一種丁酸梭菌分泌的抗菌肽及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種丁酸梭菌分泌的抗菌肽及其氨基酸序列和應用。所述的抗菌肽氨基酸序列為序列表SEQIDNO:1所示，分子量為2264.6道爾頓，等電點為8.64。其制備方法是：硫酸銨沉淀培養基中丁酸梭菌分泌的抗菌肽，利用陽離子交換、分子篩層析和反向高效液相色譜法純化抗菌肽。該抗菌肽具有顯著的抗菌活性，且不會對豬的紅細胞產生溶血作用，可用于開發制備飼用抗菌藥物。
【專利說明】一種丁酸梭菌分泌的抗菌肽及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術，具體的，本發明涉及一種丁酸梭菌分泌的抗菌肽及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]抗菌肽是機體先天免疫的重要組成成分，是許多生物體抵抗外來致病菌侵襲的第一道屏障。由于其獨特且多樣的生物學功能和作用機制引起了科學界的廣泛關注和研究，一方面研究抗菌肽在先天免疫中發揮作用的生物學基礎，一方面將其作為設計新型抗菌、抗感染制劑的分子模板。抗菌肽是自然進化的產物，和微生物一起已經存在了億萬年，盡管經過長期的共同進化，但抗菌肽并沒有丟失其殺滅或抑制微生物的能力，或產生使微生物逃逸抗菌肽的能力，所以說抗菌肽是研發新型高效抗生素替代品的重要突破。
[0003]丁酸梭菌是一種益生菌，具有維持腸道微生態平衡、提高免疫力、抗癌、產生營養物質等功能。丁酸梭菌開發利用前景廣闊，目前已應用于食品、醫藥、農牧、化工等諸多領域。但由于丁酸梭菌培養條件嚴格，需要在嚴格厭氧條件下才能生長，且分泌的成分復雜，難被分離純化，因此目前尚無從丁酸梭菌中分離純化抗菌肽的報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗菌的丁酸梭菌分泌的抗菌肽及其制備方法和在飼料中的應用。
[0005]為了實現本發明，本發明提供如下技術方案：
一種丁酸梭菌分泌的抗菌肽，從丁酸梭菌分泌產物中分離達到的一種單鏈多肽，分子量是2264. 6，等電點8. 64，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示為：PSAWQITKCAGSIAWALGSGIF,該抗菌肽具有抗菌活性，且不會對豬的紅細胞產生溶血作用。
[0006]所述的抗菌肽的制備方法，將丁酸梭菌置于嚴格厭氧條件培養24小時后離心，收集培養上清并用硫酸銨沉淀法富集所述的抗菌肽，經離子交換、分子篩層析和反相高效液相色譜純化。
[0007]所述的離子交換為：將硫酸銨沉淀后得到的樣品透析，上樣于陽離子交換柱，用含(TO. 5M NaCl的緩沖液梯度洗脫，收集洗脫的蛋白。
[0008]所述的分子篩層析為：將離子交換得到的活性成分透析，上樣于分子篩層析柱，用緩沖液洗脫，收集第四個峰。
[0009]所述的反向高效液相色譜為：將分子篩層析得到的活性物質上樣于C18柱，用含
O.1%的乙腈從10~60%梯度洗脫，收集45min處峰。
[0010]所述的抗菌肽的應用，作為飼料的抗菌制劑。
[0011]本發明采用飛行質譜法測定分子量，使用ExPASy在線工具估算等電點，自動氨基酸測序儀測定氨基酸的序列結構。
[0012]下面用本發明丁酸梭菌分泌的抗菌肽的抗菌試驗和安全性試驗說明本發明的有益效果：地衣芽孢桿菌分泌的抗菌肽對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較高的抗菌活性，對E.coli K 88的最小抑菌濃度為32 μ g/mL，對5： aureus ATCC25923的最小抑菌濃度為64μ g/mL ;安全性高，抗菌肽濃度高達256 μ g/mL對豬紅細胞也無溶血作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖I陽離子交換色譜純化丁酸梭菌分泌的抗菌肽SDS-PAGE圖，（泳道1，蛋白marker ;泳道2，丁酸梭菌分泌的總蛋白；泳道3，陽離子交換色譜純化后得到的蛋白）；
圖2分子篩層析色譜純化丁酸梭菌分泌的抗菌肽SDS-PAGE圖，（泳道1，蛋白marker ；泳道2，陽離子交換色譜純化后得到的蛋白；泳道3，分子篩層析色譜純化后得到的蛋白）；圖3 丁酸梭菌分泌的抗菌肽對豬紅細胞溶血率測定。
【具體實施方式】
[0014]以下結合附圖和實施例對本發明做進一步的說明。
[0015]實施例I陽離子交換純化丁酸梭菌分泌的抗菌肽
1)裝柱
2)10體積的低鹽緩沖液，至紫外吸收值穩定
3)將樣品注 射至進樣柱內，調整進樣流速為Iml/min ；
4)10體積的低鹽緩沖液，至紫外吸收值穩定
5)(TO. 5M NaCl氯化鈉梯度洗脫
6)收集樣品，用Bradford試劑盒測定蛋白濃度，并用低鹽緩沖液將蛋白濃度調整為lmg/ml，取5 Pg樣品用于NuPAGE分析，如圖I所示，其余保存于_ 80°C超低溫冰箱。
[0016]實施例2分子篩層析純化丁酸梭菌分泌的抗菌肽
1)裝柱
2)10體積的緩沖液平衡，至紫外吸收值穩定
3)將樣品注射至進樣柱內，調整進樣流速為O.I ml/min ；
4)緩沖液洗脫，收集第四個峰
5)收集樣品，用Bradford試劑盒測定蛋白濃度。用瓊脂糖孔穴擴散法檢測每個峰的抗菌活性，用低鹽緩沖液將蛋白濃度調整為lmg/ml，取5 μg樣品用于NuPAGE分析，如圖2所示，其余保存于-80V超低溫冰箱。
[0017]實施例3 丁酸梭菌分泌的抗菌肽對豬紅細胞溶血率測定
1)將抗菌肽在96孔板上進行系列稀釋，終濃度為256、128、64、32、16、8、4μ g/mL，每個濃度10uL，共七個濃度，同時設置三個重復；
2)90uL/孔的紅細胞懸液加入到稀釋好的多肽孔中，設置陽性對照孔為1%紅細胞懸液中加入IOuL 10%的Triton X-100 (終濃度為1%);陰性對照孔位1%紅細胞懸液中加入IOuL 的 IXPBS ；
3)將96孔板置于37°C，5%C02環境中培養18_24h ；
4)培養結束后，將96孔板在離心機無制動停機狀態下1000-1500rpm離心20min；
小心吸取上清至一新平底透明96孔培養板中，用酶標儀測定各孔在414nm和546nm下的吸光度；軟件分析得到0D414nm、0D546nm和Delta OD值；通過下列公式計算抗菌肽對豬紅細胞的溶血率，結果如圖3所示：丁酸梭菌分泌的抗菌肽對豬紅細胞無溶血作用。
【權利要求】
1.一種丁酸梭菌分泌的抗菌肽，其特征是，從丁酸梭菌分泌產物中分離達到的一種單鏈多肽，分子量是2264. 6，等電點8. 64，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示為：PSAWQITKCAGSIAWALGSGIF，該抗菌肽具有抗菌活性，對疋coli K 88的最小抑菌濃度為32μ g/mL, 5： aureus最小抑菌濃度為64 μδ/πι1，且對豬的紅細胞不會產生溶血作用。
2.一種根據權利要求1所述的抗菌肽的制備方法，其特征是，將丁酸梭菌置于嚴格厭氧條件培養24小時后離心，收集培養上清并用硫酸銨沉淀法富集所述的抗菌肽，經離子交換、分子篩層析和反相高效液相色譜純化。
3.根據根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的離子交換為：將硫酸銨沉淀后得到的樣品透析，上樣于陽離子交換柱，用含(TO. 5Μ NaCl的緩沖液梯度洗脫，收集洗脫的蛋白。
4.根據根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的分子篩層析為：將離子交換得到的活性成分透析，上樣于分子篩層析柱，用緩沖液洗脫，收集第四個峰。
5.根據根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的反向高效液相色譜為：將分子篩層析得到的活性物質上樣于C18柱，用含O. 1%的乙腈從10-60%梯度洗脫，收集45min處峰。
6.一種根據權利要求1所述的抗菌肽的應用，作為飼料的抗菌制劑。
【文檔編號】C12P21/02GK103772494SQ201410030648
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】汪以真, 欒超 申請人:浙江大學