CTB、人胰島素和谷氨酸脫羧酶3p531片段融合蛋白及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種CTB、人胰島素和谷氨酸脫羧酶3p531片段融合蛋白及其應用。所述應用為融合蛋白在制備Ⅰ型糖尿病治療藥物中的應用。利用被重組家蠶桿狀病毒感染的家蠶幼蟲或蠶蛹高效表達融合蛋白，比直接用原核生物表達的活性高，比通過轉基因植物表達的產率高；蠶體中有多重天然蛋白質保護劑，對表達產物有保護作用，使基因表達產物更加穩定；制備的融合蛋白可制成口服Ⅰ型糖尿病治療藥物，為患者解除注射的痛苦和感染的威脅。
【專利說明】CTB、人胰島素和谷氨酸脫羧酶3p531片段融合蛋白及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物藥物開發【技術領域】，具體涉及一種CTB、人胰島素和谷氨酸脫羧酶3p531片段融合蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002]糖尿病是一種由胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所導致的以血糖高為特征的代謝性疾病，目前已經成為世界上影響人體健康的重大疾病之一。糖尿病分為I型和II型，其中，I型糖尿病(胰島素依賴性糖尿病，IDDM)是由于胰島β細胞受到破壞導致胰島素分泌缺陷的自身免疫性疾病，而II型糖尿病患者體內分泌胰島素的能力并未完全喪失，有的患者體內胰島素甚至產生過多，但胰島素的作用效果較差，導致體內胰島素相對缺乏。
[0003]I型糖尿病占全國糖尿病總數的5-10%，全國I型糖尿病的患者至少有100萬，目前還呈上升趨勢。I型糖尿病患者必須長期服用胰島素以維持生命，給家庭和社會帶來了嚴重的精神壓力和經濟負擔，且糖尿病引起的各種并發癥是導致殘疾和死亡的主要原因，因此糖尿病的防治迫在眉睫。
[0004]現有技術中治療糖尿病的藥物多數針對II型糖尿病，用于治療I型糖尿病的藥物則相對較少。
[0005]I型糖尿病的抗原包括胰島素及其前體、谷氨酸脫羧酶(Glutnmic aciddecarnoxylase, GAD)蛋白、熱休克蛋白、羧基肽酶H等多種抗原。研究表明，僅給動物口服一種自身抗原如胰島素，就能誘導免疫耐受，對機體產生保護作用(Science, 1994,265:1237)。這是由于口服抗原能夠誘導調節性T細胞分泌抑制性細胞因子IL-4、IL-10和TGF-β，降低自身免疫疾病病灶由IL_2、IFN_ Y和TNF-α導致的炎癥反應。這種由相互間無關的各種抗原誘導的，在同一特定器官發生的所有病理免疫反應進行抑制，被稱為抗原驅動旁觀者抑制(Antigen-driven Bystander Supression)。抗原驅動旁觀者抑制的誘導是抗原特異性的，而效應是非特異性的，這為防預I型糖尿病等自身免疫性疾病提供了一條新途徑(Immunol Today, 1998, 19:173)。
[0006]同時，研究表明霍亂病毒B亞基(CTB)可作為誘導口服耐受的強大粘膜運載系統，并且CTB偶聯抗原可能涉及到與傳統大量口服自身抗原產生免疫耐受效應明顯不同的免疫調節機制，可能涉及到發炎細胞的移動行為的變化(Nat Biotechnol, 1998，16，292)，暗示CTB偶聯自身抗原不僅使應用口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疾病更具實際應用價值，而且還有潛在的治療前景(Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94:4610)。
【發明內容】
[0007]本發明提供了一 種融合基因，該融合基因表達的融合蛋白可用于制備I型糖尿病治療藥物。
[0008]一種融合基因及其表達的融合蛋白，所述融合基因由CTB基因、人胰島素基因和谷氨酸脫羧酶基因3p531片段(即三倍的谷氨酸脫羧酶65分子第531-545位氨基酸序列)重組而成，所述融合蛋白由CTB、人胰島素和谷氨酸脫羧酶3p531片段(即三倍的谷氨酸脫羧酶65分子第531-545位氨基酸序列GAD653 (531-545))融合而成。
[0009]谷氨酸脫羧酶基因全長序列過長，融合過后會影響融合蛋白的表達量，因此本發明中選用三倍的谷氨酸脫羧酶65基因的531-545片段，p531片段是谷氨酸脫羧酶的核心抗原片段，既不會影響融合蛋白的表達量，又能很好地與人胰島素一起誘導免疫耐受。
[0010]作為優選，所述融合基因的堿基序列如SEQ ID N0.1所示JflSEQ ID N0.1所示融合基因的制備方法為:
[0011](a)以PBac-CTB-1NS質粒為模板，以aF/aR為引物進行擴增，獲得目的片段CTB-1NS-GPGP ；
[0012]上游引物aF的堿基序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物aR的堿基序列如SEQ IDN0.4所示；
[0013](b)以pBac-CTB-3p531質粒為模板，以bF/bR為引物進行擴增，獲得目的片段GPGP-3p531 ；
[0014]上游引物bF的堿基序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物bR的堿基序列如SEQ IDN0.6所示；
[0015](c)以CTB-1NS-GPGP和GPGP_3p531互為引物和模板進行鏈延伸反應，獲得產物SI，以SI為模板，以aF/bR為引物進行擴增，獲得融合基因CTB-1NS-3P531。 [0016]由SEQ ID N0.1所示的融合基因表達的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所
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[0017]本發明還提供了含有所述融合基因的表達載體和轉化子。作為優選，所述轉化子為重組家蠶桿狀病毒。該重組家蠶桿狀病毒的制備方法為:
[0018](i)用BamHl和EcoRl對融合基因CTB-1NS_3p531進行雙酶切，將酶切片段連接到經同樣處理的轉移載體上，構建含目的基因的家蠶桿狀病毒轉移質粒；所述轉移載體可選用 pFast Bacl；
[0019](ii)將家蠶桿狀病毒轉移質粒轉化大腸桿菌，通過藍白斑篩選獲得重組病毒質粒;
[0020](iii)將重組病毒質粒轉染家蠶卵巢細胞，獲得重組家蠶桿狀病毒。
[0021]本發明還提供了一種所述融合蛋白的制備方法，包括:
[0022](I)將上述制備的重組家蠶桿狀病毒感染家蠶卵巢細胞，進行病毒擴增；
[0023](2)將擴增得到的重組家蠶桿狀病毒注射至家蠶幼蟲或蠶蛹體內，經5-6d后取蠶幼蟲或蠶蛹淋巴血，離心取上清，分離純化獲得所述融合蛋白。
[0024]用家蠶幼蟲或蠶蛹表達的融合蛋白，比直接用原核生物表達的活性高，比通過轉基因植物表達的產率高；并且蠶體中有多重天然蛋白質保護劑，對表達產物有保護作用，使基因表達產物更加穩定。
[0025]本發明還提供了一種所述融合蛋白在制備I型糖尿病治療藥物中的應用。試驗表明，該融合蛋白能夠顯著改善受試小鼠的胰島炎患病狀況，在連續監測30周后，陰性對照組有90%小鼠患病，而飼喂融合蛋白的小鼠只有30%患病。可見本發明的融合蛋白可作為活性成分，用以制備I型糖尿病治療藥物。作為優選，所述I型糖尿病治療藥物為口服藥物，為患者解除注射痛苦和感染威脅。
[0026]本發明將人胰島素基因和谷氨酸脫羧酶基因3p531片段插入CTB基因的下游，構建融合基因及含有融合基因的重組家蠶桿狀病毒，最后將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶幼蟲或蠶蛹，通過家蠶幼蟲或蠶蛹高效表達融合蛋白。該融合蛋白中，人胰島素、谷氨酸脫羧3p531片段與CTB融合表達，CTB能夠強化人胰島素和谷氨酸脫羧3p531片段的免疫原性，而谷氨酸脫羧3p531片段和人胰島素協同誘導機體免疫耐受。
[0027]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0028]本發明利用被重組家蠶桿狀病毒感染的家蠶幼蟲或蠶蛹高效表達融合蛋白，比直接用原核生物表達的活性高，比通過轉基因植物表達的產率高；家蠶是可以無菌大規模飼養經濟昆蟲，可以低成本、大規模飼養，而且不會造成公害；蠶體中有多重天然蛋白質保護劑，對表達產物有保護作用，使基因表達產物更加穩定；制備的融合蛋白可制成口服I型糖尿病治療藥物，為患者解除注射的痛苦和感染的威脅。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1為桿狀病毒轉移質粒pBac-CTB-1NS_3p531的圖譜；
[0030]圖2為家蠶表達的融合蛋白的Westren雜交分析結果圖。
【具體實施方式】
[0031]實施例1
[0032]1、融合基因的構建
`[0033](I)以pBac-CTB-1NS質粒為模板，以aF/aR為引物進行擴增，獲得目的片段CTB-1NS-GPGP ；
[0034]上游引物aF:5' ~CGGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGG~3;；
[0035]下游引物aR: 5' -GGGGCCGGGGCCGTTGCAGT
[0036]AGTTCTCCAGCTGGTAGAGG-3'；
[0037]反應條件為:94°C預變性5min，擴增時94°C 30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，反應30個循環，最后72°C延伸IOmin;
[0038](2)以pBac-CTB-3p531質粒為模板，以bF/bR為引物進行擴增，獲得目的片段GPGP-3p531 ；
[0039]上游引物bF:5' -GGCCCCGGCCCCCCGGTTATCAAAGCTCG-3'；
[0040]下游引物bR:5' ~GGGAATTCTTAAACCATGGTAGTACCGTA~3/ ；
[0041]反應條件為:94°C預變性5min，擴增時94°C 30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，反應30個循環，最后72°C延伸IOmin;
[0042](3)以CTB-1NS-GPGP和GPGP_3p531互為引物和模板進行鏈延伸反應，獲得產物Si ；
[0043]反應條件為:94°C變性10min，60°C退火 5min，72°C延伸 5min ；
[0044]以SI為模板，以aF/bR為引物進行擴增，獲得融合基因CTB-1NS_3p531 ；
[0045]反應條件為94°C預變性5min，擴增時94°C 30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，反應30個循環，最后72°C延伸IOmin。[0046]獲得的融合基因CTB-1NS_3p531大小約為717bp。
[0047]2、重組質粒的構建
[0048]將獲得的融合基因CTB-1NS_3p531進行BamHl和EcoRl雙酶切后連到同樣被BamHl和EcoRl雙酶切的轉移載體pFast Bacl上，構建含融合基因的桿狀病毒轉移質粒pBac-CTB-1NS-3p531，質粒圖譜如圖1所示，經酶切鑒定和PCR分析正確后，經過自動序列測定表明構建的融合基因完全正確，融合基因序列及其編碼的氨基酸序列分別如SEQ IDN0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
[0049]3、重組桿狀病毒的構建
[0050]將桿狀病毒轉移質粒pBac-CTB-1NS_3p531轉化DHlOBac大腸桿菌感受態細胞，轉化條件為:
[0051](I)取10 μ I桿狀病毒轉移質粒pBac-CTB-1NS_3p531加入到DHlOBac感受態細胞，冰上放置30min，42°C水浴90s，冰上放置2min ；
[0052](2)然后加入700 μ I LB培養基(LB培養基:蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，氯化鈉10g, 7jc 1000ml)中，37°C搖床 230rpm 搖菌 1.5h ；
[0053](3)再于4000印111離心31^11，濃縮菌液至20(^ 1，涂NA平板(NA平板含:牛肉浸膏lg，蛋白胨5g,酵母膏2g,氯化鈉5g,鹿糖IOg,瓊脂20g,水1000ml,卡納霉素50 μ g/ml,慶大霉素 7 μ g/ml,四環素 10 μ g/ml,X-gal 100 μ g/ml，IPTG40 μ g/ml),于 37°C培養箱正向放置30min后，倒置培養2d; [0054](4)通過藍白斑篩選獲得重組病毒質粒BacmidCTB-1NS_3p531 ；
[0055](5)將重組病毒質粒BacmidCTB-1NS_3p531轉染家蠶卵巢細胞，獲得家蠶重組桿狀病毒 BmNPV-CTB-1NS-3p5310
[0056]4、融合蛋白的表達
[0057]( I)取擴增的上述重組桿狀病毒注射到五齡家蠶幼蟲和蠶蛹中，每頭注射2 μ I左右(滴度為1父107/1111)，分別取表達24、48、72、96、120和144h后的蠶幼蟲或蠶蛹淋巴血，5000rpm離心5min后取上清；
[0058](2)將上清用PBS緩沖液(pH7.4)稀釋10倍后，加入等體積的2X蛋白質上樣緩沖液(IOMm Tris-HCl，4%SDS，0.1% 溴酚藍，10% 甘油)，取 200 μ I 進行 SDS-PAGE 分析，結果表明，融合基因CTB-1NS-3p531在家蠶幼蟲和蛹中獲得高效表達，經Westren雜交(圖2)表明表達產物分子量為26Kda。
[0059]將含有表達產物的蠶幼蟲或蠶蛹淋巴血高速冷凍離心，取上清，稀釋1000倍后包被酶標板，同時以CTB為標準品按照常規操作進行ELISA檢測，其中兔抗CT 一抗(購自SIGMA公司)稀釋5000倍，山羊抗兔二抗(購自華美生物工程公司)稀釋1000倍，用OPD (購自上海化學試劑公司)顯色，于492nm處測定OD值。檢測結果表明，幼蟲和蛹表達的融合蛋白均有很強的免疫活性，表達量分別達到340 μ g/ml和450 μ g/ml。
[0060]5、檢測融合蛋白對I型糖尿病的治療效果
[0061]將5周齡雌性NOD小鼠隨機分為4組:第一組為對照組，喂食生理鹽水或接種野生型病毒的蠶幼蟲或蠶蛹淋巴；第二組喂食含融合蛋白CTB-3p531的蠶幼蟲或蠶蛹淋巴；第三組喂食含融合蛋白CTB-1NS的蠶幼蟲或蠶蛹淋巴；第四組喂食含融合蛋白CTB-1NS-3p531的蠶幼蟲或蠶蛹淋巴，每組15只，從第5周開始給藥(飼喂融合蛋白)，劑量為30 μ g/鼠，每周給藥3-4次；連續喂藥5周后，各組分別取5只NOD小鼠做病理切片分析(連續飼喂10周后處死)，其余NOD小鼠做糖尿病監測(連續飼喂30周)。
[0062]病理學分析:第10周處死NOD小鼠，取眼球后取小鼠靜脈全血作抗體滴度測定，檢測口服融合蛋白后小鼠產生的胰島素抗體水平，同時取小鼠胰島做組織切片，觀察胰島炎發生情況，并做相應評分。
[0063]糖尿病監測:從第10周起，檢測NOD小鼠尿液的尿糖情況，陽性小鼠繼續檢測血糖，如果連續兩周血糖含量大于或等于16.7nmol/L，則判定為該小鼠患糖尿病。分別對四組中小鼠患病率進行比較統計分析。
[0064]胰島組織切片分析結果表明，給藥組胰島炎顯著低于對照NOD小鼠。同時，糖尿病監測分析結果顯示，30周后陰性對照組的90%N0D小鼠患病，喂食含融合蛋白CTB-3p531和CTB-1NS組分別有40%和45%小鼠患病，而喂食含融合蛋白CTB-1NS_3p531組只有30%的NOD小鼠患病。可見，本發明的融合蛋白可用于制備口服I型糖尿病治療藥物，并且其藥效比含融 合蛋白CTB-3p531和CTB-1NS更好。
【權利要求】
1.一種融合基因，其特征在于，由CTB基因、人胰島素基因和谷氨酸脫羧酶基因3p531片段重組而成。
2.如權利要求1所述的融合基因，其特征在于，堿基序列如SEQID N0.1所示。
3.含有如權利要求1或2所述融合基因的表達載體。
4.含有如權利要求1或2所述融合基因的轉化子。
5.如權利要求4所述的轉化子，其特征在于，所述轉化子為重組家蠶桿狀病毒。
6.如權利要求1所述的融合基因表達的融合蛋白。
7.如權利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
8.如權利要求6 或7所述融合蛋白在制備I型糖尿病治療藥物中的應用。
【文檔編號】C12N7/01GK103820477SQ201410018569
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】金勇豐, 劉寶平, 楊赟, 周陳娟, 岳媛, 潘華偉, 李司 申請人:浙江大學