重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑及其應用。獲得重組野生型cC的方法是：利用pGAPZαA載體構建野生型cC的表達系統；重組野生型cC在畢赤酵母X-33中表達；重組野生型cC的分離純化。對重組野生型cC對鰱魚魚糜凝膠劣化抑制作用的檢測方法是：魚糜樣品的制作；對所取魚糜樣品進行溫浴處理，加重組野生型cC和未加cC成為對照組；處理樣品進行SDS-PAGE，觀察結果。本發明驗證了重組野生型cC可以直接加入魚糜制品中，能明顯抑制魚糜制品的凝膠劣化，在加工過程中能較好的保持其彈性，且其安全、無毒，有著良好的應用前景。
【專利說明】重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑(chicken cystatin, cC)及其應用，屬于基因工程、分子生物學和微生物學領域。
【背景技術】
[0002]魚肉被公認為是營養健康食物，不僅可以提供維持身體機能不可缺少的營養物質，而且能起到強身健體、延年益壽的作用，因此魚肉在人們日常膳食生活中占有重要地位。
[0003]魚糜制品也叫魚肉煉制品，其主要原料為魚肉，是指將魚體經過采肉、漂洗、脫水，再精濾而制得的濕的肌肉蛋白濃縮物，使其成為了具有彈性的并且易于制作成各種形狀與各種風味的水產食物，如我國沿海地區的傳統魚丸、魚面、魚糕、魚卷以及魚腸等。近年來，隨著我國漁業和加工技術的發展，由于魚糜制品風味多樣、方便可口、營養價值高、易于生產且節約能源等優點，我國的魚糜制品行業取得了長足進展，在世界食品原料市場上，前景十分廣闊。
[0004]目前魚糜生產的原料主要是海水魚，如阿拉斯加鱈、太平洋鱈。但是近年來由于過度捕撈和環境污染的影響，海水魚資源日益減少，魚糜生產的原料問題日益凸現。與此同時我國淡水魚產量很高，大量的淡水魚資源有望成為我國魚糜生產的另一原料來源。鰱魚是我國重要的淡水養殖魚種，由于技術方面等原因，大量鰱魚蛋白資源長期得不到有效的利用。鰱魚是著名的四大家魚之一，分布在全國各大水系，是我國淡水魚中分布最廣泛的，主要生活在水中的表層。鰱魚肉質鮮嫩，營養豐富，能提供豐富的膠質蛋白，是補氣、暖胃、潤澤肌膚的養生食品。鰱魚具有生長快、疾病少、不需專門人工投飼的特點，較宜養殖，為我國主要的淡水養殖魚類之一。目前仍是池塘養殖特別是城郊養魚的主體魚，產量居首位，特別是在江蘇、浙江一帶，產量占養殖總產量的40%-60%。因此鰱魚魚糜的開發一方面可以充分利用鰱魚資源，另一方面又可`以為魚糜生產提供穩定的新原料，意義重大。
[0005]但是，消費者對魚糜制品品質有較高的要求，尤其是作為“火鍋料理”的魚糜制品在口味上要求它在沸水中煮過之后仍能保持較高的彈性，吃起來要求滑爽，有嚼頭，不油膩等。這對魚糜制品提出了較高的要求。魚糜制品的硬度、伸縮性以及粘性的綜合體現即為其彈性，其主要由魚糜中的蛋白質凝膠情況決定，因此凝膠化是魚糜制品的關鍵。
[0006]魚糜蛋白質在凝膠形成過程中主要可分三個階段，即凝膠化、凝膠劣化及魚糕化。魚糜蛋白質中60%以上是鹽溶性的肌原纖維蛋白，肌原纖維蛋白中肌球蛋白占60%，肌動蛋白占20%，其他為不溶性蛋白。肌原纖維蛋白質，是魚肉形成彈性凝膠體的主要成分。在魚糜制品加工過程中，經過漂洗、擂潰再加入一定量的食鹽，可將鹽溶性的肌原纖維蛋白充分溶解出，使魚糜呈現出一種溶膠的狀態，為魚糜蛋白低溫凝膠化做準備。魚糜蛋白凝膠化一般發生在50°C以下，所以又叫低溫凝膠化。隨著溫度的升高，達到50-70°C之間，魚糜形成的凝膠網絡發生分裂或斷裂，使魚糜彈性大幅下降，發生凝膠劣化現象。當溫度進一步升高時，達到85°C以上，魚糜變成有序和非透明狀，魚糜蛋白形成的網絡結構被固定形成凝膠，并將水分及其他加入的輔料包裹在里面，魚糜凝膠的彈性和硬度大幅提高，最后完成魚糕化。
[0007]凝膠劣化的原因是魚糜中內源性組織蛋白酶降解蛋白質，使蛋白質網絡斷裂所致。魚糜中內源性組織蛋白酶不僅在魚糜生產及冷藏過程中不易失去活性，且在500C -70°C這個溫度段活性最高。肌球蛋白是形成魚糜凝膠網絡結構的最重要的蛋白質，而MHC(肌球蛋白重鏈)又是肌球蛋白分子中參與凝膠結構的最主要的部分。因此在500C -70°C下內源性組織蛋白酶會引起魚糜的MHC (肌球蛋白重鏈)分解而造成解膠，這種降解會造成凝膠劣化，降低魚糜質量。因此，抑制魚糜凝膠劣化，保持其彈性顯得尤為重要。
[0008]魚肉制品的腐爛會給人體帶來諸多健康危害，而最近由日本地震引發的核污染及頻繁發生的近海水域原油污染更使魚肉制品的生產及冷藏工作日趨受到重視。目前我省市場上常用的肉類防腐劑雖種類較多但大多屬化學添加劑，存在安全隱患。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是提供一種重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑(chickencystatin, cC),可以抑制魚糜制品凝I父劣化，對魚糜制品具有保鮮作用。
[0010]本發明采用的技術方案是:重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其制備方法如下:
1)獲得野生型CC的cDNA，通過PCR的方法在cC的cDNA的兩端添加XhoI和Xba I的切割位點序列； 2)pGAPZaA_cC重組質粒的構建:利用限制性內切酶ZAo/和油a /同時處理野生型cC的cDNA與pGAPZ a A質粒載體，通過T4 DNA連接酶將目的基因連接到載體上，獲得含有cC目的基因的重組質粒pGAPZ α Α-cC ；
3)pGAPZ a A_cC重組質粒的表達:將上述重組質粒pGAPZ a A_cC用Jkt //線性化后，通過電轉法將其轉化到畢赤酵母X-33中，選取已經成功轉化的菌落，在5mL YPD培養基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中活化12h，再以1%的比例接入新的YPD培養基中30°C、200-250rpm培養72h，得菌液；
4)分離純化:經過Yro培養三天后的菌液，首先3000Xg，4°C，離心lOmin，除去菌體留上清液，再11900Xg，4°C，離心40min，除去不溶性蛋白聚集體，所剩上清液經LabScal TFFSystem濃縮至體積為50_100mL，用20mM，pH5.0的醋酸緩沖液將其稀釋到5倍體積后，樣品通過CM-Toyopearl離子交換柱，用醋酸緩沖液溶解的0.1M-0.5M的NaCl進行梯度洗脫，與紫外檢測儀連接，洗脫峰下的溶液即含有重組的cC，再將收集的混合液經過夜透析除鹽存于_80°C冰箱，最后真空冷凍成粉末，即得到目標產物重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑。
[0011]上述的重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑在抑制魚糜制品凝膠劣化中的應用。方法如下:于魚糜制品中，加入上述的重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑，混合均勻，于50-60°C加熱15-90分鐘，然后升溫至95-105°C，繼續加熱20-40分鐘。優選的，重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑的加入量為魚糜制品重量的0.1%-0.4%。
[0012]本發明的有益效果是:本發明成功的在畢赤酵母X-33轉化體中以溶解態的形式對cC進行了克隆和表達。所制備的重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以直接加入魚糜制品中，能明顯抑制魚糜制品的凝膠劣化。而且，在加工過程中能較好的保持其彈性。由于其安全、無毒，添加到魚糜制品中不會對其風味產生影響。本發明的重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑作為一種天然蛋白，可有效抑制魚糜制品的凝膠劣化，也有抑菌作用，添加到魚糜制品中還可以作為生物保鮮劑，本發明的重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑安全、無毒，有著良好的應用前景，具有極大的經濟、社會及環境效益，市場應用潛力巨大。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1是重組質粒pGAPZ a A_cC的單雙酶切驗證圖。
[0014]圖2是SDS-PAGE檢測在畢赤酵母中表達的重組野生型cC的分離純化結果。
[0015]圖3是SDS-PAGE檢測溫浴處理中，重組野生型cC對鰱魚魚糜凝膠劣化的影響。
[0016]圖4是SDS-PAGE檢測用量中，重組野生型cC對鰱魚魚糜凝膠劣化的影響。
[0017]圖5 是 SDS-PAGE 凝膠經 AlphaeaseFC? 分析。
【具體實施方式】
[0018]實施例1重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑(重組野生型cC)的獲得 1.獲得野生型cC的cDNA:
首先將含有雞cystatin cDNA的pT7 blue T載體(日本山口大學農學部加藤昭夫教授贈予)用包含通ο /和油a /切割位點序列的PCR引物(正義引物5’ —GGGCTCGAGAAAAGAAGCGAGGA—3’，5’ 一GGGTCTAGATTACTGGCACTTGCT— 3’ 反義引物)擴增，獲得野生型cC的cDNA。
[0019]2.利用pGAPZ `a A載體構建重組質粒pGAPZ a A_cC
pGAPZ a A質粒是具有Zeocin抗性基因的表達載體，是含有能用葡萄糖誘導及在酵母中高水平表達的GAP啟動子的表達載體。利用限制性內切酶ZAo /和油<3 /同時處理野生型cC的cDNA與pGAPZ a A質粒載體，通過T4 DNA連接酶將目的基因連接到載體上，獲得含有cC目的基因的重組質粒pGAPZ αΑ-cC。將獲得的重組質粒用限制性內切酶ZAo /和Xba /做單雙酶切驗證，結果見圖1。
[0020]圖1中，M為DNA Marker, I道為pGAPZ a A質粒單酶切；2道為pGAPZ a A_cC重組質粒單酶切；3道為pGAPZaA-cC重組質粒雙酶切；4道為pGAPZ a A質粒雙酶切。從圖中可看出，2道中pGAPZ a A_cC重組質粒比I道中pGAPZ a A質粒分子量稍大，3道中對pGAPZ a A_cC重組質粒雙酶切得到一個大片段一個小片段，大片段與pGAPZ a A質粒分子量相同，小片段是cC的cDNA。證明目的片段已經連接到載體上，重組質粒pGAPZ a A-cC構建成功。
[0021]3.重組野生型cC在畢赤酵母中的表達
將上述重組質粒pGAPZ a A-cC用Jkt//線性化后，通過電轉法將其轉化到畢赤酵母X-33中。選取已經成功轉化的菌落，在5mL YPD培養基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中活化12h后，再以1%的比例接入新的YPD培養基中30°C、200-250rpm培養72h。
[0022]4.重組野生型cC的分離純化
經過YPD培養三天后的菌液，首先3000Xg，4°C，IOmin離心除去菌體留上清液，再11900Xg，4°C離心40min除去不溶性蛋白聚集體。所剩上清液經LabScal TFF System濃縮至體積為50-100mL后，再用20mM，pH5.0的醋酸緩沖液將其稀釋到5倍體積。樣品通過CM-Toyopearl離子交換柱，用醋酸緩沖液溶解的0.1M_0.5M的NaCl進行梯度洗脫。與紫外檢測儀連接，洗脫峰下的溶液即含有重組的cCs，經計算洗脫下cCs的鹽濃度在0.2M-0.3M范圍內。再將獲得的混合液經過夜透析除鹽存于_80°C冰箱，最后真空冷凍成粉末即為重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑。將洗脫后的產品做SDS-PAGE電泳圖，結果見圖2。
[0023]圖2中，M為蛋白Marker，第1_9道分別為在洗脫峰下收集的1_9號試管中采集的樣品。從圖2中可以看出，3-6號管中有重組野生型cC，分子量約為14KD，基本沒有雜蛋白帶。證明我們成功得構建了野生型cC表達系統，成功得在畢赤酵母X-33中表達，并且通過CM-Toyopearl離子交換柱達到了較好的分離純化效果。
[0024]實施例2 重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑(重組野生型cC)對鰱魚魚糜制品凝膠劣化的影響
1.魚糜樣品的制作
將新鮮的魚洗凈、去鱗、頭及內臟，除去腹腔的黑膜，采集魚肉，將魚肉經過兩次4°C遇冷的蒸餾水漂洗，紗布浙干，而后添加相當于魚肉質量3%的NaCl，置于研缽中，加入4V遇冷的20 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0)于冰上研磨，研磨勻漿lOmin，直至溶液呈稀薄狀，得魚糜粗樣品。
[0025]2.重組野生型cC歲鰱魚魚糜凝膠劣化的抑制作用
將得到的魚糜粗樣品，分成9份裝于離心管中并標號，每份大約0.Sg。其中6-9號離心管中每管添加重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑2mg，混合充分。
[0026]I)溫浴處理:按表1所示處理溫度和處理時間對1-9號離心管進行實驗操作。
【權利要求】
1.重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其特征在于制備方法如下: 1)獲得野生型CC的cDNA，通過PCR的方法在cC的cDNA的兩端添加沿οI和油a I的切割位點序列； 2)pGAPZ a A_cC重組質粒的構建:利用限制性內切酶通ο I和Xba /局奴處理野生型cC的cDNA與pGAPZ a A質粒載體，通過T4 DNA連接酶將目的基因連接到載體上，獲得含有cC目的基因的重組質粒pGAPZ α Α-cC ； 3)pGAPZ a A_cC重組質粒的表達:將重組質粒pGAPZ a A_cC用Avr //線性化后，通過電轉法將其轉化到畢赤酵母X-33中，選取已經成功轉化的菌落，在5mL YPD培養基中活化12h，再以1%的比例接入新的YPD培養基中30°C、200-250rpm培養72h，得菌液； 4)分離純化:將菌液，首先3000Xg，4°C，離心lOmin，除去菌體，留上清液，再11900 X g，4。。，離心40min,除去不溶性蛋白聚集體，所剩上清液經LabScal TFF System濃縮至體積為50-100ml，用20mM，pH5.0的醋酸緩沖液將其稀釋到5倍體積后，樣品通過CM-Toyopearl離子交換柱，用醋酸緩沖液溶解的0.1M_0.5M的NaCl進行梯度洗脫，將收集的混合液經過夜透析除鹽存于_80°C冰箱，最后真空冷凍成粉末，得目標產物。
2.權利要求1所述的重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑在抑制魚糜制品凝膠劣化中的應用。
3.按照權利要求2所述的應用，其特征在于方法如下:于魚糜制品中加入權利要求1所述的重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑，混合均勻，于50-60°C加熱15-90分鐘，然后升溫至95-105 °C，繼續加熱20-40分鐘。
4.按照權利要求3所述的應用，其特征在于:重組野生型雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑的加入量為魚糜制品重量的0.1%-0.4%。
5.按照權利要求3或4所述的應用，其特征在于:所述的魚糜制品是鰱魚魚糜。
【文檔編號】C12N15/81GK103773794SQ201410018387
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】何劍為, 王娜, 王禹, 賀敏, 周倩, 時博陽 申請人:遼寧大學