一種煙草疫霉菌lamp引物及其快速檢測方法

一種煙草疫霉菌lamp引物及其快速檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種煙草疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于煙草疫霉菌特異檢測。主要采用設計了一種煙草疫霉菌的LAMP引物：F3、B3、FIP、BIP，序列如SEQIDNO.1-4所示，經過恒溫擴增和加入SYBRgreenⅠ顯色劑顯色或瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到綠色熒光或出現LAMP特征性的梯形帶。所發明的LAMP引物及其用法可被用于生產實踐中煙草疫霉菌感染的植株和土壤中煙草疫霉菌的快速、靈敏、準確的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測和鑒定，為煙草疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技術和理論依據。
【專利說明】—種煙草疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種煙草疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于煙草疫霉菌高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間煙草疫病的早期診斷和病菌的監測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治【技術領域】。
【背景技術】
[0002]由煙草疫霉菌(Phytophthora nicotianae Breda de Haan)引起的煙草黑胚病是一種毀滅性世界病害。1896年van Breda de Haan在印度尼西亞的爪睡首次發現,此后該病流行蔓延迅速，1922年便成為美國的佛羅里達、堪薩斯州煙區的嚴重病害。1924年后，該病己遍布于全世界溫帶、亞熱帶和熱帶地區煙田。中國于1950年首次報道，當時該病發生在黃淮煙區，目前各主要產煙區均有不同程度的發生，其中安徽、山東、河南為歷史上的重病區；云南、貴州、四川、湖南、廣東、廣西、福建等南方煙區發生亦相當普遍，平均發病率為5%-12%，嚴重田塊發病率高達75%，甚至造成絕收。煙草疫霉的寄主范圍很廣，可以侵害數百種植物，病害通常在潮濕、多雨條件下發病重，潛育期短，可多次再侵染，傳播與蔓延迅速，常造成寄主植物成片死亡。近年來，由于我國連作煙田面積不斷擴大，連作年限不斷增加，加重了該病害的流行，我國平均每年因煙草黑脛病造成的經濟損失達I億元以上，僅次于煙草病毒病。該病屬于維管束系統性病害，一旦發生就很難控制，對煙草威脅極大，并常與其他煙草根莖部病害混合發生，給病害的診斷造成困難，而生產上則常因不明發病原因，難以有針對性的防治措施，故造成更為嚴重危害。因此建立煙草疫霉菌快速檢測體系，早期對發病植株及土壤進行疫霉菌快速準確檢測，對預測病害發生情況、及時采取有效的防治措施控制病原菌的傳播和流行、減少經濟損失都具有重要的理論和實際意義。
[0003]傳統煙草疫霉菌的分類鑒定主要是基于形態學特征、致病性測定、生理生化特性等，程序繁瑣，所需時間較長，鑒定時還易受人為及環境等諸多因素的干擾，而且不能直接從植物組織中檢測出病原菌 ，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最佳時期，而免疫血清學鑒定方法雖已建立，但是特異性較差，常常受到抗血清質量的影響，容易造成假陽性，因此這些方法的應用均受到一定的限制。因此，建立一套快速、靈敏、準確的煙草疫霉菌檢測診斷技術不僅非常必要，而且十分迫切。
[0004]PCR技術為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的優勢，然而目前PCR特異性檢測技術仍然需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，限制了 PCR檢測方法的推廣應用。循環恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,簡稱 LAMP)是 2000 年由日本榮研株式會社Notomi等人開發的一種新型循環恒溫核酸擴增技術。LAMP反應針對靶基因的6個位點設計出4條引物,利用一種鏈式置換活性的DNA聚合酶(fci DNA polymerase),在恒溫條件下(60 - 650C )保溫30 - 90分鐘，即可完成擴增反應。由于LAMP反應的高效性和等溫快速擴增的特點，在90分鐘內可擴增IO9 - 101°倍產物。LAMP擴增產物的檢測一般采用熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度觀察等方法。由于LAMP反應簡單、快速、高效、經濟等特征，因而具有極為廣泛的應用前景。目前LAMP檢測主要應用于人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測，在植物病原菌檢測中報道極少，煙草疫霉菌的檢測國內外均未見報道。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于針對現有技術中煙草疫霉菌的生物學檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差，靈敏度低的問題，提供一種煙草疫霉菌的LAMP檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的煙草疫霉菌的快速檢測方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
1.LAMP引物的設計
我們從GenBank中下載煙草疫霉Ypt (登錄號JN678924.1)基因序列，根據煙草疫霉Ypt基因序列,采用PrimerExplorer V4軟件設計一種LAMP檢測引物,包括2條外引物(F3和B3)和2條內引物(FIP和BIP)，引物序列分別為:
F3: AAATCACGTGTGTGTCTGTAGT ；
B3: ACAGGCGTATCTGTAAATCAGTG ；
FIP: CCGTCACGTCGTACACCACAATA-CGTTTCCGCACGATCACTAG ；
BIP: TGTGAAACAGTGGCTGCATGAGA-CACTCAGCTCTTTTCCTTGGA。
[0007]2.煙草疫霉菌快速檢測體系的建立
一種煙草疫霉菌的LAMP引物的檢測方法是利用所述的LAMP引物進行LAMP反應，25 μ I 反應體系中 F3 與 Β3 各 0.2-0.25 μ M，FIP 與 BIP 各 1.5-1.7yM,20mM Tris-HCl, IOmM(NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0, lwt.% 吐溫_20，0.8M 甜菜堿，1.4 mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，10-50ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0008]所述LAMP 反應條件為在 60-65°C溫育 30-90 min, 80°C保溫 5-lOmin。
[0009]所述的檢測方法為熒光染料目測觀察法和瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測觀察法:在LAMP反應的擴增產物中加入I μ I顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；或取2μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現梯形條帶判斷為陽性，沒有出現則判斷為陰性。
[0010]該方法可用于帶菌的植株和土壤的高靈敏度快速檢測。建立煙草疫霉菌快速、簡便、特異性強、靈敏度高的監測技術體系，對于煙草疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
[0011]本發明的關鍵性技術是煙草疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了驗證煙草疫霉菌的特異引物序列，本發明以我國福建、云南、山東、廣西、河北和臺灣等省的39株煙草疫霉菌和12種其它卵菌以及28種病原真菌為供試材料，采用CTAB法提取組織中煙草疫霉菌的DNA。具體方法如下:取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入900 μ I 2% CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取液(提取液的配方為:2% CTAB;100m mol/L Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，pH 8.0 ；20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和90 μ I 10% SDS (十二烷基苯磺酸鈉)后混勻，于55~60°C水浴1.5 h,每10 min振蕩混勻一次,水浴1.5h后離心(12, OOOrpm) 15min,取上清液加入與上清液等體積的酚/氯仿/異戊醇(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1 )，離心(12，OOOrpm) 5 min,取上清液(水相),加入與上清液等體積的氯仿抽提一次(12，OOOrpm)離心5min,吸上清(350 μ I )，加0.1體積(35 μ I)的3mol/L NaAC溶液和2體積(700 μ I)的冰無水乙醇，-20°C下沉淀30min后12，OOOrpm離心5 min,輕輕地倒去上清液,加入700 μ I冰70%乙醇進行洗滌(稍離心，傾掉上清)，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用IXTE(10mmol/L Tris-HCl10.lmmol/L EDTA, pH8.0)溶液進行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至25ng/ μ I待用。
[0012]經對供試菌株和39株煙草疫霉菌的特異性進行LAMP驗證。
[0013]除了來自我國福建、云南、山東、廣西、河北和臺灣等省的39株煙草疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測出現LAMP特征性的梯形帶外，檢測了 28種真菌菌株和12種其他卵菌顯色結果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現擴增條帶。這說明該引物可被用于生產實踐中發病組織及土壤中煙草疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。
[0014]①當在用于煙草組織中存在煙草疫霉菌時，采用NaOH快速裂解法提取煙草疫霉菌的DNA，具體過程如下:(1)將煙草病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發病部位；(2)按Img病葉加入10 μ I (0.5mol/L NaOH, 0.5%PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，在12，OOOg離心機中離心5min ； (3)取上清20 μ I與等體積的0.1 mol/L的Tris-HCl (ρΗ8.0)混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍液，分別取I μ I原液、10倍、100倍、1000倍液作為PCR模板進行擴增。
[0015]②當在用于煙草土壤中存在煙草疫霉菌時，采用土壤DNA提取法提取土壤中煙草疫霉菌的DNA。具體方法如下:取過篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細粉分裝至1.5 ml離心管中，每管加入500 μ I 0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻。12000 rpm離心15 min。取上清加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為10 μ g/ml蛋白酶K，55°C水浴1-3 h。水浴結束后，加入1/2體積的7.5 M NH4AC溶液，上下顛倒混勻。12000 rpm離心15 min。吸上清加2倍體積無水乙醇_20°C沉淀(沉淀時間1.5 h)。沉淀結束后，12000 rpm離心15 min。用70%乙醇洗滌沉淀后傾去，室溫晾干。每份樣品所提DNA用10 μ I TE (或無菌超純水)溶解，_20°C保存備用。
[0016]按如下LAMP反應體系和反應條件用所設計的引物進行檢測:
① LAMP 反應體系 25 μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.2 μ M，FIP 與 BIP 各 1.6 μ M，20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0.8M Betaine, 1.4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在63°C溫育65 min，82°C保溫lOmin。
[0017]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入I μ I顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光，或取2 μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果出現LAMP特征性的梯形帶，即可判斷所述的煙草組織或土壤中存在煙草疫霉菌；否則所述的煙草組織或土壤中未存在煙草疫霉菌。
[0018]本發明有益效果:本發明方法適用于發病組織或土壤中煙草疫霉菌的快速可靠的檢測和鑒定，對于農業生產中煙草疫霉菌引起的病害防治具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果:
1、結果可靠:本發明所設計出的LAMP檢測引物，已經對源于中國福建、云南、山東、廣西、河北和臺灣等地的煙草疫霉菌和帶煙草疫霉菌的土樣、植物組織進行了測試驗證，因此結果可靠性具有充分的保證；
2、特異性強:本發明所采用的LAMP引物是針對煙草疫霉菌基因序列中6個不同區域設計出4條特異性引物，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故特異性高。
[0019]3、靈敏度高:LAMP對煙草疫霉菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10fg，比常規PCR檢測高1000倍。
[0020]4、實用性好:本發明所設計出的LAMP引物，可用于帶煙草疫霉菌的組織和土壤的高靈敏度快速檢測，因此本方法的實用性強，可滿足對帶菌組織和土壤中存在的煙草疫霉菌進行快速可靠的檢測和鑒定的需要。
[0021]5、操作簡便快速:應用本發明方法，對帶煙草疫霉菌的組織和土壤進行檢測可在I小時內完成，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需一個水浴鍋即可，不需要復雜的儀器設備和昂貴的分子試劑，結果肉眼直接可見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發明煙草疫病菌的特異LAMP檢測結果圖。圖1中A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中:泳道M為DL 2000 DNA marker，泳道I為陰性對照，泳道2為陽性對照，泳道3-11為其他卵菌和真菌菌株；圖1中B表示顯色結果，其中:第I管為陰性對照，第2管為陽性對照，第3 - 11管為其他卵菌和真菌菌株(見實施例1)。
[0023]圖2為本發明煙草疫病菌的LAMP靈敏性檢測結果圖。圖2中A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中:泳道M為DL 2000 DNA marker，泳道1- 10模板濃度分別為100 pg，10 pg, I pg, 100 fg, 10 fg, I fg, 100 ag IOag and lag ;圖 2 中 B 表不顯色結果，其中:第
1-10 管模板濃度分別為 100 pg, 10 pg, I pg, 100 fg, 10 fg, I fg, 100 ag IOag and lag(見實施例2)。
[0024]圖3為本發明對發病植株和土壤的檢測結果圖。圖3中A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中:泳道I為陽性對照；泳道2為陰性對照，泳道3、4為發病土壤，泳道6、9、
10、11、13、14、17、18為發病組織，泳道5、7、8、12、15、16為健康組織;泳道]?為DL 2000 DNAmarker ;圖3中B表示顯色結果，其中--第I管為陽性對照，第2管為陰性對照，第3、4管為發病土壤，第6、9、10、11、13、14、17、18管為發病組織，第5、7、8、12、15、16管為健康組織(見實施例3)。
【具體實施方式】
[0025]本發明的技術內容包括煙草疫霉菌的LAMP檢測引物，LAMP引物及其序列分別為: F3: AAATCACGTGTGTGTCTGTAGT
B3: ACAGGCGTATCTGTAAATCAGTG
FIP: CCGTCACGTCGTACACCACAATA-CGTTTCCGCACGATCACTAG
BIP: TGTGAAACAGTGGCTGCATGAGA-CACTCAGCTCTTTTCCTTGGA
利用LAMP引物檢測煙草疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶。
[0026]主要試劑'Bst DNA聚合酶大片段購自英國NEB公司；DNA marker購自寶生物工程大連有限公司；其余試劑均購自生工生物(上海)技術有限公司。引物由生工生物(上海)技術有限公司合成。[0027]實施例1:LAMP引物對煙草疫霉菌的特異性擴增 1.煙草疫霉菌的LAMP特異檢測
① LAMP 反應體系 25 μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.2 μ M，FIP 與 BIP 各 1.6 μ M，20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0.8M Betaine, 1.4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在65°C溫育60 min，82°C保溫lOmin。
[0028]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入I μ I顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2 μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0029]2.檢測結果
檢測的特異性:除了來自我國福建、云南、山東、廣西、河北和臺灣等省的39株煙草疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶外，檢測了12種其他卵菌和28種真菌菌株顯色結果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現擴增條帶(部分結果見圖1)，說明此引物具有很強的特異性。
[0030]實施例2 =LAMP引物對煙草疫霉菌的靈敏性檢測
1.煙草疫霉菌的LAMP靈敏性檢測
采用10倍濃度系列稀釋法將提取的煙草疫霉菌DNA稀釋成100 pg，10 pg, I pg, 100fg, 10 fg, I fg, 100 ag IOag and lag 共 9 個不同濃度梯度。
[0031]①LAMP 反應體系 25 μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.2 μ M，FIP 與 BIP 各 1.6 μ M，20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0.8M Betaine, 1.4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合 酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在65°C溫育60 min，82°C保溫lOmin。
[0032]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入I μ I顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2 μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0033]2.檢測結果:煙草疫霉菌LAMP靈敏性檢測，顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶,檢測靈敏度可達IOfg (見圖2)。
[0034]實施例3:發病組織或土壤中煙草疫霉菌的檢測。
[0035]1.樣品采集:植物組織及土壤樣品采自福建南平市煙草生產基地。
[0036]2.DNA提取及檢測
發病植物組織采用NaOH快速裂解法提取煙草疫霉菌DNA，發病土壤采用土壤DNA提取法提取煙草疫霉菌的DNA。
[0037]按下述方法進行LAMP檢測:
① LAMP 反應體系 25 μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.2 μ M，FIP 與 BIP 各 1.6 μ M，20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0.8M Betaine, 1.4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在65°C溫育60 min，82°C保溫lOmin。
[0038]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入I μ I顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2 μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0039]3.檢測結果
如圖3所示，發病組織或土壤中感染煙草疫霉菌，顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶，健康組織顯色結果則觀察到橙色熒光或瓊脂糖凝膠電泳未出現LAMP特征性的梯形帶。
[0040]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的 涵蓋范圍。
【權利要求】
1.一種煙草疫霉菌的LAMP引物，其特征在于:所述LAMP引物為:
F3: AAATCACGTGTGTGTCTGTAGT ；
B3: ACAGGCGTATCTGTAAATCAGTG ；
FIP: CCGTCACGTCGTACACCACAATA-CGTTTCCGCACGATCACTAG ；
BIP: TGTGAAACAGTGGCTGCATGAGA-CACTCAGCTCTTTTCCTTGGA。
2.一種如權利要求1所述的煙草疫霉菌的LAMP引物的檢測方法，其特征在于:利用所述的LAMP引物進行LAMP反應，25 μ I反應體系中F3與Β3各0.2-0.25 μ Μ, FIP與BIP各1.5-1.7yM,20mM Tris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0, lwt.% 吐溫_20，0.8Μ甜菜堿，1.4 mM dNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，10_50ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足。
3.根據權利要求2所述的煙草疫霉菌的LAMP引物的檢測方法，其特征在于:所述LAMP反應條件為在60-65°C溫育30-90 min，80°C保溫5-10min。
4.根據權利要求2所述的煙草疫霉菌的LAMP引物的檢測方法，其特征在于:在LAMP反應的擴增產物中加入I μ I顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；或取2μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現梯形條帶判斷為陽性， 沒有出現則判斷為陰性。
【文檔編號】C12N15/11GK103773865SQ201410017199
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】陳慶河, 李本金, 劉裴清, 謝世勇, 翁啟勇 申請人:福建省農業科學院植物保護研究所