一種以vtaA9 基因為靶點的引物組及其在副豬嗜血桿菌鑒別和診斷中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種以vtaA9基因為靶點的引物組及其在副豬嗜血桿菌鑒別和診斷中的應用。本發明通過研究發現以vtaA9基因為靶點的PCR方法能夠精確地區分具有不同致病力，同時定居于豬上呼吸道的H.parasuis和其相似的菌株A.indolicus，A.minor和A.porcinus。此外，本發明基于vtaA9基因序列，設計并合成了特異性引物，所述的引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1及SEQ?ID?NO.2所示。特異性實驗表明，通過本發明的方法能夠100%的完全區分H.parasuis和A.indolicus，A.minor和A.porcinus。敏感性實驗表明，使用本發明的方法可以檢測到不低于20CFU/ml和5pg/μl的基因組DNA。另外，以vtaA9為靶點的PCR方法對臨床樣品的陽性結果高于菌株的分離培養和經典的16S?rRNA?PCR方法。本發明的提出為副豬嗜血桿菌的鑒別診斷和流行病學監測提供了一種新方法。
【專利說明】—種以vtaA9基因為靶點的引物組及其在副豬嗜血桿菌鑒別和診斷中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于鑒別和診斷副豬嗜血桿菌的新靶點以及基于該靶點的特異性引物組，特別涉及一種以VtaA9基因為靶點的，用于鑒別和診斷副豬嗜血桿菌的引物組及其在制備鑒別和診斷副豬嗜血桿菌的試劑中的應用。本發明屬于副豬嗜血桿菌的檢測領域。
【背景技術】
[0002]副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)是 NAD (Nicotinamide AdenineDinucleotide)依賴性Pasteurellaceae家族中的一員，可以引發豬的Glaser’s疾病，以發生漿膜炎、腹膜炎和腦膜炎等全身癥狀為特征。該疾病的診斷通常依賴臨床癥狀、剖檢變化和病原菌分離綜合性的診斷。由于臨床混合感染和抗生素藥物的治療致使臨床癥狀復雜，病原菌的分離培養難度大大增加。尤其，具有不同致病性并定居于豬上呼吸道的相似菌群口引哚放線桿菌(A.1ndolicus),豬放線桿菌(A.porcinus)和小放線桿菌(A.minor),更加擾亂了 H.parasuis精確診斷的過程。
[0003]為提高H.parasuis檢測的準確性和敏感性，需要建立H.parasuis的分子生物學診斷方法。2001年Oliveria在16S rRNA基因的基礎上建立了經典PCR方法，從臨床樣品檢測中評估了該方法的有效性，并表明該方法敏感性高于傳統的細菌培養分離法，但是不能區分同樣來源于豬上呼吸道的相似菌株A.1ndolicus，這是因為此段基因序列的相似性與A.1ndolicus的達到97.4-97.7%。為了克服這個問題，2007年Angen采用3個特異性引物改進了 PCR方法，特異性增強的同時敏感性卻下降10倍。2009年Tumi利用real-timePCR進行檢測H.parasuis,但是仍然存在與Pasturella mairii菌株發生非特異性反應的問題。發展和改善檢測H.parasuis PCR方法的同時，研究者對檢測目的基因也進行了替換，如ABC，hsp60, aroA, infB等。雖然這些基因具有一定程度的特異性，但是非特異性反應和與其他種屬基因的相似性，到目前為止尚未解決。然而，利用特異性基因精確區分相似菌在Straptococcus和Heamophilus種屬中已有報道。在此情況下，在PCR方法的基礎上選擇唯一并特異性的基因作為靶點去檢測H.parasuis是我們需要解決的問題。
[0004]H.parasuis基因組中擁有毒力相關的三聚合轉座子(Virulence-associatedTrimericautotans, VtaA)。VtaA屬于多拷貝基因，13個拷貝的VtaA在H.parasuis基因組中已被鑒定，并且依據他們轉座結構域的不同分為三組，其中，group3具有種特異性。另外VtaA家族中VtaA8和VtaA9結構功能特性已有報道。但是利用vtaA基因作為唯一特異性基因區分H.parasuis和相關菌株，還沒有報道。
[0005]本發明利用VtaA多基因家族中一個拷貝vtaA9基因作為特異性基因，基于vtaA9基因的保守性，采用PCR方法證明該基因在檢測H.parasuis中的特異性和敏感性。結果表明vtaA9是一種可靠的臨床診斷標記，vtaA9作為鑒別診斷基因相對其他的檢測基因具有敏感、特異、可靠等特點。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題之一是提供一種可用于副豬嗜血桿菌診斷和鑒別的臨床診斷標記。
[0007]本發明所要解決的技術問題之二是以該臨床診斷標記為靶點設計并合成特異性引物組，該引物組能夠特異性的檢測副豬嗜血桿菌(H.parasuis)菌株，而對于其他任何一株非副豬嗜血桿菌菌株都無法得到特異性擴增，尤其可以區分副豬嗜血桿菌(H.parasuis)菌株與其相似菌株，例如11引哚放線桿菌(A.1ndolicus),豬放線桿菌(A.porcinus)和小放線桿菌(A.minor)。
[0008]本發明所要解決的技術問題之三是提供一種利用所述的引物組進行副豬嗜血桿菌診斷和鑒別的方法。
[0009]本發明所要解決的技術問題之四是提供所述引物在制備鑒別、診斷或檢測副豬嗜血桿菌的試劑中的應用。
[0010]為了達到上述目的，本發明采用的技術手段為:
[0011]本發明通過篩選得到了作為多基因VtaA家族中一員vtaA9基因片段，并且根據vtaA9基因的C端的部分序列進行了引物的設計。利用合成的特異性引物建立了以vtaA9為檢測靶點的PCR方法，通過對15株副豬嗜血桿菌標準菌株以及24株非副豬嗜血桿菌(包括A.minor, A.1ndolicus以及A.porcinus.)進行檢測，結果表明所述的引物組能夠實現對15株副豬嗜血桿菌標準菌株的特異性擴增，但是對于24株非副豬嗜血桿菌均沒有得到特異性PCR產物，說明本發明的方法具有100%的特異性。
[0012]為了更好的確定PCR產物的特異性，本發明對vtaA9基因的PCR產物進行了測序。基于15株標準菌株vtaA9PCR產物的序列分析和比對，顯示出15個PCR產物的基因序列之間同源性高于97%。此序列沒有在非副豬嗜血桿菌中(包括A.minor, A.1ndolicus andA.porcinus.)發現，說明vtaA9基因完全不存在于其他的相似菌株基因組內部。因此，可作為用于副豬嗜血桿菌診斷和鑒別的特異性臨床診斷標記。
[0013]敏感性實驗表明，使用本發明的方法可以檢測到不低于20CFU/ml的細菌數和5pg/ μ l的基因組DNA。
[0014]因此，本發明提出了以vtaA9基因為靶點的引物組在制備檢測、鑒別或診斷副豬嗜血桿菌的試劑中的應用。
[0015]在本發明中，優選的，所述的引物組是以vtaA9基因的C端序列為靶點進行擴增的。
[0016]更優選的，所述的引物組包括一條正向引物和一條反向引物，其中所述的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0017]本發明的一種以vtaA9基因為靶點的，用于副豬嗜血桿菌檢測的引物組，其特征在于包括一條正向引物和一條反向引物，其中所述的正向引物的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0018]相較于現有技術，本發明具有以下優點:
[0019]1、本發明建立了以vtaA9為靶點的，用于副豬嗜血桿菌鑒別和診斷的引物組及PCR方法。特異性和敏感性實驗證明通過對vtaA9基因進行特異性擴增能夠區分副豬嗜血桿菌(H.parasuis)菌株與Π引哚放線桿菌(A.1ndolicus),豬放線桿菌(A.porcinus)和小放線桿菌(A.minor)。
[0020]2、本發明所建立的以VtaA9基因為靶點PCR方法具有能夠對不同部位的臨床樣品進行H.parasuis檢測的優點。
[0021]3、副豬嗜血桿菌很容易在體質弱小的豬鼻腔中發現，本發明所建立的以VtaA9基因為祀點的PCR方法與A.1ndoulicus以及A.pocinus不存在非特異性反應，因此可以用于對鼻拭子的檢測。而現有的方法以16s rRNA為靶點進行PCR檢測，由于存在非特異性反應，所以在活體動物檢測中是受到限制的。本發明所建立的以vtaA9基因為靶點的PCR方法可以檢測到不低于20CFU/ml的細菌數和5pg/l.! I的基因組DNA，vtaA9基因的特異性致使通過鼻拭子檢測的準確性高于以16S rRNA為靶點的PCR方法。
[0022]綜合上述結果，本發明所建立的以vtaA9基因為靶點的PCR方法，以其敏感、特異和可靠性完全可以作為副豬嗜血桿菌感染的替代的診斷方法。同時vtaA9基因作為種屬特異性基因可以區分相似菌株。同樣可以從臨床病料中進行檢測，擁有廣闊的實驗室應用前景。從長遠來看，以vtaA9基因作為副豬嗜血桿菌感染的鑒別和診斷的標記基因，能夠為疾病的監測和預防治療提供診斷的新策略。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為評估以 vtaA9為靶點的檢測副豬嗜血桿菌的PCR方法的敏感性和特異性實
驗結果；
[0024]圖1A為從15個副豬嗜血桿菌參考株(泳道1-15，1-15血清型)、Actinobacillusindolicus,以及Actinobacillus minor中進行vtaA9擴增的結果；圖1B為使用副豬嗜血桿菌血清5型進行vtaA9PCR (右圖)以及16S rRNA PCR (左圖)敏感性實驗的對比結果，數字代表每個PCR反應的菌落數(2XCFU/ml);圖1C為使用副豬嗜血桿菌血清5型進行vtaA9PCR (右圖)以及16S rRNA PCR (左圖)敏感性實驗的對比結果，數字表示每個PCR反應的基因組濃度，范圍從10°-10_6代表基因組濃度500ng/l.! 1-0.5pg/ μ I 為在每個實驗之內的不包括DNA的陰性PCR對照；泳道M為DL2000DNA marker (分子量從上到下依次為:2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp 和 IOObp 陰性 PCR 對照)
[0025]圖2A-D為vtaA家族基因的多序列比對結果，其中用于擴增vtaA9基因的引物以黑色方框標出。
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0027]實施例1以vtaA9基因為靶點進行副豬嗜血桿菌鑒別和診斷的PCR方法的建立及敏感性和特異性分析
[0028]1、樣本材料
[0029]本發明樣品中包括15株H.parasuis參考菌株,見表1, 24株非H.parasuis菌株，以及10個相關菌株的純化基因組DNA，見表2。同時，對臨床疑似H.parasuis感染的病料取1.0g樣品加入500 μ1的PBS緩沖液進行研磨后直接進行菌種的分離和PCR的檢測。
[0030]表1.應用于本發明中的H.parasuis參考菌株
【權利要求】
1.一種以vtaA9基因為靶點的，用于副豬嗜血桿菌檢測的引物組，其特征在于包括一條正向引物和一條反向引物，其中所述的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.以vtaA9基因為靶點的引物組在制備檢測、鑒別或診斷副豬嗜血桿菌的試劑中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的引物組是以vtaA9基因的C端序列為靶點進行擴增的。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述的引物組包括一條正向引物和一條反向引物，其中所述的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示 。
【文檔編號】C12Q1/04GK103789422SQ201410019903
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月16日 優先權日:2014年1月16日
【發明者】張艷禾 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所