禾本科牧草胚根直接用于rapd反應的制備方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明主要涉及一種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的方法。具體涉及禾本科牧草胚根堿處理的方法以及RAPD反應的擴增體系。一種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的方法，其主要特點是包括有：禾本科牧草胚根根尖經0.25M?NaOH水溶液100℃條件下處理1min，可直接作為PCR模板進行RAPD反應。其RAPD反應擴增體系的主要特點是包括有：PCR體系的總體積為20μl，其中包括2×PCR?Master（上海生工產品編號：SK2082）10μl，2μl引物RAPD1或引物RAPD2，ddH2O8μl以及1～2mm經堿處理過的禾本科牧草胚根根尖。結果表明，該方法具有省時、省力、成本低、重復性強和快速便捷的特點，在我國牧草生物【技術領域】中具有廣闊的應用前景，為我國牧草科研事業的快速發展提供先進的技術支持。
【專利說明】禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的制備方法及其試劑
合
Si
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及一種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的制備方法。
【背景技術】
[0002]RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)即隨機擴增多態性 DNA 標記，是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態性分析的分子技術。其以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態核苷酸序列(通常為10個堿基對)為引物，在熱穩定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下，進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態性。
[0003]RAPD反應的第一步就是提取待測樣品的基因組DNA，一般提取植物基因組DNA的方法有 CTAB (Hexadecyltrimethylammonium Bromide)法、SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)法或者直接利用試劑盒提取。然而這些方法都耗時耗力，尤其是要進行大批量的DNA提取時，這樣往往會延緩實驗進展，使實驗成本提高。因此，一種簡便的進行RAPD反應的方法會起到事半功倍的效果，前人已在這方面有過一些探索，如Virk等已在擬南芥等植物中建立起快速、有效的微衛星分析體系，以及汪秀峰等利用小麥葉片直接用于PCR和RAPD反應，雖說這種快速RAPD反應的方法已經應用于多種植物材料，但是在牧草上卻應用較少，這種禾本科牧草快速RAPD反應的方法將擴大生物技術在禾本科牧草上的應用范圍。`
【發明內容】
[0004]本發明的目的一是為了省時、省力、減少實驗成本，提出一種直接用于RAPD反應的禾本科牧草胚根的制備方法。
[0005]本發明的目的二是提供一種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的試劑盒。
[0006]以便快速、高效和準確的進行有關于禾本科牧草的RAPD反應。此方法省時省力，操作簡便，在實驗室條件下較短時間內能夠很好的完成。研究中，隨機選取的19種禾本科牧草都可適用，具有很強的推廣價值，可以確保科研工作的正常進行，并能提高科研中的實驗效率，為我國科研事業的快速發展提供先進的技術支持以及打下堅實的基礎。
[0007]為實現上述目的，本發明采取的技術方案為:一種直接用于RAPD反應的禾本科牧草胚根的制備方法，其主要特點是包括如下步驟:
[0008]A.收集種子，采用雙層濾紙萌發法，在23~27°C萌發65~80h，切取I~3cm長胚根
[0009]根尖備用；
[0010]B.對禾本科牧草胚根的堿處理；切取I~2cm長的胚根，放入含350~450 μ 10.25mol/LNa0H的Eppendorf管中，將此離心管插入沸水浴中煮I~1.5min,取出后加入 350 ~450 μ 10.25mol/L HCl 和 200 μ 10.5mol/L Tris-HCl (PH8.0)，再次將該管放入沸水中孵育3min，最后挑去I~2mm，經過上述堿處理的供試牧草的胚根直接作為PCR模板進行RAro反應。
[0011]一種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的試劑盒，其特征是包括有:2XPCRMaster，引物 RAPDl:CACGGCACAA 或引物 RAPD2:ACGGCGTATG, ddH20,經堿處理過的禾本科牧草胚根根尖。
[0012]一種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的方法，其步驟包括有:
[0013]A.收集種子，采用雙層濾紙萌發法，在23~27°C萌發65~80h，切取I~3cm長胚根根尖備用；
[0014]B.對禾本科牧草胚根的堿處理；切取I~2cm長的胚根，放入含350~450 μ 10.25mol/LNa0H的Eppendorf管中，將此離心管插入沸水浴中煮I~1.5min,取出后加入 350 ~450 μ 10.25mol/L HCl 和 200 μ 10.5mol/L Tris-HCl (PH8.0)，再次將該管放入沸水中孵育3min，最后挑去I~2mm經過上述堿處理的供試牧草的胚根直接作為PCR模板進行RATO反應；
[0015]C.將上述B步驟得到的I~2mm經堿處理過的禾本科牧草胚根根尖進行PCR擴增，PCR 總體積為 20 μ 1，其中包括 2XPCR MasterlOy 1，2μ I 引物 RAPDl:CACGGCACAA 或引物 RAPD2:ACGGCGTATG, ddH208 μ 1，PCR 擴增條件為:(I) 95 °C 預變性 5min ;(2)94°C 變性 Imin ;(3)36°C退火 2min ; (4) 72°C延伸 Imin ; (5)2 ~4 步驟循環 45 次；(6)72°C延伸IOmin ;(7)4°C保存；
[0016]D.擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態性。
[0017]本發明的有益效果是，可以有效的提高實驗效率，當科研人員在進行大批量的DNA提取時能夠代替一般使用的CTAB法、SDS法，達到省時、省力的效果。該方法具有省時、省力、成本低，重復性強和快速便捷等特點，在我國生物技術類的科研領域中具有廣闊的應用前景，可以確保科研工作的正常進行，并能提高科研中的實驗效率，為我國科研事業的快速發展提供先進的技術支持以及打下堅實的基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1.19種禾本科牧草胚根的引物RAPDl擴增圖譜。圖中:M表示DL2000DNAMarker, I~19表示19種禾本科牧草的編號，CK表示用水做的對照；
[0019]圖2.19種禾本科牧草胚根的引物RAPD2擴增圖譜。圖中:M表示DL2000DNAMarker, I~19表示19種禾本科牧草的編號，CK表示用水做的對照；
[0020]圖3.19種禾本科牧草基因組DNA的引物RAPDl擴增圖譜。圖中:M表示DL2000DNAMarker, I~19表示19種禾本科牧草的編號，CK表示用水做的對照；
[0021]圖4.19種禾本科牧草基因組DNA的引物RAPD2擴增圖譜。圖中:M表示DL2000DNAMarker, I~19表示19種禾本科牧草的編號，CK表示用水做的對照；
[0022]圖5.6種禾本科牧草經堿處理的胚根和對照通過溴化乙錠染色后的結果比較。圖中:CK表示未經堿處理的胚根，堿處理表示經過堿處理的胚根，明場表示在白光
[0023]條件下的拍照效果，紫外光表示在紫外照射下的拍照效果。
【具體實施方式】[0024]以下結合實施例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。
[0025]實施例1:一種直接用于RAH)反應的禾本科牧草胚根的制備方法，包括如下步驟:
[0026]A.收集種子，采用雙層濾紙萌發法，在23~27°C萌發65~80h，切取I~3cm長胚根根
[0027]尖便對其進行堿處理；
[0028]B.對禾本科牧草胚根的堿處理；切取I~2cm長的胚根，放入含350~450 μ 10.25mol/LNa0H的Eppendorf管中，將此離心管插入沸水浴中煮I~1.5min,取出后加入 350 ~450 μ 10.25mol/L HCl 和 200 μ 10.5mol/L Tris-HCl (PH8.0)，再次將該管放入沸水中孵育3min，最后挑去I~2mm，經過上述堿處理的供試牧草的胚根直接作為PCR模板進行RAH)反應。
[0029]實施例2: —種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的試劑盒，其特征是包括有:
[0030]PCR總體積為20 μ I，其中包括2 X PCR Master (上海生工產品編號:SK2082 )
10μ 1，2 μ I 引物 RAPDl:CACGGCACAA 或引物 RAPD2:ACGGCGTATG, ddH208 μ 1，I ~2mm 經堿處理過的禾本科牧草胚根根尖。
[0031]實施例3: —種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的方法，其步驟包括有:
[0032]A.收集19種不同的禾本科牧草種子(見表1)，采用雙層濾紙萌發法，25°C萌發，
`[0033]等種子的胚根長于2cm時，便對其進行堿處理；
[0034]B.對禾本科牧草胚根的堿處理；切取I~2cm長的胚根，放入含350~450 μ 10.25mol/LNa0H的Eppendorf管中，將此離心管插入沸水浴中煮I~1.5min,取出后加入 350 ~450 μ 10.25mol/L HCl 和 200 μ 10.5mol/L Tris-HCl (PH8.0)，再次將該管放入沸水中孵育3min，最后挑去I~2mm經過上述堿處理的供試牧草的胚根直接作為PCR模板進行RATO反應；
[0035]C.將上述B步驟得到的I~2mm經堿處理過的禾本科牧草胚根根尖進行PCR擴增，PCR總體積為20μ 1，其中包括2XPCR Master(上海生工產品編號:SK2082)10 μ I, 2 μ I引物 RAPDl:CACGGCACAA 或引物 RAPD2:ACGGCGTATG, ddH208 μ 1，PCR 擴增條件為:(I) 95°C預變性 5min ；(2) 94°C 變性 Imin ；(3) 36°C 退火 2min ； (4) 72°C 延伸 Imin ; (5) 2 ~4 步驟循環 45 次；(6) 72°C 延伸 IOmin ；(7) 4°C 保存；
[0036]D.將擴增好的PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠跑電泳，一般可用120V的電壓跑膠21min即可；
[0037]E.跑膠完成之后利用凝膠成像儀對其拍照，見圖1和圖2。
[0038]表119種禾本科牧草的基本信息
[0039]
【權利要求】
1.一種直接用于RAPD反應的禾本科牧草胚根的制備方法，其特征是包括如下步驟: A.收集種子，采用雙層濾紙萌發法，在23~27°C萌發65~80h，切取I~3cm長胚根根尖備用； B.對禾本科牧草胚根的堿處理；切取I~2cm長的胚根,放入含350~450μ 10.25mol/LNaOH的Eppendorf管中，將此離心管插入沸水浴中煮I~1.5min,取出后加入350~，450 μ 10.25mol/L HCl 和 200 μ 10.5mol/L Tris-HCl (PH8.0)，再次將該管放入沸水中孵育，3min,最后挑去I~2mm，經過上述堿處理的供試牧草的胚根直接作為PCR模板進行RAPD反應。
2.—種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的試劑盒，其特征是包括有: ，2 XPCR Master，引物 RAPDl:CACGGCACAA 或引物 RAPD2:ACGGCGTATG，ddH20，經堿處理過的禾本科牧草胚根根尖。
3.—種禾本科牧草胚根直接用于RAPD反應的方法，其步驟包括有: A.收集種子，采用雙層濾紙萌發法，在23~27°C萌發65~80h，切取I~3cm長胚根根尖備用； B.對禾本科牧草胚根的堿處理；切取I~2cm長的胚根,放入含350~450μ 10.25mol/LNaOH的Eppendorf管中，將此離心管插入沸水浴中煮I~1.5min,取出后加入350~，450 μ 10.25mol/L HCl 和 200 μ 10.5mol/L Tris-HCl (PH8.0)，再次將該管放入沸水中孵育，3min，最后挑去I~2mm經過上述堿處理的供試牧草的胚根直接作為PCR模板進行RAPD反應； C.將上述B步驟得到的I~ 2mm經堿處理過的禾本科牧草胚根根尖進行PCR擴增，PCR 總體積為 20 μ 1，其中包括 2XPCR MasterlOy 1，2μ I 引物 RAPDl:CACGGCACAA 或引物RAPD2:ACGGCGTATG, ddH208 μ 1，PCR 擴增條件為:(1)95°C預變性 5min ;(2)94°C變性 Imin ；(3)36°C 退火 2min ；(4) 72°C 延伸 Imin ； (5) 2 ~4 步驟循環 45 次；(6) 72°C 延伸 IOmin ；(7)4°C保存； D.擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態性。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773870SQ201410023265
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】劉志鵬, 周強, 馬利超, 王彥榮, 陳天龍 申請人:蘭州大學