牦牛胴體性狀候選基因檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及動物生物【技術領域】中的牦牛分子標記輔助育種技術，具體涉及到牦牛胴體性狀候選基因檢測試劑盒及其測試方法。一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測試劑盒，包括有PCR反應液，ANK1*B的DNA標準樣；去離子水，10%過硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED，12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠Arc:Bis=37.5:1；所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍，0.025%二甲苯青，10mmol/L?EDTA?pH8.0。本發明的優點是反應靈敏、特異性強、易操作，適用于各級畜牧獸醫教學科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型牦牛養殖企業的生產性能的改良。
【專利說明】牦牛胴體性狀候選基因檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物生物【技術領域】中的牦牛分子標記輔助育種技術，具體涉及到牦牛胴體性狀候選基因檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]ANKl (Ankyrinl)基因屬錨蛋白基因家族(Ankyrins)，編碼的AnkR蛋白存在于肌肉中的肌原纖維之間和肌原纖維與肌膜之間，ANKl基因在人類醫學領域研究較多，人類ANKl基因啟動子區的堿基缺失與遺傳性球形紅細胞增多癥相關，在ANKl啟動子區域的堿基突變與日本人患2型糖尿病的易感度相關。ANKl基因與肌內脂肪關系的研究在豬和牛上有所報道，安格斯牛、夏洛來牛和利木辛牛ANKl基因1.1lkb的啟動子區域發現了 7個多肽位點，其中5個SNPs與肌肉嫩度和大理石花紋相關，兩個單倍型與肌肉嫩度相關；1個單倍型明顯與肌內脂肪和肉的多汁性相關。皮特蘭豬、杜洛克豬和大白豬ANKl基因啟動子761bp區域發現了 12個SNP，其中2個SNPs與肉質性狀顯著相關。I個SNP和I個單倍型與肌肉滴水損失相關而另一個SNP與肌內脂肪性狀相關，在大白豬中I個單倍型與肌內脂肪相關，單倍型3在皮特蘭中發現與失水率有關。單倍型5是與大白豬的肌內脂肪和肉質的滴水損失成正相關。豬ANKl基因3' UTR的一個SNP與肌肉剪切力、肌內脂肪及肌肉持水性相關。
[0003]ANKl基因已經成為肉質改良中最為主要的肉質候選基因之一。牛的ANKl基因圖譜已經繪制完成，此基因在牛的第27號染色體上，與肉質脂肪和大理石紋等數量性狀位點相鄰。豬的ANKl基因在17號染色體上，其緊鄰體重、背膘厚度和肌間脂肪等數量性狀位點。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測試劑盒。以解決快速、敏感性高、成本低，用于牦牛胴體性狀候選基因分子選種技術。
[0005]本發明的又一目的在于一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測方法。
[0006]通過PCR-SSCP對不同年齡和性別的牦牛個體ANKl基因第I外顯子-第I內含子區進行遺傳多態性分析，并測序群體內變異產生的各等位基因序列，結合胴體性狀相關的生產數據，確定對胴體性狀影響顯著的等位基因，為改善牦牛生產性能提供指導。
[0007]為實現上述目的，本發明采取的技術方案為:一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測引物， 其主要特點在于:
[0008]ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ ；
[0009]ANK1-R:5，-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3，。
[0010]一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測試劑盒，其主要特點在于包括有PCR反應液，ANKl^B的DNA標準樣；去離子水，10%過硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED, 12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠Arc:Bis=37.5:1；[0011]所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍，0.025% 二甲苯青，10mmol /T, EDTA pH8.0 ；(補充數量)
[0012]所述的PCR反應液的反應液:總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L，Mg2+濃度為2.5mM, dNTPs的終濃度為100 μ M，引物ANK1-F:
[0013]5’ -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ 和 ANK1-R:
[0014]5’ -TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’ 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U, l.0yL, ddH20 補充體積至20 μ L ;[0015]一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測方法，其主要特點在于，檢測步驟如下:
[0016](I)樣品采集:牦牛頸靜脈采血10ml，ACD抗凝，_20°C凍存；
[0017](2)基因組DNA的提取:用常規的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA ；
[0018](3)聚合酶鏈式反應:
[0019]PCR反應體系:總體積20yL，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L，Mg2+濃度為2.5mM, dNTPs 的終濃度為 100 μ M，引物 ANKl-F 和 ANKl-R 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U,模板DNA50ng，ddH20補充體積至20 μ L ;反應條件:預變性94°C 5min，變性94°C 30s，退火59°C 30s,延伸72°C 30s，共35個循環，最后延伸72°C 7min ；
[0020]引物序列為:
[0021 ] ANKl-F: 5，-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’
[0022]ANKl-R: 5，-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’
[0023](4 ) PCR 產物的 SSCP 檢測:
[0024]取2 μ I的PCR產物加入8 μ I的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍、0.025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA ρΗ8.0，98°C變性 lOmin，立即冰浴 IOmin ；12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，350V電壓條件下，4°C電泳22h，銀染法顯色后拍照；
[0025](5)結果判斷:
[0026]對牦牛ANKl基因第I外顯子-第I內含子的PCR-SSCP檢測，有5個等位基因，對牦牛胴體性狀具有影響的等位基因為ANK1*B;(對牦牛胴體性狀無影響的等位基因為ANK1*A。
[0027]控制牦牛胴體性狀的等位基因為ANK1*B的核苷酸序列ccttcacttggggaactcgtcccctctggacgcctcctccaggcagcacccctggctctgcaggactccagcacccaaactcagcagcaagcgcttggagtggccccccaccctactcacagcccaagggacccaaggagtggggccaggcttcccggctgagagcgggagagggcaccccagcaatctgtaggccccaggcaggcgcctcccctctgcttggctcctgggcccgatagcgcctgtgctgctgataaagcctcaaagggcctcgcagaggtgcggtggctccggcagcccgagacgtacccacagaccacggtgactgacctctgggacctgga ；
[0028]對牦牛肉嫩度無影響的ANK1*A核苷酸序列為:
[0029]cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaacggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtgo
[0030]所述的牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測試劑盒的使用方法，其步驟為:[0031](A)待檢牦牛基因組DNAl μ L/50ng與試劑盒中PCR擴增液混合，反應條件:預變性940C 5min，變性 94°C 30s，退火 59°C 30s，延伸 72°C 30s，共 35 個循環，最后延伸 72°C 7min ；
[0032](B)用步驟(A)中擴增的PCR產物和ANK1*B的DNA標準樣與試劑盒中SSCP檢測試劑各組分混合進行SSCP檢測；
[0033](C)步驟(B)中檢測到的帶型與ANK1*B標準樣帶型一致的樣品為攜帶控制牦牛胴體性狀等位基因的個體。
[0034]本發明的有益效果:反應靈敏、特異性強、易操作，適用于各級畜牧獸醫教學科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型牦牛養殖企業的生產性能的改良。
[0035]本發明利用PCR-SSCP對不同年齡和性別的牦牛個體ANKl基因第I外顯子-第I內含子區進行遺傳多態性分析，并測序群體內變異產生的各等位基因序列，結合胴體性狀相關的生產數據，確定胴體生產性狀的等位基因，為改善牦牛生產性能提供指導。本發明通過對試驗牦牛ANKl基因第I外顯子-第I內含子區的SSCP分析，發現了 5個(A、B、C、D和E)等位基因。其中，A、C、D和E等位基因對牦牛胴體性狀影響不顯著。
[0036]本發明對牦牛胴體性狀的分子標記選種具有快速、敏感性高、成本低等特點。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0037]圖1是牦牛ANKl基因第I外顯子-第I內含子區的PCR-SSCP檢測凝膠圖。【具體實施方式】
[0038]以下結合實施例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。下面以甘南牦牛胴體性狀分子選種技術的建立為例，對本發明的內容進行詳細的說明。
[0039]實施例1:一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測引物，其主要特點在于:
[0040]ANK1-F:5，-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ ；
[0041 ] ANKl-R: 5，-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’。
[0042]實施例2:—種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測試劑盒，包括有PCR反應液，ANK1*B的DNA標準樣；去離子水，10%過硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED, 12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠Arc:Bis=37.5:1；
[0043]所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍，0.025% 二甲苯青，10mmol /T, EDTA pH8.0 ；
[0044]所述的PCR反應液的反應液:總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L，Mg2+濃度為2.5mM, dNTPs的終濃度為100 μ M，引物ANK1-F:
[0045]5， -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ 和 ANK1-R:
[0046]5’ -TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’ 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U, l.0yL, ddH20 補充體積至20 μ L ;
[0047]所述的ΑΝΚ1*Β的DNA標準樣的核苷酸序列為:
[0048]
【權利要求】
1.一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測引物，其特征在于:
ANK1-F:5’ -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ ；
ANK1-R:5， -TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3，。
2.一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測試劑盒，其特征在于包括有PCR反應液，ANK1*B的DNA標準樣；去離子水，10%過硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED, 12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠Arc:Bis=37.5:1； 所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍，0.025% 二甲苯青，IOmmoI/L EDTA pH8.0 ； 所述的PCR反應液的反應液:總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L，Mg2+濃度為2.5mM, dNTPs的終濃度為100 μ M，引物ANK1-F:
5’ -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ 和 ANKl-R:
5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’ 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U, ddH20 補充體積至 20 μ L。
3.一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測方法，其特征在于，檢測步驟如下: (1)樣品采集:牦牛頸靜脈采血10ml，A⑶抗凝，-20°c凍存； (2)基因組DNA的提取:用常規的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA； (3)聚合酶鏈式反應:` PCR反應體系:總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L, Mg2+濃度為2.5mM,dNTPs的終濃度為100 μΜ,引物ANKl-F和ANKl-R各0.1 μ M，Taq聚合酶0.5U,模板DNA50ng, ddH20補充體積至20 μ L ;反應條件:預變性94 V 5min，變性94 °C 30s，退火59°C 30s，延伸72 °C 30s，共35個循環，最后延伸72°C 7min ； 引物序列為:
ANK1-F:5’ -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ ；
ANK1-R:5， -TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3，； (4)PCR產物的SSCP檢測: 取2 μ I的PCR產物加入8 μ I的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍、0.025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA ρΗ8.0，98°C變性 lOmin，立即冰浴 IOmin ；12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，350V電壓條件下，4°C電泳22h，銀染法顯色后拍照； (5)結果判斷: 對牦牛ANKl基因第2內含子的PCR-SSCP檢測，有5個等位基因，控制牦牛胴體性狀的等位基因為ANKl*B; 對牦牛胴體性狀無影響的等位基因為ANK1*A。
4.如權利要求2所述的牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測試劑盒的使用方法，其特征在于步驟為: (A)待檢牦牛基因組DNAlμ L/50ng與試劑盒中PCR擴增液混合，反應條件:預變性940C 5min,變性 94°C 30s，退火 59°C 30s,延伸 72°C 30s，共 35 個循環，最后延伸 72°C 7min ； (B)用步驟(A)中擴增的PCR產物和ANK1*B的DNA標準樣與試劑盒中SSCP檢測試劑各組分混合進行SSCP檢測； (C)步驟(B)中檢測到的帶型與ANK1*B標準樣帶型一致的樣品為攜帶控制牦牛胴體性狀等位基因的個體。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866001SQ201410023938
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】胡江, 羅玉柱, 劉秀, 李少斌, 潘紅梅 申請人:甘肅農業大學