一種無(wú)物種限制的條件性基因敲除用中間載體及其制備方法和用途

一種無(wú)物種限制的條件性基因敲除用中間載體及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種無(wú)物種限制的動(dòng)物條件性基因敲除方法。本發(fā)明提供了一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用的中間載體及其制備方法。利用該中間載體制備用于基因敲除的載體并實(shí)現(xiàn)基因敲除。該方法步驟簡(jiǎn)單、可一次性實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除、可進(jìn)行多基因的條件性基因敲除，且消耗低。
【專利說(shuō)明】一種無(wú)物種限制的條件性基因敲除用中間載體及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種無(wú)物種限制的動(dòng)物條件性基因敲除方法。
【背景技術(shù)】
[0002]條件性基因敲除(conditional gene knockout)技術(shù)是一種條件性定點(diǎn)改變生物體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)方法?，F(xiàn)有的技術(shù)包括:
一、傳統(tǒng)策略
傳統(tǒng)的條件性基因敲除主要是通過(guò)Cre / 1xP或者Ftp / FRT (主要是Cre / 1xP)重組系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)的。Cre / 1xP含有兩種成分:(I)一段長(zhǎng)34bp的DNA序列,包含兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8 bp的核心序列。這段34bp序列是Cre重組酶識(shí)別的位點(diǎn)，即1xP位點(diǎn)；(2)Cre重組酶,它是一種由343個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，可以介導(dǎo)1xP位點(diǎn)的DNA重組。任何序列的DNA，當(dāng)其位于兩個(gè)1xP位點(diǎn)之間的時(shí)候，在Cre重組酶的作用下或者發(fā)生缺失(兩個(gè)1xP位點(diǎn)的方向相同)，或者發(fā)生方向倒轉(zhuǎn)(兩1xP位點(diǎn)的方向相反)，從而使靶基因發(fā)生條件性缺失，即在動(dòng)物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官發(fā)生缺失。
[0003]以小鼠為例，利用Cre / 1xP系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因敲除包括:(I)在體外構(gòu)建一個(gè)在目的基因兩端分別含有一個(gè)1xP位點(diǎn)的基因序列；(2)將體外構(gòu)建好的這段基因序列轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)，使其通過(guò)同源重組替代細(xì)胞基因組內(nèi)原來(lái)的基因序列；(3)將經(jīng)過(guò)處理的胚胎干細(xì)胞被重新植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育成為一個(gè)完整的胚胎，最終成為一只基因工程小鼠。
[0004]這種方式的條件性基因敲除具有幾個(gè)特點(diǎn):(I)周期長(zhǎng):整個(gè)過(guò)程需要I一2年時(shí)間；(2)花費(fèi)大:公司服務(wù)一般需要15萬(wàn)人民幣；(3)只限于小鼠，有大鼠的報(bào)道，但不普及:只有小鼠的胚胎干細(xì)胞具有足夠的同源重組效率，以滿足構(gòu)建含有1xP位點(diǎn)的基因序列；只有小鼠的胚胎干細(xì)胞才能通過(guò)形成配子傳代，得到穩(wěn)定的基因小鼠；(4)基因敲除需要分別位于雙鏈DNA上的兩份基因編碼DNA序列同時(shí)敲除才能實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)方法通常只能在一條染色體上實(shí)現(xiàn)同源重組，實(shí)現(xiàn)兩條DNA鏈同時(shí)敲除需要進(jìn)行細(xì)胞上的二次重組或個(gè)體的交配才能完成；(5)由于Cre / 1xP系統(tǒng)介導(dǎo)1xP位點(diǎn)間的重組，當(dāng)多個(gè)目的基因兩端分別含有一個(gè)1xP位點(diǎn)的基因序列時(shí)，易于發(fā)生多1xP位點(diǎn)間的交叉重組，因而不易進(jìn)行多基因的條件性敲除。
[0005]二、核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的同源重組策略
另外一類條件性基因敲除的策略是利用一類可以編輯的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行，這類核酸內(nèi)切酶包括鋅指核酸酶(ZFN)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù)，以及規(guī)律成族間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromicrepeat; CRISPR-associated , CRISPR/Cas9),可以識(shí)別特定的DNA序列，并進(jìn)行切割造成雙鏈DNA斷裂(Double-strand breaks, DSB),在沒(méi)有模板的條件下,發(fā)生非同源重組末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ),造成移碼突變(frameshift mutation)導(dǎo)致的基因敲除；在提供模板的條件下，由于DSB促進(jìn)同源重組，大大提高同源重組效率而發(fā)生同源重組修復(fù)。如果提供兩端分別含有一個(gè)1xP位點(diǎn)的同源序列，可以用于條件性基因敲除。
[0006]ZFN是由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。DNA識(shí)別域是由一系列Cys2-His2鋅指蛋白(zinc-fingers)串聯(lián)組成(一般3~4個(gè)),每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。多個(gè)鋅指蛋白可以串聯(lián)起來(lái)形成一個(gè)鋅指蛋白組識(shí)別一段特異的堿基序列，與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內(nèi)切酶是來(lái)自FokI的C端的96個(gè)氨基酸殘基組成的DNA剪切域。FokI是來(lái)自海床黃桿菌的一種限制性內(nèi)切酶，只在二聚體狀態(tài)時(shí)才有酶切活性，每個(gè)FokI單體與一個(gè)鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個(gè)ZFN，識(shí)別特定的位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)相距恰當(dāng)?shù)木嚯x時(shí)(6~8 bp)，兩個(gè)單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能。從而達(dá)到 DNA定點(diǎn)剪切的目的。[0007]TALEN技術(shù)是利用植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白一_即激活因子樣效應(yīng)物(TAL effectors, TALEs)能夠識(shí)別特異性DNA堿基對(duì)的功能，設(shè)計(jì)一串合適的TALEs來(lái)識(shí)別和結(jié)合到任何特定序列，再在TALEs后附加一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，構(gòu)建出TALEN，從而實(shí)現(xiàn)了在特定位點(diǎn)切斷DNA雙鏈。
[0008]CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在于大多數(shù)的細(xì)菌和幾乎所有的古細(xì)菌中。Cas9是一種內(nèi)切酶，在sgRNA (single-guide-RNA)的特異性介導(dǎo)下,對(duì)特異的DNA序列進(jìn)行切割。
[0009]不過(guò)，(I)這類可以編輯的核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的同源重組效率并不高；(2)到目前為止，無(wú)論是ZFN還是TALEN，對(duì)其識(shí)別序列都有很多要求，無(wú)法實(shí)現(xiàn)靶向每一種可能的DNA序列；(3)組裝ZFN或TALEN蛋白也是一個(gè)耗時(shí)、耗力且花費(fèi)很高的過(guò)程，人們一直都沒(méi)有一種低成本的而且公開(kāi)能夠獲得的方法來(lái)快速地產(chǎn)生大量的ZFNs或TALENs ; (4)基因敲除需要分別位于雙鏈DNA上的兩份基因編碼DNA序列同時(shí)敲除才能實(shí)現(xiàn)。本方法也只能在一條染色體上實(shí)現(xiàn)同源重組，實(shí)現(xiàn)兩條染色體同時(shí)敲除需要進(jìn)行細(xì)胞上的二次重組或個(gè)體的交配才能完成；(5)同樣使用了 Cre / 1xP系統(tǒng)，也易于發(fā)生多1xP位點(diǎn)間的交叉重組，因而不易進(jìn)行多基因的條件性敲除。
[0010]參考文獻(xiàn):
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【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)已有方法實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除存在耗時(shí)、耗力、成本高，不容易進(jìn)行兩條染色體上的等位基因的一次性敲除，以及不能同時(shí)進(jìn)行多基因的條件性敲除等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用的中間載體。利用該載體進(jìn)行的基因敲除，方法步驟簡(jiǎn)單、可一次性實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除、可進(jìn)行多基因的條件性基因敲除，且消耗低。
[0012]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用中間載體。該中間載體pU6-sgRNA-Ubc-Cas9(序列如序列表SEQ ID N0.20所示；載體結(jié)構(gòu)如圖5所示)含有:1、利用II s型限制性內(nèi)切酶BsmBI切割形成不同粘性末端可將多個(gè)U6 promoter調(diào)控sgRNA表達(dá)的片段一次性連接進(jìn)載體中，為開(kāi)源系統(tǒng)。此載體還包含有UbC promoter調(diào)控的Cas9,但特點(diǎn)在于在UbC promoter與Cas9之間有一個(gè)被雙1xp包含的dsRed,在未加入ere刪除1xp包含區(qū)域的情況下只有dsRed表達(dá),在加入ere刪除dsRed之后Cas9才開(kāi)始表達(dá)；2、插入多個(gè)U6 promoter調(diào)控sgRNA表達(dá)的片段的區(qū)域使用II s型限制性內(nèi)切酶BsmBI切割，形成5’ ACCG 3’和5’ GTTT 3’兩個(gè)不同的粘性末端。
[0013]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備上述的基因打靶用中間載體的方法。該方法包括以下步驟:
1、利用限制性內(nèi)切酶NotI和SacI,由pUbC-loxp-dsRed-loxp-gfp載體(序列如序列表SEQ ID N0.21所示；載體結(jié)構(gòu)如圖6所示)雙酶切獲得線性質(zhì)粒；將Back up和Backdown的混合退火產(chǎn)物(序列如序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示)與上述線性質(zhì)粒連接獲得pUbC-loxp-dsRed-loxp載體(序列如序列表SEQ ID N0.22所示；載體結(jié)構(gòu)如圖7所示)。
[0014]2、由pUbC-loxp-dsRed-loxp載體，使用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切獲得1268bp和8325bp的兩段序列，對(duì)8325bp這段序列做去磷酸化處理，然后連接1268bp和8325bp這兩段序列獲得PUbC-1載體。
[0015]3、由pUbC-Ι載體，使用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切，獲得9553bp片段的線性載體。將該線性載體與Cas9 inser up和Cas9 inser down的混合退火產(chǎn)物(序列如序列表SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示)連接獲得pUbC_2載體。
[0016]4、由pUbC-2質(zhì)粒(載體)，使用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切，獲得線性載體并對(duì)其做去磷酸化處理。將該線性載體和SpeI prom up和SpeI prom down的混合退火產(chǎn)物(序列如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示)連接獲得pUbC_3載體。
[0017]5、由pGL3_multi sgRNA載體(序列如序列表SEQ ID N0.23所示；載體結(jié)構(gòu)如圖8所示)，使用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，獲得5508bp片段的線性載體。將MCS up和MCSdown的混合退火產(chǎn)物(序列如序列表SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示)與該線性載體連接獲得pGL3_multi sgRNA modi載體。由pGL3_multi sgRNA modi載體,使用限制性內(nèi)切酶ApaI和SacI雙酶切，獲得4586bp的線性載體。
[0018]6、以 pGL3_multi sgRNA modi 載體為模板,使用 deSall Foi^PdeSalI Rev 引物進(jìn)行PCR (引物序列分別如序列表SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示)，獲得約500bp的PCR產(chǎn)物(序列如序列表SEQ ID N0.24所示)。將上述PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶ApaI和SacI雙酶切，獲得酶切產(chǎn)物(序列如序列表SEQ ID N0.25所示)。將該酶切產(chǎn)物與步驟5所獲得的4586bp的線性載體進(jìn)行連接獲得pGL3-multi sgRNA final載體。
[0019]7、由pUbC-3載體，使用限制性內(nèi)切酶MluI酶切，獲得線性載體并做去磷酸化處理。以pGL3_multi sgRNA final載體為模板，使用U6 For和U6 Rev引物PCR (序列如序列表SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示)，獲得約450bp的PCR產(chǎn)物(序列如序列表SEQID N0.26所示)。對(duì)該450bp的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MluI酶切，獲得酶切產(chǎn)物(序列如序列表SEQ ID N0.27所示)。將該酶切產(chǎn)物與pUbC_3載體經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶MluI酶切并去磷酸化所獲得的線性載體連接獲得PU6-sgRNA-UbC載體。
[0020]、由pU6-sgRNA_UbC載體使用限制性內(nèi)切酶AgeI和KpnI雙酶切獲得10069bp的線性載體。以pstl374-nls-flag-cas9_zf載體(序列如序列表SEQ ID N0.28所示)為模板，使用Cas9 For和Cas9 Rev引物PCR (序列分別如序列表SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示)獲得4k bp的PCR產(chǎn)物(序列如序列表SEQ ID N0.29所示)，使用限制性內(nèi)切酶AgeI和KpnI雙酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物獲得酶切PCR片段(序列如序列表SEQ ID N0.30所示)。將該酶切PCR片段與pU6-sgRNA-UbC載體經(jīng)過(guò)AgeI和KpnI雙酶切獲得10069bp的線性載體連接獲得用于基因敲除的中間載體pU6-sgRNA-UbC-Cas9 (序列如序列表SEQ ID N0.20所示；載體結(jié)構(gòu)如圖5所示)。
[0021]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了上述基因敲除用中間載體在制備基因敲除載體中的用途。
[0022]本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了一種制備基因敲除載體的方法，該方法包括以下步驟:
1、由中間載體pU6-sgRNA-UbC-Cas9，使用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，回收獲得14276bp的線性載體。
[0023]2、按照不同的基因 敲除對(duì)象和不同的個(gè)體或者細(xì)胞，將特定的目標(biāo)sgRNA與上述回收的14276bp長(zhǎng)的pU6-sgRNA-UbC-Cas9線性載體進(jìn)行連接，獲得條件性過(guò)表達(dá)sgRNA/Cas9載體(載體結(jié)構(gòu)如圖9所示)。
[0024]3、將條件性過(guò)表達(dá)sgRNA/Cas9載體導(dǎo)入細(xì)胞(如果是在細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)基因敲除的話)或者個(gè)體原核內(nèi)(如果是在個(gè)體原核水平實(shí)現(xiàn)基因敲除的話)。在需要的時(shí)候加入Cre(序列如序列表SEQ ID N0.31所示)或CreERT2 (序列如序列表SEQ ID N0.32所示)表達(dá)載體(如果是在細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)基因敲除的話)，或者和Cre或CreERT2表達(dá)小鼠系交配(如果是在小鼠水平實(shí)現(xiàn)基因敲除的話)，通過(guò)Cre/Loxp系統(tǒng)將控制Cas9表達(dá)的紅色熒光蛋白(dsRed)和終止序列(STOP)剔除，使得Cas9表達(dá)并實(shí)現(xiàn)sgRNA介導(dǎo)的基因組特異序列的切割。
[0025]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(O簡(jiǎn)單。采用本發(fā)明的方法，只需要構(gòu)建條件性過(guò)表達(dá)Cas9和sgRNA載體；
(2)條件性多基因組多位點(diǎn)敲除。采用本發(fā)明的方法，可以同時(shí)對(duì)多基因進(jìn)行條件性敲除，實(shí)現(xiàn)條件性多基因基因組改造的目的；
(3)—次性實(shí)現(xiàn)基因敲除。采用本發(fā)明的方法，經(jīng)過(guò)條件性表達(dá)的Cas9對(duì)位于雙鏈DNA上的兩份基因編碼DNA序列同時(shí)剪切，一次性達(dá)到基因敲除的目的；
(4)使用更方便、費(fèi)用更低、耗時(shí)更少。以前的條件性基因敲除都需要針對(duì)不同的靶點(diǎn)構(gòu)建一個(gè)在目的基因兩端分別含有一個(gè)1xP位點(diǎn)的基因序列；或需要構(gòu)建特異靶點(diǎn)的ZFN或是TALEN耗時(shí)耗力且費(fèi)用高；或需要進(jìn)行一系列的細(xì)胞內(nèi)篩選，等。本發(fā)明的方法中，只需改變很短的sgRNA表達(dá)序列就可以實(shí)現(xiàn)不同位點(diǎn)的特異性條件性敲除，極大地降低了成本；
(5)采用本發(fā)明的方法無(wú)物種限制，可以針對(duì)任何能進(jìn)行原核注射的物種。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1條件性過(guò)表達(dá)Cas9實(shí)現(xiàn)條件性定點(diǎn)剪切導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂過(guò)程示意圖。
[0027]CRISPR/Cas9系統(tǒng)的定向識(shí)別和剪切從而導(dǎo)致基因敲除是通過(guò)sgRNA和Cas9實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)條件性表達(dá)Cas9進(jìn)而條件性調(diào)節(jié)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的定向識(shí)別和剪切，實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除。首先，將sgRNA和不同類型的Cas9 (WT:野生型；D10A:突變型；dead:失活型)序列導(dǎo)入到載體內(nèi)，sgRNA用U6啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，Cas9用Ubc啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，在Ubc和Cas9序列之間插入了兩端分別含有一個(gè)1xP位點(diǎn)的紅色突光蛋白(dsRed)和終止序列(STOP)。整個(gè)sgRNA和Cas9表達(dá)片斷兩端分別含有一段絕緣序列(insulator)以保證sgRNA和Cas9的穩(wěn)定插入和表達(dá)。Cre酶介導(dǎo)重組之前,sgRNA正常表達(dá),但由于終止序列的作用，只表達(dá)紅色熒光蛋白，不表達(dá)Cas9，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不發(fā)生作用；加入Cre重組酶發(fā)生重組后，兩個(gè)1xP位點(diǎn)之間的紅色熒光蛋白編碼序列和終止序列(STOP)被重組剪切，Cas9及其后面的綠色熒光蛋白表達(dá)；這樣Cas9和sgRNA結(jié)合發(fā)生作用，介導(dǎo)定向識(shí)別和剪切從而導(dǎo)致基因敲除。
[0028]圖2條件性過(guò)表達(dá)Cas9載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光照片。
[0029]利用lipofactamine2000將帶有條件性表達(dá)Cas9和sgRNA的質(zhì)粒和空載pCAG質(zhì)?；虮磉_(dá)Cre重組酶的pCAG-Cre質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，72小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。共轉(zhuǎn)PCAG的細(xì)胞大多顯示紅色熒光，而共轉(zhuǎn)pCAG-Cre的細(xì)胞大多顯示綠色熒光。
`[0030]圖3 T7EN1酶切鑒定sgRNA/Cas9介導(dǎo)的基因位點(diǎn)特異性c_Maf和MafB切割。
[0031]以提取的細(xì)胞基因組為模板，使用c-Maf For和c-Maf Rev7MafB For和MafB Rev引物PCR，PCR產(chǎn)物約Ik bp,純化PCR產(chǎn)物。將上述PCR產(chǎn)物取200ng退火，使用T7EN1酶切鑒定，電泳。如果發(fā)生DNA鏈切割，DNA雙鏈退火過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)配，T7EN1將錯(cuò)配鏈切斷，出現(xiàn)切割條帶。如圖所示，加入針對(duì)c-Maf和MafB sgRNA的樣品都出現(xiàn)了切割條帶，表明細(xì)胞基因組的c-Maf和MafB發(fā)生了切割。
[0032]圖4 sgRNA/Cas9介導(dǎo)的基因位點(diǎn)特異性c_Maf和MafB切割結(jié)果測(cè)序。
[0033]以提取的細(xì)胞基因組為模板，使用c-Maf For和c_Maf Rev7MafB For和MafB Rev引物PCR，PCR產(chǎn)物約Ik bp。純化PCR產(chǎn)物，進(jìn)行TA克隆，并送測(cè)序。下劃線綠色序列為PAM序列；紅色標(biāo)記靶向序列；突變?yōu)樗{(lán)色標(biāo)記小寫序列；(_)表示剔出；(+)表示插入；(m)
表示突變。
[0034]圖5 載體 pU6-sgRNA-UbC_Cas9 的結(jié)構(gòu)。
[0035]圖6 載體 pUbC-loxp-dsRed-loxp-gfp 的結(jié)構(gòu)。
[0036]圖7 載體 pUbC-loxp-dsRed-loxp 的結(jié)構(gòu)。
[0037]圖8 載體 pGL3_multi sgRNA 的結(jié)構(gòu)。[0038]圖9條件性過(guò)表達(dá)載體sgRNA/Cas9的結(jié)構(gòu)。
[0039]圖 10 載體 pstl374-nls-flag-cas9_zf 的結(jié)構(gòu)。
[0040]圖11 載體 pU57-sgRNA_U6 的結(jié)構(gòu)。
[0041]圖 12 載體 pU6_Maf sgRNA_UbC_Cas9 的結(jié)構(gòu)。
[0042]【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步介紹。本實(shí)施例以細(xì)胞水平條件性敲除c-Maf和MafB為例對(duì)一種無(wú)物種限制無(wú)生物安全性問(wèn)題的真核生物基因打靶方法做介紹:
實(shí)施例1中間載體pU6-sgRNA-UbC_Cas9的制備 一、pUbC-loxp-dsRed-loxp 載體制備
1.pUbC-loxp-dsRed-loxp-gfp載體(序列如序列表SEQ ID N0.21所示，結(jié)構(gòu)如圖6所示)使用限制性內(nèi)切酶NotI和SacI雙酶切，載體上有I個(gè)NotI位點(diǎn)和I個(gè)SacI位點(diǎn)，酶切后的片段長(zhǎng)度為734bp和9698bp。電泳，切膠回收9698bp片段。
[0043]2.將 Back up 和 Back down(序列如序列表 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所不)
雙寡聚核苷酸等摩爾量混合，退火，形成DNA雙鏈。
[0044]3.將Back up和Back down的混合退火產(chǎn)物與回收的9698bp片段使用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化Trans 5 α感受態(tài)細(xì)菌,涂于帶有氨節(jié)抗性的瓊脂板。
`[0045]4.挑細(xì)菌克隆搖菌，使用SpeI seq2測(cè)序引物測(cè)序，正確連接產(chǎn)物pUbC-loxp-dsRed—loxp。
[0046]5.提取足量的pUbC-loxp-dsRed-loxp質(zhì)粒(載體)，即獲得pUbC-loxp-dsRed-loxp 載體。
[0047]二、pUbC-Ι 載體制備
6.pUbC-loxp-dsRed-loxp載體使用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切，載體上有3個(gè)SpeI位點(diǎn)，酶切后的片段長(zhǎng)度為126bp，1268bp和8325bp。電泳，切膠回收1268bp片段和8325bp片段。
[0048]7.對(duì)8325bp片段使用去磷酸酶處理以防止自連，之后純化。
[0049]8.將去磷酸化處理后的8325bp片段和回收后的1268bp片段使用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化Trans 5 α感受態(tài)細(xì)菌,涂于帶有氨節(jié)抗性的瓊脂板。
[0050]9.挑細(xì)菌克隆搖菌，使用SpeI seql和SpeI seq2測(cè)序引物測(cè)序(序列如序列表SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示)，得到正確連接產(chǎn)物pUbC-Ι。
[0051]10.提取足量的pUbC-Ι質(zhì)粒(載體)。
[0052]三、pUbC-2載體制備
I1.PUbC-Ι載體使用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切，載體上有I個(gè)BamHI位點(diǎn)和I個(gè)SacI位點(diǎn)，酶切后的片段長(zhǎng)度為48bp和9553bp。電泳，切膠回收9553bp片段。
[0053]12.將Cas9 inser up和Cas9 inser down雙寡聚核苷酸等摩爾量混合(序列如序列表SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示)，退火，形成DNA雙鏈。
[0054]13.將Cas9 inser up和Cas9 inser down的混合退火產(chǎn)物與回收的9553bp片段使用T4連接酶連接,轉(zhuǎn)化Trans 5 α感受態(tài)細(xì)菌,涂于帶有氨節(jié)抗性的瓊脂板。
[0055]14.挑細(xì)菌克隆搖菌，使用SpeI seq2測(cè)序引物測(cè)序，得到正確連接產(chǎn)物pUbC_2。[0056]15.提取足量的pUbC-2質(zhì)粒(載體)。
[0057]三、pUbC-3載體制備
16.pUbC-2載體使用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切，載體上有I個(gè)SpeI位點(diǎn)，線性化。
[0058]17.回收線性化片段，對(duì)回收后的片段使用去磷酸酶處理以防止自連，之后純化。
[0059]18.將SpeI prom up和SpeI prom down雙寡聚核苷酸等摩爾量混合(序列如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示)，退火，形成DNA雙鏈。
[0060]19.將SpeI prom up和SpeI prom down的混合退火產(chǎn)物與第去磷酸酶處理后的線性化pUbC-2片段使用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化Trans 5 α感受態(tài)細(xì)菌，涂于帶有氨芐抗性的瓊脂板。
[0061]20.挑細(xì)菌克隆搖菌，使用SpeI seql測(cè)序引物測(cè)序，得到正確連接產(chǎn)物pUbC_3。
[0062]21.提取足量的pUbC-3質(zhì)粒(載體)。
[0063]四、pGL3_multisgRNA final 載體制備
22.pGL3-multi sgRNA載體(序列如序列表SEQ ID N0.23所示；載體結(jié)構(gòu)如圖8所示)使用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，載體上有3個(gè)BsmBI位點(diǎn)，酶切后的片段長(zhǎng)度為553bp，917bp和5508bp。電泳，切膠回收5508bp片段。
[0064]23.將MCS up和MCS down雙寡聚核苷酸等摩爾量混合(序列如序列表SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示)，退火，形成DNA雙鏈。
[0065]24.將MCS up和MCS down的混合退火產(chǎn)物與回收后的5508bp片段使用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化Trans 5 α感受態(tài)細(xì)菌,涂于帶有氨節(jié)抗性的瓊脂板。
[0066]25.挑細(xì)菌克隆搖菌，使用U6 Rev測(cè)序引物測(cè)序，正確連接得產(chǎn)物pGL3_multisgRNA modi。
[0067]26.提取足量的 pGL3_multi sgRNA modi 質(zhì)粒(載體)。
[0068]27.以 pGL3_multi sgRNA modi 載體為模板，使用 deSall Foi^PdeSalI Rev 引物PCR (引物序列分別如序列表SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示)，PCR產(chǎn)物約500bp，純化PCR產(chǎn)物。
[0069]28.將純化后的PCR片段使用限制性內(nèi)切酶ApaI和SacI雙酶切，純化酶切產(chǎn)物。
[0070]29.pGL3-multi sgRNA modi載體使用限制性內(nèi)切酶ApaI和SacI雙酶切，載體上有2個(gè)ApaI位點(diǎn)和SacI位點(diǎn)，酶切后的片段長(zhǎng)度為211bp，867bp和4586bp。電泳，切膠回收4586bp片段。
[0071]30.將上述回收的500bp PCR產(chǎn)物與回收的pGL3_multi sgRNA modi載體4586bp片段使用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化Trans 5α感受態(tài)細(xì)菌，涂于帶有氨芐抗性的瓊脂板。
[0072]31.挑細(xì)菌克隆搖菌，使用deSal seq測(cè)序引物測(cè)序，得到正確連接產(chǎn)物pGL3_multi sgRNA final。
[0073]32.提取足量的 pGL3_multi sgRNA final 質(zhì)粒(載體)。
[0074]五、pU6-sgRNA-UbC載體制備
33.以pGL3_multi sgRNA final載體為模板，使用U6 For和U6 Rev引物PCR (序列如序列表SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示)，PCR產(chǎn)物約450bp，純化PCR產(chǎn)物。
[0075]34.上述純化后的PCR片段使用限制性內(nèi)切酶MluI酶切，純化酶切產(chǎn)物。
[0076]35.pUbC-3載體使用限制性內(nèi)切酶MluI酶切，載體上有I個(gè)MluI位點(diǎn)，線性化。[0077]36.回收線性化片段，對(duì)回收后的片段使用去磷酸酶處理以防止自連，之后純化。
[0078]37.將上述酶切回收的PCR產(chǎn)物與去磷酸酶處理后的線性化pUbC-3片段使用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化Trans 5 α感受態(tài)細(xì)菌,涂于帶有氨節(jié)抗性的瓊脂板。
[0079]38.挑細(xì)菌克隆搖菌，使用MluI seq測(cè)序引物測(cè)序，正確連接得產(chǎn)物pU6-sgRNA-UbC0
[0080]39.提取足量的pU6-sgRNA_UbC質(zhì)粒(載體)。
[0081]六、pU6-sgRNA-UbC_Cas9載體制備
40.以 pstl374_nls-flag_cas9_zf(序列如序列表 SEQ ID N0.28 所不，結(jié)構(gòu)如圖 10所示)載體為模板，使用Cas9 For和Cas9 Rev引物PCR (序列分別如序列表SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示)，PCR產(chǎn)物約4k bp,純化PCR產(chǎn)物。
[0082]41.上述純化后的PCR片段使用限制性內(nèi)切酶AgeI和KpnI雙酶切，純化酶切產(chǎn)物。
[0083]42.pU6-sgRNA_UbC載體使用限制性內(nèi)切酶AgeI和KpnI雙酶切，載體上有I個(gè)AgeI位點(diǎn)和I個(gè)KpnI位點(diǎn)，酶切后的片段長(zhǎng)度為21bp和10069bp。電泳，切膠回收10069bp片段。
[0084]43.將上述酶切回收后的4k PCR產(chǎn)物與回收后的pU6-sgRNA_UbC 10069bp片段使用T4連接酶連接,轉(zhuǎn)化Trans 5 α感受態(tài)細(xì)菌,涂于帶有氨節(jié)抗性的瓊脂板。
[0085]44.挑細(xì)菌克隆搖菌，使用Cas9 seq和SpeI seq2測(cè)序引物測(cè)序(序列如序列表SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.4所示)，反向引物中間區(qū)域測(cè)通以保證無(wú)突變，正確連接得產(chǎn)物 pU6-sgRNA-UbC-Cas9。
[0086]45.提取足量的PU6-sgRNA-UbC-Cas9質(zhì)粒(載體)，即得中間載體PU6-sgRNA-UbC-Cas9 (序列如序列表SEQ ID N0.20所示；載體結(jié)構(gòu)如圖5所示)。
[0087]實(shí)施例2條件性過(guò)表達(dá)pU6_Maf sgRNA-UbC_Cas9載體的制備
1.中間載體pU6-sgRNA-UbC-Cas9使用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，載體上有2個(gè)BsmBI位點(diǎn)，酶切后的片段長(zhǎng)度為25bp和14276bp。電泳，切膠回收14276bp片段。
[0088]2.以pU57-sgRNA-U6 (序列如序列表SEQ ID N0.33所示，結(jié)構(gòu)如圖11所示)載體為模板，分別使用 Maf-arr-Forl 和 Maf-arr-Revl, Maf-arr_For2 和 Maf-arr_Rev2,Maf-arr-For3 和 Maf-arr-Rev3, Maf-arr-For4 和 Maf-arr-Rev4, Maf-arr-For5 和Maf-arr-Rev5引物PCR(序列分別如序列表SEQ ID N0.34 - 43所示)，PCR產(chǎn)物約500bp，純化PCR產(chǎn)物。
[0089]3.上述純化后的PCR片段使用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，純化酶切產(chǎn)物。
[0090]4.將上述酶切回收后的各種酶切產(chǎn)物等摩爾量混合，與回收后的PU6-sgRNA-UbC-Cas9 14276bp片段使用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化Trans 5α感受態(tài)細(xì)菌，涂于帶有氨芐抗性的瓊脂板。
[0091]5.挑細(xì)菌克隆搖菌，使用arr-5’ seq和arr_3’ seq測(cè)序引物測(cè)序(序列如序列表SEQ ID N0.44和SEQ ID N0.45所示)，反向引物中間區(qū)域測(cè)通以保證無(wú)突變，正確連接得產(chǎn)物 pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9 (序列如序列表 SEQ ID N0.46 所示)。
[0092]6.提取足量 的pU6_Maf sgRNA_UbC_Cas9載體(序列如序列表SEQ ID N0.46所示，結(jié)構(gòu)如圖12所示)。[0093]實(shí)施例3細(xì)胞水平驗(yàn)證誘導(dǎo)敲除效果
1.將pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Cre/ERT2過(guò)表達(dá)ES細(xì)胞系，通過(guò)紅色熒光分選獲得陽(yáng)性ES細(xì)胞。
[0094]2.加入4-OH-Tamoxifen誘導(dǎo)Cre入核,通過(guò)Cre/Loxp系統(tǒng)將控制Cas9表達(dá)的紅色熒光蛋白(dsRed)和終止序列(STOP)剔除，使得Cas9表達(dá)并實(shí)現(xiàn)sgRNA介導(dǎo)的基因組特異序列的切割(參見(jiàn)圖1及【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】)。
[0095]3.48h后收犾細(xì)胞，提取基因組。
[0096]以上述基因組為模板，使用c-Maf For和c_Maf Rev, MafB For和MafB Rev引物PCR (序列分別如序列表SEQ ID N0.47-50所示)，PCR產(chǎn)物約Ik bp，純化PCR產(chǎn)物。
[0097]將上述PCR產(chǎn)物取200ng退火，使用T7EN1酶切鑒定，電泳，切割效果下圖3所示。[0098]將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 TA 克隆，使用使用 c-Maf For 和 c_Maf Rev, MafB For 和 MafBRev引物測(cè)序(序列分別如序列表SEQ ID N0.47-50所示)。分析測(cè)序結(jié)果，肯定細(xì)胞基因組c-Maf和MafB發(fā)生不同種類的切割(圖4)。
【權(quán)利要求】
1.一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用中間載體，其特征為: 利用II S型限制性內(nèi)切酶BsmBI切割形成不同粘性末端可將多個(gè)U6 promoter調(diào)控sgRNA表達(dá)的片段一次性連接進(jìn)載體中，為開(kāi)源系統(tǒng)； 此載體包含有UbC promoter調(diào)控的Cas9,但特點(diǎn)在于在UbC promoter與Cas9之間有一個(gè)被雙1xp包含的dsRed,在未加入ere刪除1xp包含區(qū)域的情況下只有dsRed表達(dá)，在加入ere刪除dsRed之后Cas9才開(kāi)始表達(dá)； 插入多個(gè)U6 promoter調(diào)控sgRNA表達(dá)的片段的區(qū)域使用II s型限制性內(nèi)切酶BsmBI切割，形成5’ ACCG 3’和5’ GTTT 3’兩個(gè)不同的粘性末端。
2.如權(quán)利要求1所述的一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用中間載體，其特征為載體結(jié)構(gòu)如圖5所示。
3.如權(quán)利要求2所述的一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用中間載體，其特征為序列如序列表SEQ ID N0.20所示。
4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用中間載體在制備基因打靶載體中的用途。
5.由權(quán)利要求3所述的一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用中間載體制備獲得的條件性過(guò)表達(dá)pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9載體，其特征為序列如序列表SEQ ID N0.46所示。
6.一種制備如權(quán)利要求3所述的一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用中間載體的方法，其特征為包括以下步驟: (1)利用限制性內(nèi)切酶NotI和SacI，由序列如序列表SEQID N0.21所示的pUbC-loxp-dsRed-loxp-gfp載體雙酶切獲得線性質(zhì)粒；將序列分別如序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的Back up和Back down的混合退火產(chǎn)物與上述線性質(zhì)粒連接獲得序列如序列表SEQ ID N0.22所示的pUbC-loxp-dsRed-loxp載體； (2)由pUbC-loxp-dsRed-loxp載體，使用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切獲得1268bp和8325bp的兩段序列，對(duì)8325bp這段序列做去磷酸化處理，然后連接1268bp和8325bp這兩段序列獲得PUbC-1載體； (3)由pUbC-1載體，使用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切，獲得9553bp片段的線性載體；將該線性載體與序列分別如序列表SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的Cas9inser up和Cas9 inser down的混合退火產(chǎn)物連接獲得pUbC-2載體； (4)由pUbC-2載體，使用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切，獲得線性載體并對(duì)其做去磷酸化處理；將該線性載體和序列如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的SpeI prom up和SpeI prom down的混合退火產(chǎn)物連接獲得pUbC_3載體； (5)由序列如序列表SEQID N0.23所示的pGL3-multi sgRNA載體，使用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，獲得5508bp片段的線性載體；將序列分別如序列表SEQ ID N0.12和SEQID N0.13所示的MCS up和MCS down的混合退火產(chǎn)物與該線性載體連接獲得pGL3_multisgRNA modi載體；由pGL3_multi sgRNA modi載體,使用限制性內(nèi)切酶ApaI和SacI雙酶切，獲得4586bp的pGL3_multi sgRNA modi的線性載體； (6)以pGL3-multisgRNA modi載體為模板,使用序列分別如序列表SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物deSall For和deSall Rev進(jìn)行PCR,獲得約500bp的序列如序列表SEQ ID N0.24所示的PCR產(chǎn)物；將該P(yáng)CR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶ApaI和SacI雙酶切，獲得序列如序列表SEQ ID N0.25所示的酶切產(chǎn)物；將該酶切產(chǎn)物與上步所獲得的4586bp 的 pGL3_multi sgRNA modi 的線性載體進(jìn)行連接獲得 pGL3_multi sgRNA final 載體； (7)由pUbC-3載體，使用限制性內(nèi)切酶MluI酶切，獲得線性載體并做去磷酸化處理；以pGL3_multi sgRNA final載體為模板,使用序列分別如序列表SEQ ID N0.15和SEQ IDN0.16所示的引物U6 For和U6 Rev進(jìn)行PCR，獲得約450bp的序列如序列表SEQ ID N0.26所示的PCR產(chǎn)物；對(duì)該450bp的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MluI酶切，獲得序列如序列表SEQ ID N0 .27所示酶切產(chǎn)物；將該酶切產(chǎn)物與pUbC-3載體經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶MluI酶切并去磷酸化所獲得的線性載體連接獲得PU6-sgRNA-UbC載體； (8)由PU6-sgRNA-UbC載體使用限制性內(nèi)切酶AgeI和KpnI雙酶切獲得10069bp的線性載體；以序列如序列表SEQ ID N0.28所示的pstl374-nls-flag-cas9-zf載體為模板,使用序列分別如序列表SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物Cas9 For和Cas9 Rev進(jìn)行PCR獲得序列如序列表SEQ ID N0.29所示的4k bp的PCR產(chǎn)物，使用限制性內(nèi)切酶AgeI和KpnI雙酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物獲得序列如序列表SEQ ID N0.30所示的酶切PCR片段；將該酶切PCR片段與pU6-sgRNA-UbC載體經(jīng)過(guò)AgeI和KpnI雙酶切獲得10069bp的線性載體連接獲得用于基因敲除的序列如序列表SEQ ID N0.20所示的中間載體pU6-sgRNA-UbC-Cas9。
7.一種由權(quán)利要求3所述的一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用中間載體制備條件性過(guò)表達(dá)pU6-sgRNA-UbC-Cas9載體的方法，其特征為包括以下步驟: (1)由中間載體pU6-sgRNA-UbC-Cas9，使用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，回收獲得14276bp的線性載體； (2)將特定的目標(biāo)sgRNA與上述回收的14276bp長(zhǎng)的pU6-sgRNA-UbC_Cas9線性載體進(jìn)行連接，獲得條件性過(guò)表達(dá)pU6-sgRNA-UbC-Cas9載體。
8.一種由權(quán)利要求3所述的一種無(wú)物種限制的真核生物條件性基因打靶用中間載體制備條件性過(guò)表達(dá)pU6_Maf sgRNA-UbC-Cas9載體的方法，其特征為包括以下步驟: (1)由中間載體pU6-sgRNA-UbC-Cas9，使用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，回收獲得14276bp 大小的 pU6-sgRNA-UbC-Cas9 線性載體； (2)以序列如序列表SEQID N0.33所示的pU57-sgRNA-U6載體為模板，分別使用序列分別如序列表SEQ ID N0.34 - 43所不的引物Maf-arr-Forl和Maf-arr-Revl、Maf-arr~For2 和 Maf-arr-Rev2、Maf-arr-For3 和 Maf-arr-Rev3、Maf-arr-For4 和Maf-arr-Rev4 以及 Maf_arr_For5 和 Maf_arr_Rev5 進(jìn)行 PCR，PCR 產(chǎn)物約 500bp，純化 PCR產(chǎn)物；將該純化后的PCR片段使用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，純化酶切產(chǎn)物； (3)將上述酶切回收后的各種酶切產(chǎn)物等摩爾量混合，與回收獲得的14276bp大小的PU6-sgRNA-UbC-Cas9線性載體片段使用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化Trans 5 α感受態(tài)細(xì)菌，涂于帶有氨芐抗性的瓊脂板； (4)挑細(xì)菌克隆搖菌，使用序列分別如序列表SEQID N0.44和SEQ ID N0.45所示的arr-5’ seq和arr_3’ seq測(cè)序引物測(cè)序,反向引物中間區(qū)域測(cè)通以保證無(wú)突變,正確連接得序列如序列表SEQ ID N0.46所示產(chǎn)物pU6_Maf sgRNA_UbC_Cas9 ； (5)提取足量的序列如序列表SEQID N0.46所示的pU6-Maf sgRNA-UbC_Cas9載體。
9.一種無(wú)物種限制的條件性基因敲除方法，其特征為:在細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)基因敲除或在個(gè)體原核水平實(shí)現(xiàn)基因敲除時(shí)將條件性過(guò)表達(dá)pU6-sgRNA-UbC-Cas9載體導(dǎo)入細(xì)胞，需要時(shí)加入序列如序列表SEQ ID N0.31所示的Cre或序列如序列表SEQ ID N0.32所示的CreERT2表達(dá)載體；在小鼠水平實(shí)現(xiàn)基因敲除時(shí)，用Cre或CreERT2表達(dá)小鼠系交配，通過(guò)Cre/Loxp系統(tǒng)將控制Cas9表達(dá)的紅色熒光蛋白dsRed和終止序列STOP剔除，使得Cas9表達(dá)并實(shí)現(xiàn)sgRNA介導(dǎo)的基因組特異序列的切割。
10.一種無(wú)物種限制的條件性基因敲除方法，其特征為包括以下步驟: (1)將pU6-MafsgRNA-UbC-Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Cre/ERT2過(guò)表達(dá)ES細(xì)胞系，通過(guò)紅色熒光分選獲得陽(yáng)性ES細(xì)胞； (2)加入4-OH- Tamoxifen誘導(dǎo)Cre入核,通過(guò)Cre/Loxp系統(tǒng)將控制Cas9表達(dá)的紅色熒光蛋白dsRed和終止序列STOP剔除，使得Cas9表達(dá)并實(shí)現(xiàn)sgRNA介導(dǎo)的基因組特異序列的切割。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103725712SQ201410023541
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】杜憶南, 沈彬, 黃行許 申請(qǐng)人:南京大學(xué)