楊樹灰斑病菌產孢培養基及其制備方法和使用方法
【專利摘要】楊樹灰斑病菌產孢培養基及其制備方法和使用方法，它涉及一種植物病原真菌產孢培養基及其制備方法和使用方法。本發明要解決現有的真菌培養基不能很好的滿足楊樹灰斑病菌生長發育產生孢子的問題。本發明產孢培養基由馬鈴薯、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、瓊脂和余量蒸餾水制成。本發明產孢培養基是將馬鈴薯去皮后煮20min～30min后得濾液，再將蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和瓊脂溶解到濾液中，最后用蒸餾水定容至1L，即完成楊樹灰斑病菌產孢培養基制備。本發明產孢培養基的培養條件：在溫度19℃～30℃下培養7d～30d。本發明應用在微生物培養領域。
【專利說明】楊樹灰斑病菌產孢培養基及其制備方法和使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物病原真菌產孢培養基及其制備方法和使用方法，主要涉及楊樹灰斑病菌(Sporocadus populinus Orsenigo, Rodondi&B.Sutton = Coryneum populinumBres.)的產孢培養基及其制備方法和使用方法。
【背景技術】
[0002]楊樹(Populus spp.)具有生長快、成材早、適應性強、易更新、材質好和用途廣等特點，因此在北方大面積種植。楊樹是我國北方地區用材林、防護林和城市綠化的主要樹種。
[0003]楊樹灰斑病(S.populinus)對楊樹育苗和造林威脅很大，是楊樹苗期發生最為常見和嚴重的病害，主要發生在一年生苗木和幼樹的葉片、梢和莖上。楊樹灰斑病病原菌(S.populinus)屬于真菌界,子囊菌門，糞殼綱,炭角菌目，圓孢菌科，Sporocadus屬。楊樹灰斑病以田間病葉等為初侵染源，以分生孢子盤分生孢子形式越冬。翌年5-6月分生孢子盤吸水釋放孢子，借雨水反濺、沖洗和風傳播。因此，研究楊樹灰斑病菌的分生孢子產孢條件對明確楊樹灰斑病菌的生活史或病害發生規律具有重大的作用，為其農藥和生物防治菌劑篩選提供實驗材料，為科學制定控制楊樹灰斑病菌流行危害的技術措施提供理論依據。但是目前國內尚無關于楊樹灰斑病菌產孢培養基研究的報道，現有通用真菌培養基不能很好的滿足該菌生長發育產生孢子，這極大地限制了對楊樹灰斑病菌、病害發生規律和病害防控技術的深入研究。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是為了解決現有的真菌培養基不能很好的滿足楊樹灰斑病菌生長發育產生孢子的問題，而提供了`楊樹灰斑病菌產孢培養基及其制備方法和使用方法。
[0005]本發明的楊樹灰斑病菌產孢培養基，每IL楊樹灰斑病菌產孢培養基是由馬鈴薯200.0g~202.0g、蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g、瓊脂16g~20g和余量蒸餾水制成。
[0006]本發明的楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備方法，按照下述步驟實現的:把馬鈴薯去皮后取200.0g~202.0g放入IL蒸懼水中，煮20min~30min后,過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂L 4g~1.6g和瓊脂16g~20g,調節pH為6.5~7.5，再用蒸餾水定容至1L，溶解后，即得到楊樹灰斑病菌產孢培養基。
[0007]使用本發明制備得到的楊樹灰斑病菌產孢培養基培養楊樹灰斑病菌的方法:將楊樹灰斑病菌按楊樹灰斑病菌產孢培養基重量的10%以內接種至楊樹灰斑病菌產孢培養基上，在溫度為19°C~30°C的條件下培養7d~30d，即完成使用楊樹灰斑病菌產孢培養基培養楊樹灰斑病菌。
[0008]本發明制備得到的楊樹灰斑病菌產孢培養基，綜合利用碳源、氮源配制成適合于楊樹灰斑病菌產孢。[0009]本發明的楊樹灰斑病菌產孢培養基為固體產孢培養基,楊樹灰斑病菌產孢培養基的滅菌條件為溫度121°C、高壓的條件下，時間20min。
[0010]本發明楊樹灰斑病菌產孢培養基中各物質性能穩定，以馬鈴薯為碳源，以蛋白胨為主要氮源，提供了該菌產孢所需要的碳元素和氮元素，滿足了該菌的營養需要，制備楊樹灰斑病菌產孢培養基的過程簡單，易于實現。
[0011]利用本發明制備得到的楊樹灰斑病菌產孢培養基培養楊樹灰斑病菌，培養25d產孢量可達到1.917 X IO6個孢子/毫升培養基~2.293 X IO6個孢子/毫升培養基，可以滿足楊樹灰斑病菌生長發育并產生孢子。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1中楊樹灰斑病菌在楊樹灰斑病菌產孢培養基上的產孢圖；
[0013]圖2為實施例1中楊樹灰斑病菌分生孢子堆，放大倍數為200倍圖；
[0014]圖3為實施例1中楊樹灰斑病菌發育中的分生孢梗和分生孢子,放大倍數為600圖；
[0015]圖4為實施例1中楊樹灰斑病菌分生孢子，放大倍數為600圖。
【具體實施方式】
[0016]【具體實施方式】一:本實施方式中楊樹灰斑病菌產孢培養基，每IL楊樹灰斑病菌產孢培養基是由馬鈴薯200.0g~202.0g、蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g、瓊脂16g~20g和余量蒸懼水制成。
[0017]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一的不同之處是，所述的楊樹灰斑病菌產孢培養基的pH為6.5~7.5。其他與【具體實施方式】一相同。
[0018]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二的不同之處是，每IL楊樹灰斑病菌產孢培養基是由馬鈴薯201g、蛋白胨0.5g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.53g、瓊脂20g和余量蒸餾水制成。其他與【具體實施方式】一或二相同。
[0019]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一的不同之處是，每IL楊樹灰斑病菌產孢培養基是由馬鈴薯200g、蛋白胨0.49g、磷酸氫二鉀3.lg、硫酸鎂1.5g、瓊脂20g和余量蒸餾水制成。其他與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0020]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一的不同之處是，每IL楊樹灰斑病菌產孢培養基是由馬鈴薯202g、蛋白胨0.57g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.55g、瓊脂20g和余量蒸餾水制成。其他與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0021]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一的不同之處是，楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備方法，按照下述步驟實現的:把馬鈴薯去皮后稱取200.0g~202.0g放入IL蒸懼水中，煮20min~30min后,過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g和瓊脂16g~20g,溶解后,調節pH為
6.5~7.5,再用蒸懼水定容至1L,即完成楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備。其他與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0022]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一的不同之處是，使用楊樹灰斑病菌產孢培養基培養楊樹灰斑病菌的方法:將楊樹灰斑病菌按楊樹灰斑病菌產孢培養基重量的10%以內接種至楊樹灰斑病菌產孢培養基上，在溫度為19°C~30°C的條件下培養7d~30d,即完成使用楊樹灰斑病菌產孢培養基培養楊樹灰斑病菌。其他與【具體實施方式】一至六之一相同。
[0023]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一的不同之處是，楊樹灰斑病菌產孢培養基培養楊樹灰斑病菌的培養條件:在溫度為22°C的條件下培養25d。其他與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0024]通過以下實施例對本發明的有益效果進行驗證:
[0025]實施例1:本實施例中楊樹灰斑病菌產孢培養基
[0026]楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備方法，按照下述步驟實現的:把馬鈴薯去皮，取201放入IL蒸餾水中，煮30min后，過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.5g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.53g和瓊脂20g,溶解后,用蒸懼水定容至1L,即完成楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備。
[0027]本實施例制備得到的楊樹灰斑病菌產孢培養基的pH為6.5~7.5。
[0028]本實施例中的楊樹灰斑病菌產孢培養基為固體產孢培養基,楊樹灰斑病菌產孢培養基的滅菌條件為溫度121°C、高壓的條件下，時間20min。
[0029]本實施例中楊樹灰斑病菌是按下述方法得到的:采取楊樹灰斑病的發病葉片(2013年從東北林業大學院內楊樹發病葉片上采集)，對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化，并經柯氏法則驗證，鏡檢分離得到的菌株為楊樹灰斑病的病原菌，并將楊樹灰斑病的病原菌貯存在4°C的環境中；其中，所述的對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化是按如下步驟進行:在無菌超凈工作臺中用無菌的毛筆，將采集到的楊樹病葉上的孢子刷下，刷到水瓊脂培養基上，在解剖鏡下，用毛細玻璃針挑起后，接種到PDA培養基上，得到的菌株即為楊樹灰斑病病原菌。將儲存在4°C冰箱的楊樹灰斑病菌取出，轉接在馬鈴薯瓊脂培養基上活化10d，即得到活化好的楊樹灰斑病的病`原菌；其中，所述的馬鈴薯瓊脂培養基(PDA培養基)的配制方法如下:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,加入蒸懼水煮30min,濾去馬鈴薯,用蒸餾水將濾液定容至1L，然后在溫度121°C、高壓的條件下滅菌20min后，待用。
[0030]本實施例中是將活化好的楊樹灰斑病菌用直徑為7mm滅菌后的打孔器打成菌餅，將菌餅接到已冷卻凝固的楊樹灰斑病菌產孢培養基中，再在溫度為22°C的條件下黑暗培養25d后,在已產孢的楊樹灰斑病菌產孢培養基上取2cmX lcmX0.4cm瓊脂塊,水洗研磨瓊脂塊計算產孢量，培養25d產孢量2.293 X IO6個孢子/毫升培養基。
[0031]圖1為實施例1中楊樹灰斑病菌在楊樹灰斑病菌產孢培養基上的產孢,從圖1中可以看出楊樹灰斑病原菌在產孢培養基上產生大量的分生孢子堆(小黑點)。
[0032]圖2為實施例1中楊樹灰斑病菌分生孢子堆，放大倍數為200倍。
[0033]圖3為實施例1中楊樹灰斑病菌發育中的分生孢梗和分生孢子,放大倍數為600圖。
[0034]圖4為實施例1中楊樹灰斑病菌分生孢子,放大倍數為600圖。
[0035]實施例2:本實施例中楊樹灰斑病菌產孢培養基
[0036]楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備方法，按照下述步驟實現的:把馬鈴薯去皮，取200放入IL蒸餾水中，煮30min后，過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.49g、磷酸氫二鉀
3.lg、硫酸鎂1.5g和瓊脂20g,溶解后,用蒸懼水定容至1L,即完成楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備。
[0037]本實施例制備得到的楊樹灰斑病菌產孢培養基的pH為6.5~7.5。
[0038]本實施例中的楊樹灰斑病菌產孢培養基為固體產孢培養基,楊樹灰斑病菌產孢培養基的滅菌條件為溫度121°C、高壓的條件下，時間20min。
[0039]本實施例中楊樹灰斑病菌時按下述方法得到的:采取楊樹灰斑病的發病葉片(2013年從東北林業大學院內楊樹發病葉片上采集)，對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化，并經柯氏法則驗證，鏡檢分離得到的菌株為楊樹灰斑病的病原菌，并將楊樹灰斑病的病原菌貯存在4°C的環境中；其中，所述的對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化是按如下步驟進行:在無菌超凈工作臺中用無菌的毛筆，將采集到的楊樹病葉上的孢子刷下，刷到水瓊脂培養基上，在解剖鏡下，用毛細玻璃針挑起后，接種到PDA培養基上，得到的菌株即為楊樹灰斑病病原菌。將儲存在4°C冰箱的楊樹灰斑病菌取出，轉接在馬鈴薯瓊脂培養基上活化10d，即得到活化好的楊樹灰斑病的病原菌；其中，所述的馬鈴薯瓊脂培養基(PDA培養基)的配制方法如下:馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂20g，加入蒸餾水煮30min，濾去馬鈴薯，用蒸餾水將濾液定容至1L，然后在溫度121°C、高壓的條件下滅菌20min后，待用。
[0040]本實施例中是將活化好的楊樹灰斑病菌用直徑為7mm滅菌后的打孔器打成菌餅，將菌餅接到已冷卻凝固的楊樹灰斑病菌產孢培養基中，再在溫度為22°C的條件下黑暗培養25d后,在已產孢的楊樹灰斑病菌產孢培養基上取2cmX lcmX0.4cm瓊脂塊,水洗研磨瓊脂塊計算產孢量，培養25d產孢量1.917 X IO6個孢子/毫升培養基。[0041]實施例3:本實施例中楊樹灰斑病菌產孢培養基
[0042]楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備方法，按照下述步驟實現的:把馬鈴薯去皮，取202放入IL蒸餾水中，煮30min后，過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.57g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.55g和瓊脂20g,溶解后,用蒸懼水定容至1L,即完成楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備。
[0043]本實施例制備得到的楊樹灰斑病菌產孢培養基的pH為6.5~7.5。
[0044]本實施例中的楊樹灰斑病菌產孢培養基為固體產孢培養基,楊樹灰斑病菌產孢培養基的滅菌條件為溫度121°C、高壓的條件下，時間20min。
[0045]本實施例中楊樹灰斑病菌時按下述方法得到的:采取楊樹灰斑病的發病葉片(2013年從東北林業大學院內楊樹發病葉片上采集)，對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化，并經柯氏法則驗證，鏡檢分離得到的菌株為楊樹灰斑病的病原菌，并將楊樹灰斑病的病原菌貯存在4°C的環境中；其中，所述的對楊樹灰斑病病原菌進行分離純化是按如下步驟進行:在無菌超凈工作臺中用無菌的毛筆，將采集到的楊樹病葉上的孢子刷下，刷到水瓊脂培養基上，在解剖鏡下，用毛細玻璃針挑起后，接種到PDA培養基上，得到的菌株即為楊樹灰斑病病原菌。將儲存在4°C冰箱的楊樹灰斑病菌取出，轉接在馬鈴薯瓊脂培養基上活化10d，即得到活化好的楊樹灰斑病的病原菌；其中，所述的馬鈴薯瓊脂培養基(PDA培養基)的配制方法如下:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,加入蒸懼水煮30min,濾去馬鈴薯,用蒸餾水將濾液定容至1L，然后在溫度121°C、高壓的條件下滅菌20min后，待用。
[0046]本實施例中是將活化好的楊樹灰斑病菌用直徑為7mm滅菌后的打孔器打成菌餅，將菌餅接到已冷卻凝固的楊樹灰斑病菌產孢培養基中，再在溫度為22°C的條件下黑暗培養25d后,在已產孢的楊樹灰斑病菌產孢培養基上取2cmX lcmX0.4cm瓊脂塊,水洗研磨瓊脂塊計算產孢量，培養25d產孢量2.267 X IO6個孢子/毫升培養基。
【權利要求】
1.楊樹灰斑病菌產孢培養基，其特征在于每IL楊樹灰斑病菌產孢培養基是由馬鈴薯200.0g~202.0g、蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g、瓊脂16g~20g和余量蒸餾水制成。
2.根據權利要求1所述的楊樹灰斑病菌產孢培養基，其特征在于所述的楊樹灰斑病菌產孢培養基的pH為6.5~7.5。
3.根據權利要求1所述的楊樹灰斑病菌產孢培養基，其特征在于每IL楊樹灰斑病菌產孢培養基是由馬鈴薯201g、蛋白胨0.5g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.53g、瓊脂20g和余量蒸懼水制成。
4.根據權利要求1所述的楊樹灰斑病菌產孢培養基，其特征在于每IL楊樹灰斑病菌產孢培養基是由馬鈴薯200g、蛋白胨0.49g、磷酸氫二鉀3.lg、硫酸鎂1.5g、瓊脂20g和余量蒸餾水制成。
5.根據權利要求1所述的楊樹灰斑病菌產孢培養基，其特征在于每IL楊樹灰斑病菌產孢培養基是由馬鈴薯202g、蛋白胨0.57g、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂1.55g、瓊脂20g和余量蒸懼水制成。
6.如權利要求1所述的楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備方法，其特征在于楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備方法，按照下述步驟實現:把馬鈴薯去皮后稱取200.0g~202.0g放入IL蒸懼水中，煮20min~30min后,過濾得濾液，向濾液中加入蛋白胨0.4g~0.6g、磷酸二氫鉀2.9g~3.lg、硫酸鎂1.4g~1.6g和瓊脂16g~20g,溶解后,調節pH為6.5~7.5,再用蒸餾水定容至1L，即完成楊樹灰斑病菌產孢培養基的制備。
7.使用如權利要求1所述的楊樹灰斑病菌產孢培養基的方法，其特征在于使用楊樹灰斑病菌產孢培養基培養楊樹灰斑病菌產孢的方法如下:將楊樹灰斑病菌按楊樹灰斑病菌產孢培養基重量的10%以內接種至楊樹灰斑病菌產孢培養基上，在溫度為19°C~30°C的條件下培養7d~30d,即完成使用楊樹灰斑病菌產孢培養基培養楊樹灰斑病菌。
8.根據權利要求7所述的使用楊樹灰斑病菌產孢培養基的方法，其特征在于所述的在溫度為22°C的條件下培養25d。
【文檔編號】C12R1/645GK103725640SQ201410018545
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】馬玲, 劉雪英, 劉雪峰, 沙依拉·帕那西, 晁開瑞 申請人:東北林業大學