管發生的潛能。
【權利要求】
1.一種具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)骨髓間充質干細胞的分離:健康成年大鼠，麻醉后處死，用體積濃度為75%的酒精浸泡約lOmin，無菌條件下取四肢長骨，除去骨表面附著的軟組織，用PBS緩沖液清洗干凈；將兩端干骺端切除，顯露骨髓腔；用體積濃度為10%的FBS的低糖DMEM培養液徹底沖洗骨髓腔，然后依次用7號針頭和5號針頭的注射器反復沖打沖出的骨髓，使骨髓細胞充分分散，制成單細胞懸液，再接種于培養瓶內，在37°C、體積濃度為5% C02培養箱中培養12h后更換培養液，棄去未貼壁細胞，之后每2-3天換液I次；貼壁細胞融合80%以上后，結束原代培養； (2)骨髓間充質干細胞傳代擴增培養:將步驟I原代培養后的細胞用Iml質量體積比為.0.25%胰蛋白酶消化約2min，待細胞形態開始皺縮，用含體積濃度為10%的胎牛血清的DMEM培養液3ml終止消化，移入離心管，1500rpm離心約5min，棄上清，加入含體積濃度為10%胎牛血清的低糖DM EM培養液，按1:3比例傳代培養，得到第一代骨髓間充質干細胞，繼續傳代培養至得到第三代骨髓間充質干細胞； (3)間充質干細胞片的培養:將步驟2得到的第三代骨髓間充質干細胞用1ml質量體積比為0.25%胰蛋白酶消化2min后接種在培養瓶中，接種密度為IX IO4 cells/cm2，在a-MEM培養液，37 °C恒溫、體積濃度為5 % C02飽和濕度培養箱內培養7天后，細胞在底部形成了層狀結構，將融合的細胞從培養瓶上分離下來得到即得到具有骨向分化和血管發生的組織工程細胞片。
【文檔編號】C12N5/0775GK103773734SQ201410031913
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2014年1月24日
【發明者】嚴偉祺, 齊義營 申請人:浙江大學