一種提取紫薇總dna的方法
【專利摘要】本發明一種提取紫薇總DNA的方法，將紫薇組織在低溫下剪碎，加入聚乙烯基吡咯烷酮PVP粉末，在液氮中研磨后加入十六烷基三甲基溴化銨CTAB提取液水浴保溫，然后常溫下離心處理，取上清液加入等體積有機溶劑離心處理，將上清液進行沉淀后經離心、清洗、干燥等后處理。本發明一種提取紫薇總DNA的方法，提取過程中在植物組織中加入PVP粉末，PVP粉末能夠與多糖多酚類物質結合，避免了多糖與DNA緊密結合以及多酚的氧化，解決了紫薇總DNA提取困難的問題，提取簡單、快速、有效，為紫薇及其他富含多糖、多酚植物的分子生物學研究奠定了基礎。
【專利說明】一種提取紫薇總DNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物【技術領域】，具體涉及一種提取紫薇總DNA的方法。
【背景技術】
[0002]紫薇(Lagerstroemia indica)屬于千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬(Lagerstroemia)。紫薇富含多糖、多酹以及次生代謝物質，提取其DNA —直以來是個難題。現有很多關于提取多糖多酚植物DNA的方法，但是成功用于提取紫薇基因組DNA的方法未見報道。目前國內外研究紫薇的專家學者在提取紫薇DNA時多選擇成品試劑盒(Cai, M.，Pan, H.T.，Wang, X.F.，He, D.，Wang, X.Y.，Wang, X.J.，Zhang, Q.X.，2011.Development of novel microsatellites in Lagerstroemia indica andDNA fingerprinting in Chinese Lagerstroemia cultivars.Sc1.Hortic.131,88 -94.;Graham, S.A.，Hall, J.，Sytsmaj K.Shi S.H.，2005.Phylogenetic analysis of theLythraceae based on four gene regions and morphology.1nt.J.Plant.Sc1.166，995 -1017.; Liuj Y.，He，D.，Cai，M., Tang, W.，Li，X.Y.，Pang, H.T.，Zhang, Q.X.，2013.Development of microsatellite markers for lagerstroemia indica(Lythraceae)and related species.Applications in Plant Sciencesl，1-4.)，對于普通的實驗室來說試劑盒提取DNA成本過高。多糖、多酚以及次生代謝物質含量高的植物在DNA提取的過程中，多酚很容易被氧化，多糖抑制DNA聚合酶的活性，使得后續PCR擴增以及分子生物學研究無法進行(Horne, E.C.，Kumpatlaj S.P.，Patterson, K.A.，Gupta, Μ.，Thompson, S.A.，2004.1mproved high-throughput sunflower and cotton total DNA extractionand PCR fidelity.Plant Mol.Biol.Rep.22，83a - 831.; Loomis, W.D., 1974.0vercomingproblems of phenolics and quinones in the isolation of plant enzymes andorganelles.Method.Enzymo1.31，528 - 544.; Porebski，S., Bailey, L.G., Baum, B.R.,1997.Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containinghigh polysaccharide and polyphenol components.Plant Mol.Biol.Rep.15，8 - 15.; Tel-zur,N.，Abboj S.，MyslabodskijD.，Mizrahi, Y.，1999.Modified CTAB procedurefor DNA isolation from epiphytic cacti of the genera Hylocereus andSelenicereus (Cactaceae).Plant Mol.Biol.Rep.17，249 - 254.)，目前還沒有簡單方便的提取紫薇總DNA的方法。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種提取紫薇總DNA的方法，解決了紫薇總DNA提取困難的問題。
[0004]本發明所采用的技術方案是:一種提取紫薇總DNA的方法，將紫薇組織在低溫下剪碎，加入聚乙烯基吡咯烷酮粉末，在液氮中研磨后加入十六烷基三甲基溴化銨提取液水浴保溫，然后常溫下離心處理，取上清液加入等體積有機溶劑離心處理，將上清液進行沉淀后經離心、清洗、干燥等后處理得到紫薇總DNA。
[0005]具體包括以下步驟:
[0006]步驟1:
[0007]將紫薇組織從超低溫冰箱中取出，把組織剪碎并保持植物組織一直呈冰凍狀態，得到剪碎的植物組織；
[0008]步驟2:[0009]在步驟I剪碎的植物組織中直接加入PVP粉末，在液氮中研磨破碎紫薇植物組織，將研磨后的粉末轉移到無菌離心管中，加入預熱的CTAB提取液，使研磨后的粉末完全浸沒，水浴保溫一定時間，水浴保溫期間每隔10-15min搖動一次離心管，使研磨后的粉末與提取液充分混勻，得到植物組織液；
[0010]步驟3:
[0011]將步驟2得到的植物組織液冷卻至室溫后以10000-12000r/min的轉速離心處理lOmin，將上清液轉移至另一滅菌的離心管中，加入與上清液等體積的有機溶劑用手輕輕搖動混勻，靜置5-10min后再以相同轉速離心處理IOmin ；
[0012]步驟4:
[0013]將步驟3離心處理后得到的上清液再轉移至另一無菌離心管中，加入上清液1/10體積的3M的醋酸鈉和2/3體積的冰的異丙醇，于低溫下沉淀，得到沉淀液；
[0014]步驟5:
[0015]將步驟4所得沉淀液在一定溫度下離心處理，棄上清液，將沉淀物用體積濃度為70%的酒精洗三次，自然晾干，然后加入TE緩沖液，放置于4°C的溫度環境中使沉淀物充分溶解，得到紫薇總DNA。
[0016]本發明的特點還在于，
[0017]步驟I中超低溫冰箱溫度為_80°C。
[0018]步驟2中加入的PVP粉末與植物組織的質量比為1:1-10，PVP的相對分子質量為45000-55000。
[0019]步驟2中CTAB提取液的預熱的溫度為65 °C，水浴溫度為65 °C、保溫時間為30_120mino
[0020]步驟2 中 CTAB 提取液組成為:ρΗ8.0 的 IOOmM Tris-HCl，1.4mol/LNaCl,4%CTAB,pH8.0的20mM EDTA和2%2_巰基乙醇，2-巰基乙醇使用前再加入。
[0021]步驟3中有機溶劑由體積比為24:1的氯仿與異戊醇組成。
[0022]步驟4中異丙醇溫度為_20°C，低溫為-20°C，沉淀時間不少于30min。
[0023]步驟5中離心處理轉速為10000-12000r/min、時間為lOmin、溫度為4°C。
[0024]步驟5 中 TE 緩沖液組成為:ρΗ8.0 的 IOmM Tris-HCl 和 ρΗ8.0 的 ImMEDTA。
[0025]本發明的有益效果是:本發明一種提取紫薇總DNA的方法，提取過程中在植物組織中加入PVP粉末，PVP粉末能夠與多糖多酚類物質結合，避免了多糖與DNA緊密結合以及多酚的氧化，解決了紫薇總DNA提取困難的問題，提取簡單、快速、有效，為紫薇及其他富含多糖、多酚植物的分子生物學研究奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】[0026]圖1是本發明實施例1提取出的紫薇總DNA的電泳圖；
[0027]圖2是本發明實施例2提取出的紫薇總DNA的電泳圖；
[0028]圖3是本發明實施例1提取的紫薇總DNA的RAPD-PCR電泳圖。
【具體實施方式】[0029]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0030]本發明是一種提取紫薇總DNA的方法，將紫薇組織在低溫下剪碎，加入聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)粉末，在液氮中研磨后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液水浴保溫，然后常溫下離心處理，取上清液加入等體積有機溶劑離心處理，將上清液進行沉淀后經離心、清洗、干燥等后處理得到紫薇總DNA。
[0031]具體包括以下步驟:
[0032]步驟1:
[0033]將紫薇組織從_80°C的超低溫冰箱中取出，把組織剪碎并保持植物組織一直呈冰凍狀態，得到剪碎的植物組織；
[0034]步驟2:
[0035]在步驟I剪碎的植物組織中直接加入相對分子質量為45000-55000的PVP粉末，PVP粉末與植物組織的質量比為1:1-10，在液氮中研磨破碎紫薇植物組織，將研磨后的粉末轉移到無菌離心管中，加入預熱至65°C的CTAB提取液(CTAB提取液組成為:ρΗ8.0 的 IOOmM Tris-HCl, 1.4mol/L NaCl，4%CTAB，ρΗ8.0 的 20mM 乙二胺四乙酸(EDTA)和2%2_巰基乙醇，所述2-巰基乙醇使用前再加入)，使研磨后的粉末完全浸沒，65°C水浴保溫30-120min，水浴保溫期間每隔10_15min搖動一次離心管，使研磨后的粉末與提取液充分混勻，得到植物組織液；
[0036]步驟3:
[0037]將步驟2得到的植物組織液冷卻至室溫后以10000-12000r/min的轉速離心處理lOmin，將上清液轉移至另一滅菌的離心管中，加入與上清液等體積的有機溶劑(體積比為24:1的氯仿與異戊醇)用手輕輕搖動混勻，靜置5-10min后再以相同的轉速離心處理IOmin ；
[0038]步驟4:
[0039]將步驟3離心處理后得到的上清液再轉移至另一無菌離心管中，加入上清液1/10體積的3M的醋酸鈉和2/3體積的-20°C異丙醇，于_20°C沉淀至少30min，得到沉淀液；
[0040]步驟5:
[0041]將步驟4所得沉淀液在4°C下以10000-12000r/min的轉速離心處理lOmin，棄上清液，將沉淀物用體積濃度為70%的酒精洗三次，自然晾干，然后加入TE緩沖液(TE緩沖液組成為:pH8.0的IOmM Tris-HCl和pH8.0的ImM EDTA)，放置于4°C的溫度環境中使沉淀物充分溶解，得到紫薇總DNA。
[0042]本發明在植物組織中加入PVP粉末而不是PVP溶液，雖然只是PVP的狀態和加入的數量被改變了，但是提取DNA的質量有顯著性的改變。研磨時加入PVP粉末能夠有效的結合多糖多酚，形成共價復合物，在離心時可以被徹底除去，并且還能有效的避免多糖多酚與DNA結合。PVP粉末的用量根據植物組織的部位和生長程度決定，老化的組織比幼嫩組織所需PVP用量少。本發明能夠高效提取紫薇總DNA，并且過程簡單快速，比使用進口試劑盒更經濟節約，是一種簡單經濟的提取多糖多酚類植物DNA的方法。
[0043]實施例1
[0044]紫薇葉片于2103年10底采集于陜西楊凌；
[0045]步驟1:
[0046]將紫薇莖組織從_80°C的超低溫冰箱中取出，稱取1.5g，用剪刀把組織剪碎并保持植物組織一直呈冰凍狀態，得到剪碎的植物組織； [0047]步驟2:
[0048]在步驟I剪碎的植物組織中直接加入0.3g相對分子質量為45000-55000的PVP粉末，在液氮中研磨破碎紫薇植物組織，將研磨后的粉末轉移到5個1.5mL滅菌的離心管中，每個離心管中加入ImL預熱至65°C的CTAB提取液(CTAB提取液組成為:pH8.0的IOOmMTris-HCl, 1.4mol/L NaCl，4%CTAB，ρΗ8.0 的 20mM 乙二胺四乙酸(EDTA)和 2%2_ 巰基乙醇，2-巰基乙醇使用前再加入)，65°C水浴保溫60min，水浴保溫期間每隔IOmin搖動一次離心管，使研磨后的粉末與提取液充分混勻以達到破碎植物細胞膜的目的，得到植物組織液；
[0049]步驟3:
[0050]將步驟2得到的植物組織液冷卻至室溫后以12000r/min的轉速離心處理lOmin，將上清液轉移至另一滅菌的離心管中，加入與上清液等體積的有機溶劑(體積比為24:1的氯仿與異戊醇)用手輕輕搖動混勻，靜置5min后再以相同的轉速離心處理IOmin ；
[0051]步驟4:
[0052]將步驟3離心處理后得到的上清液再轉移至另一無菌離心管中，加入上清液1/10體積的3M的醋酸鈉和2/3體積的-20°C異丙醇，于_20°C沉淀40min，得到沉淀液；
[0053]步驟5:
[0054]將步驟4所得沉淀液在4°C下以12000r/min的轉速離心處理IOmin,棄上清液,將沉淀物用體積濃度為70%的酒精洗三次，自然晾干，然后加入50 μ L TE緩沖液(TE緩沖液組成為:ρΗ8.0的IOmM Tris-HCl和ρΗ8.0的ImM EDTA)，放置于4°C的溫度環境中使沉淀物充分溶解，得到紫薇總DNA。
[0055]實施例2
[0056]紫薇葉片于2103年10底采集于陜西楊凌；
[0057]步驟1:
[0058]將紫薇葉片組織從-80°C的超低溫冰箱中取出，稱取0.6g，用剪刀把組織剪碎并保持植物組織一直呈冰凍狀態，得到剪碎的植物組織；
[0059]步驟2:
[0060]在步驟I剪碎的植物組織中直接加入0.06g相對分子質量為45000-55000的PVP粉末，在液氮中研磨破碎紫薇植物組織，將研磨后的粉末轉移到5個1.5mL滅菌的離心管中，每個離心管中加入ImL預熱至65°C的CTAB提取液(CTAB提取液組成為:pH8.0的IOOmMTris-HCl, 1.4mol/L NaCl，4%CTAB，ρΗ8.0 的 20mM 乙二胺四乙酸(EDTA)和 2%2_ 巰基乙醇，2-巰基乙醇使用前再加入)，65°C水浴保溫80min，水浴保溫期間每隔12min搖動一次離心管，使研磨后的粉末與提取液充分混勻以達到破碎植物細胞膜的目的，得到植物組織液；
[0061]步驟3:[0062]將步驟2得到的植物組織液冷卻至室溫后以12000r/min的轉速離心處理lOmin，將上清液轉移至另一滅菌的離心管中，加入與上清液等體積的有機溶劑(體積比為24:1的氯仿與異戊醇)用手輕輕搖動混勻，靜置7min后再以相同的轉速離心處理IOmin ；
[0063]步驟4:
[0064]將步驟3離心處理后得到的上清液再轉移至另一無菌離心管中，加入上清液1/10體積的3M的醋酸鈉和2/3體積的-20°C異丙醇，于_20°C沉淀30min，得到沉淀液；
[0065]步驟5:
[0066]將步驟4所得沉淀液在4°C下以12000r/min的轉速離心處理IOmin,棄上清液,將沉淀物用體積濃度為70%的酒精洗三次，自然晾干，然后加入50 μ L TE緩沖液(TE緩沖液組成為:ρΗ8.0的IOmM Tris-HCl和ρΗ8.0的ImM EDTA，放置于4°C的溫度環境中使沉淀物充分溶解，得到紫薇總DNA。
[0067]實施例3
[0068]紫薇葉片于2103年10底采集于陜西楊凌；
[0069]步驟1:
[0070]將紫薇莖組織從_80°C的超低溫冰箱中取出，稱取1.5g，用剪刀把組織剪碎并保持植物組織一直呈冰凍狀態，得到剪碎的植物組織；
[0071]步驟2:
[0072]在步驟I剪碎的植物組織中直接加入0.6g相對分子質量為45000-55000的PVP粉末，在液氮中研磨破碎紫薇植物組織，將研磨后的粉末轉移到5個1.5mL滅菌的離心管中，每個離心管中加入ImL預熱至65°C的CTAB提取液(CTAB提取液組成為:pH8.0的IOOmMTris-HCl，1.4mol/L NaCl，4%CTAB, pH8.0 的 20mM EDTA 和 2%2_ 巰基乙醇，2-巰基乙醇使用前再加入)，65°C水浴保溫120min，水浴保溫期間每隔15min搖動一次離心管，使研磨后的粉末與提取液充分混勻以達到破碎植物細胞膜的目的，得到植物組織液；
[0073]步驟3:
[0074]將步驟2得到的植物組織液冷卻至室溫后以10000r/min的轉速離心處理lOmin，將上清液轉移至另一滅菌的離心管中，加入與上清液等體積的有機溶劑(體積比為24:1的氯仿與異戊醇)用手輕輕搖動混勻，靜置IOmin后再以相同轉速離心處理IOmin ；
[0075]步驟4:
[0076]將步驟3離心處理后得到的上清液再轉移至另一無菌離心管中，加入上清液1/10體積的3M的醋酸鈉和2/3體積的-20°C異丙醇，于_20°C沉淀60min，得到沉淀液；
[0077]步驟5:
[0078]將步驟4所得沉淀液在4°C下以10000r/min的轉速離心處理IOmin,棄上清液,將沉淀物用體積濃度為70%的酒精洗三次，自然晾干，然后加入50 μ L TE緩沖液(TE緩沖液組成為:ρΗ8.0的IOmM Tris-HCl和ρΗ8.0的ImM EDTA)，放置于4°C的環境中使沉淀物充分溶解，得到紫薇總DNA。
[0079]實施例4
[0080]紫薇葉片于2103年10底采集于陜西楊凌；
[0081]步驟1:
[0082]將紫薇葉片組織從-80°C的超低溫冰箱中取出，稱取0.6g，用剪刀把組織剪碎并保持植物組織一直呈冰凍狀態，得到剪碎的植物組織；
[0083]步驟2:
[0084]在步驟I剪碎的植物組織中直接加入0.48g相對分子質量為45000-55000的PVP粉末，在液氮中研磨破碎紫薇植物組織，將研磨后的粉末轉移到5個1.5mL滅菌的離心管中，每個離心管中加入ImL預熱至65°C的CTAB提取液(CTAB提取液組成為:pH8.0的IOOmMTris-HCl，1.4mol/L NaCl，4%CTAB, pH8.0 的 20mM EDTA 和 2%2_ 巰基乙醇，2-巰基乙醇使用前再加入)，65°C水浴保溫30min，水浴保溫期間間隔IOmin搖動一次離心管，使研磨后的粉末與提取液充分混勻以達到破碎植物細胞膜的目的，得到植物組織液；
[0085]步驟3:
[0086]將步驟2得到的植物組織液冷卻至室溫后以11000r/min的轉速離心處理IOmin,將上清液轉移至另一滅菌的離心管中，加入與上清液等體積的有機溶劑(體積比為24:1的氯仿與異戊醇)用手輕輕搖動混勻，靜置Smin后再以相同轉速離心處理IOmin ；
[0087]步驟4:
[0088]將步驟3離心處理后得到的上清液再轉移至另一無菌離心管中，加入上清液1/10體積的3M的醋酸鈉和2/3體積的-20°C異丙醇，于_20°C沉淀50min，得到沉淀液；
[0089]步驟5:
[0090]將步驟4所得沉淀液在4°C下以11000r/min的轉速離心處理IOmin,棄上清液,將沉淀物用體積濃度為70%的酒精洗三次，自然晾干，然后加入50 μ L TE緩沖液(TE緩沖液組成為:ρΗ8.0的IOmM Tris-HCl和ρΗ8.0的ImM EDTA)，放置于4°C的溫度環境中使沉淀物充分溶解，得到紫薇總DNA。
[0091]實施例5
[0092]紫薇葉片于2103年10底采集于陜西楊凌；
[0093]步驟1:
[0094]將紫薇葉片組織從-80°C的超低溫冰箱中取出，稱取0.6g，用剪刀把組織剪碎并保持植物組織一直呈冰凍狀態，得到剪碎的植物組織；
[0095]步驟2:
[0096]在步驟I剪碎的植物組織中直接加入0.6g相對分子質量為45000-55000的PVP粉末，在液氮中研磨破碎紫薇植物組織，將研磨后的粉末轉移到5個1.5mL滅菌的離心管中，每個離心管中加入ImL預熱至65°C的CTAB提取液(CTAB提取液組成為:pH8.0的IOOmMTris-HCl，1.4mol/L NaCl, 4% CTAB, ρΗ8.0 的 20m MEDTA 和 2%2_ 巰基乙醇，2-巰基乙醇使用前再加入)，65°C水浴保溫lOOmin，水浴保溫期間每隔IOmin搖動一次離心管，使研磨后的粉末與提取液充分混勻以達到破碎植物細胞膜的目的，得到植物組織液；
[0097]步驟3:
[0098]將步驟2得到的植物組織液冷卻至室溫后以12000r/min的轉速離心處理lOmin，將上清液轉移至另一滅菌的離心管中，加入與上清液等體積的有機溶劑(體積比為24:1的氯仿與異戊醇)用手輕輕搖動混勻，靜置IOmin后再以相同轉速離心處理IOmin ；
[0099]步驟4:
[0100]將步驟3離心處理后得到的上清液再轉移至另一無菌離心管中，加入上清液1/10體積的3M的醋酸鈉和2/3體積的- 20°C異丙醇，于_20°C沉淀60min，得到沉淀液；[0101]步驟5:
[0102]將步驟4所得沉淀液在4°C下以12000r/min的轉速離心處理IOmin,棄上清液,將沉淀物用體積濃度為70%的酒精洗三次，自然晾干，然后加入50 μ L TE緩沖液(TE緩沖液組成為:ρΗ8.0的IOmM Tris-HCl和ρΗ8.0的ImM EDTA)，放置于4°C的溫度環境中使沉淀物充分溶解，得到紫薇總DNA。
[0103]本發明提取的DNA質量與含量的評價:
[0104]1.用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測植物的總DNA的質量:觀察點樣孔附近是否有一條整齊并且沒有彌散的亮帶，如果有說明提取的DNA質量較好。
[0105]將本發明實施例1和實施例2提取的紫薇總DNA樣品與上樣緩沖液ΕΖ-Vision混勻點樣，經過30min電泳之后在紫外燈下照相，結果分別如圖1和圖2所示。如圖1所示，其中M為Marker2000，泳道I是本發明實施例1提取的紫薇總DNA的電泳圖；圖2中M為Marker2000，泳道I是本發明實施例2提取的紫薇總DNA的電泳圖，由圖1和圖2可以看出，在點樣孔的附近出現了很明亮的條帶，說明本方法提取的紫薇總DNA中沒有蛋白等雜質的污染；用瓊脂糖凝膠電泳后在點樣孔附近會有一條很亮的基因組DNA的條帶，說明提出的DNA質量很高，完整性較好。標準CTAB法提出的紫薇總DNA，因為其中含糖量太高導致黏度很大，在進行點樣時上樣緩沖液很難把多糖DNA的復合物沉降，基因組DNA無法跑出點樣孔規則的條帶，而用本發明中的方法提出的DNA不存在這樣的問題。
[0106]2.用分光光度計檢測提取植物總DNA的含量:如果比值OD (A260/280)和OD(A260/230)分別在1.8-2.0和1.8-2.2之間，說明DNA中沒有蛋白、多酚、多糖等雜質污染。
[0107]用本發明中的方法提出的紫薇莖DNA無色透明，吸取1μ I DNA樣品用分光光度計測量DNA的含量，PVP粉末與植物組織質量比為1:10時得到的DNA含量為519.8 μ g，DNA的0D(A260/230)比值分別是1.89，說明這個樣品中的DNA沒有被污染；紫薇葉片DNA含量在PVP粉末與葉片質量比為1:10時為236.3 μ g，OD (260/280)的值都在2.02。而用標準的CTAB法提出的DNA呈現黃色粘稠狀，用分光光度計檢測260nm/280nm的吸光值的比值遠遠低于1.80，曲線的走向也很不理想。
[0108]3.紫薇總DNA的RAPD-PCR的擴增
[0109]表1RAPD-PCR 的引物[0110]
【權利要求】
1.一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，將紫薇組織在低溫下剪碎，加入聚乙烯基吡咯烷酮粉末，在液氮中研磨后加入十六烷基三甲基溴化銨提取液水浴保溫，然后常溫下離心處理，取上清液加入等體積有機溶劑離心處理，將上清液進行沉淀后經離心、清洗、干燥等后處理得到紫薇總DNA。
2.如權利要求1所述的一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: 步驟1: 將紫薇組織從超低溫冰箱中取出，把組織剪碎并保持植物組織一直呈冰凍狀態，得到剪碎的植物組織； 步驟2: 在所述步驟I剪碎的植物組織中直接加入PVP粉末，在液氮中研磨破碎紫薇植物組織，將研磨后的粉末轉移到無菌離心管中，加入預熱的CTAB提取液，使研磨后的粉末完全浸沒，水浴保溫一定時間，水浴保溫期間每隔10-15min搖動一次離心管，使研磨后的粉末與提取液充分混勻，得到植物組織液； 步驟3: 將所述步驟2得到的植物組織液冷卻至室溫后以10000-12000r/min的轉速離心處理10min，將上清液轉移至另一滅菌的離心管中，加入與上清液等體積的有機溶劑用手輕輕搖動混勻，靜置5-10min后再以相同轉速離心處理IOmin ； 步驟4: 將所述步驟3離心處理后得到的上清液再轉移至另一無菌離心管中，加入上清液1/10體積的3M的醋酸鈉和2/3體積的冰的異丙醇，于低溫下沉淀，得到沉淀液； 步驟5: 將所述步驟4所得沉淀液在一定溫度下離心處理，棄上清液，將沉淀物用體積濃度為70%的酒精洗三次，自然晾干，然后加入TE緩沖液，放置于4°C的溫度環境中使沉淀物充分溶解，得到紫薇總DNA。
3.如權利要求2所述的一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，所述步驟I中超低溫冰箱溫度為_80°C。
4.如權利要求2所述的一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，所述步驟2中加入的PVP粉末與植物組織的質量比為1:1-10，所述PVP的相對分子質量為45000-55000。
5.如權利要求2所述的一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，所述步驟2中CTAB提取液的預熱的溫度為65°C，所述水浴溫度為65°C、保溫時間為30-120min。
6.如權利要求2所述的一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，所述步驟2中CTAB提取液組成為:pH8.0 的 IOOmM Tris-HCl, 1.4mol/L NaCl，4%CTAB，ρΗ8.0 的 20mM EDTA，和2%2-巰基乙醇，所述2-巰基乙醇使用前再加入。
7.如權利要求2所述的一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，所述步驟3中有機溶劑由體積比為24:1的氯仿與異戊醇組成。
8.如權利要求2所述的一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，所述步驟4中異丙醇溫度為_20°C，所述低溫為_20°C，沉淀時間不少于30min。
9.如權利要求2所述的一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，所述步驟5中離心處理轉速為10000-12000r/min、時間為lOmin、溫度為4°C。
10.如權利要求2所述的一種提取紫薇總DNA的方法，其特征在于，所述步驟5中TE緩沖液組成為:pH8.0 的1OmM Tris-HCl 與 ρΗ8.0 的 ImMEDTA0
【文檔編號】C12N15/10GK103834636SQ201410025817
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年1月20日 優先權日:2014年1月20日
【發明者】張 榮, 孫廣宇, 杜銀銀 申請人:西北農林科技大學