用于以rt-lamp法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物、試劑盒、檢測方法

用于以rt-lamp法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物、試劑盒、檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物、試劑盒、檢測方法。該引物包括HTNV引物組和SEOV引物組，兩引物組分別包括外引物對，內引物對，以及環引物對，其序列如SEQ?ID?NO:3-14所示。該試劑盒包括上述引物、反應緩沖液及酶液。該檢測方法包括：配制反應液A、B，加入待測核酸樣品，反應，結束反應并鑒定結果。本發明結果可靠，能快速、高效、高特異性、高靈敏性的檢測腎綜合征出血熱病毒，并準確分型。
【專利說明】用于以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物、試劑盒、檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物、試劑盒、及檢測方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]據 申請人:了解，腎綜合征出血熱病毒(HFRS病毒)屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，是有包膜分節段的單股負鏈RNA病毒。腎綜合征出血熱病毒可引發腎綜合征出血熱(haemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS),該病征的典型臨床特征為發熱、出血、低血壓和腎衰竭，是一種病死率較高的急性傳染病，屬于自然疫源性疾病，主要傳染源為黑線姬鼠、褐家鼠等鼠類宿主動物。在感染途徑方面，與布尼亞病毒科其他屬的病毒不同，HFRS病毒可經接觸嚙齒類動物的排泄物、呼吸分泌物等直接感染。HFRS的疫源區分布廣泛，病例報道多集中于山區和丘陵地帶，而這些區域的醫療資源相對匱乏。
[0003]HFRS病毒在全球分布廣泛，每年全球有6~10萬例HFRS報告病例；同時，中國是全球HFRS疫情最為嚴重的國家，歷年報告的HFRS病例數約占世界病例總數的90%左右。在1950~2007年之間，我國共報告I 557 622例HFRS患者，死亡46 427例，病死率達3%，成為嚴重危害人民群眾健康的公共衛生問題。針對這種急性危重傳染病，快速，準確，簡便，低廉的早期診斷對于提高HFRS的救治成功率無疑非常重要。
[0004]HFRS病毒分為不同型別:漢灘病毒(I型，HTNV，又稱野鼠型)、漢城病毒(II型，SE0V，又稱家鼠型)、普馬拉病毒(III型，又稱棕背鼠型)、希望山病毒(IV型，又稱草原田鼠型)、泰國病毒(V型)、Dobrava病毒(VI型)、Thottapalaym病毒(YD型)等。目前在我國疫區內的HFRS病毒，均為漢灘病毒(HTNV)或漢城病毒(SE0V)。
[0005]目前我國的HFRS疫區主要集中在醫療條件落后的山區，而漢灘病毒(HTNV)與漢城病毒(SEOV)感染引起的HFRS病情嚴重程度是不同的，一般來說，漢灘病毒(HTNV)感染引起的病情重，漢城病毒(SEOV)感染引起的病情輕；此外，漢灘病毒(HTNV)和漢城病毒(SEOV)分別為野鼠型疫區和家鼠型疫區的優勢流行株，而混合型疫區則兩型毒株并存。近年調研表明，隨著疫區宿主動物的遷徙變化，原有的野鼠型疫區有向混合型疫區的趨勢，同時原有的混合型疫區有向家鼠疫區演變的趨勢；為能對疫區進行型別和型別變化的檢測，發展新型的簡便、特異的病原和分型檢測方法勢在必行。
[0006]環介導等溫擴增技術(LAMP)是由T.Notomi發明的一種新型恒溫核酸擴增方法，采用4-6條可特異識別靶序列區域的引物(如2條外引物、2條內引物、以及0-2條環引物)以及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，置60°C _65°C條件下，僅需Ih左右即可完成核酸擴增，擴增效率可達IO9-1Oltl個數量級。整個擴增過程只需一臺水浴鍋或恒溫金屬浴即可，且只需通過其副產物-白色的焦磷酸鎂沉淀來觀察結果(可用濁度儀實時掃描判定)，或者預先加入HNB或鈣黃綠素等金屬離子螯合劑，通過反應前后的溶液顏色變化，直接目視觀察而不需借助其他儀器即可辨別實驗結果。[0007]逆轉錄環介導等溫擴增技術(reversetranscription loop-mediatedisothermal amplification, RT-LAMP)是能以一步法直接檢測樣本中RNA的LAMP方法,整個反應所需時間為Ih左右，同樣只需一臺簡單恒溫器，無需借助緊密配套的復雜儀器；應用HNB-RT-LAMP檢測方法，直接目視反應管即可判斷結果，無需開蓋，能有效減少氣溶膠污染的風險。RT-LAMP方法具有簡便、快速、敏感、高效的特點，非常適合在基層實驗室甚至現場進行快速診斷。目前亟需建立一種能夠靈敏、特異、高效檢測腎綜合征出血熱病毒的RT-LAMP檢測手段。

【發明內容】

[0008]本發明的第一目的是:針對現有技術存在的問題，提供一種用于以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物，可有效檢測腎綜合征出血熱病毒及其型別。
[0009]本發明的第二目的是:提供含有上述引物的試劑盒，可用于檢測腎綜合征出血熱病毒及其型別。
[0010]本發明的第三目的是:提供采用前述試劑盒的檢測方法，可直觀地根據反應液顏色判斷結果，或者根據濁度變化判斷結果，快速準確。
[0011]實現本發明第一目的的技術方案如下:一種用于以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物，其特征是，
[0012]包括HTNV引物組和SEOV引物組； 其中，
[0013]HTNV引物組包括外引物對HTNV-F3和HTNV-B3，內引物對HTNV-FIP和HTNV-BIP，以及環引物對HTNV-LF和HTNV-LB ；
[0014]HTNV-F3 的序列如 SEQ ID NO: 3 所示，HTNV-B3 的序列如 SEQ ID NO: 4 所示，HTNV-FIP 的序列如 SEQ ID NO:5 所示，HTNV-BIP 的序列如 SEQ ID NO:6 所示，HTNV-LF 的序列如SEQ ID NO:7所示，HTNV-LB的序列如SEQ ID NO:8所示；
[0015]SEOV引物組包括外引物對SE0V-F3和SE0V-B3，內引物對SE0V-FIP和SE0V-BIP，以及環引物對SEOV-LF和SEOV-LB ；
[0016]SEOV-F 的序列如 SEQ ID NO:9 所示，SE0V-B3 的序列如 SEQ ID NO: 10 所示，SEOV-FIP 的序列如 SEQ ID NO: 11 所示，SEOV-BIP 的序列如 SEQ ID NO: 12 所示，SEOV-LF的序列如SEQ ID NO: 13所示，SEOV-LB的序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0017]采用該引物后，即可有效檢測腎綜合征出血熱病毒及其型別。
[0018]實現本發明第二目的的技術方案如下:一種以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，其特征是，包括前述用于以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物，其中由HTNV引物組構成的引物混合液放置于I管中，由SEOV引物組構成的引物混合液放置于II管中；還包括反應緩沖液和酶液，所述酶液含有BstDNA聚合酶和AMV逆轉錄酶。
[0019]采用該試劑盒即可用于檢測腎綜合征出血熱病毒及其型別。
[0020]優選地，所述I管中，外引物對HTNV-F3和HTNV-B3、內引物對HTNV-FIP和HTNV-BIP、以及環引物對HTNV-LF和HTNV-LB的摩爾比為1: (6-10): (3-6);所述II管中，外引物對SE0V-F3和SE0V-B3、內引物對SEOV-FIP和SE0V-BIP、以及環引物對SEOV-LF和SEOV-LB 的摩爾比為 1: (6-10): (3-6)。
[0021]優選地，還包括陽性對照品:包括HTNV陽性對照品和SEOV陽性對照品，濃度分別為30-100mg/L，且由以下方法獲得:構建含有腎綜合征出血熱病毒漢灘型的S基因的質粒HTNV-PCR I1、并構建含有腎綜合征出血熱病毒漢城型的S基因的質粒SEOV-PCR II，然后分別進行酶切線性化、體外轉錄及RNA純化，所得cRNA片段分別為HTNV陽性對照品和SEOV陽性對照品；所述腎綜合征出血熱病毒漢灘型的S基因序列如SEQ ID N0:1所示，所述腎綜合征出血熱病毒漢城型的S基因序列如SEQ ID N0:2所示。
[0022]優選地，所述反應緩沖液為2 X反應緩沖液，包括40_60mmol/L pH8.8的Tris-HCl，18-30mmol/L 的 KCl，10-30mmol/L 的(NH4)2S04，質量濃度為 0.1-0.3% 的 TritonX-100,由濃度均為 2.8-3.6mmol/L 的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 組成的 dNTPs,0.8-2.0mmoI/L 的甜菜堿 C5H11NO2,以及 14-20mmol/L 的 MgSO4 ；
[0023]所述酶液包括濃度為8-12U/ μ I的BstDNA聚合酶，以及濃度為10-16U/ μ I AMV逆轉錄酶；
[0024]還包括顯色試劑，所述顯色試劑為濃度4-20mmol/L的金屬離子指示劑HNB儲存液。
[0025]此外，本發明還提供:前述引物用于制作以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒的用途。
[0026]實現本發明第三目的的技術方案如下:一種非診斷目的以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的快速檢測方法，其特征是，采用前述以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，該方法包括以下步驟:
[0027]第一步、向透明反應管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2X反應緩沖液、I管或II管的引物混合液、酶液、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應液A、B ;其中反應管A中加入I管的引物混合液，反應管B中加入II管的引物混合液；試劑盒2X反應緩沖液、I管或II管的引物混合液、酶液、顯色液、超純水的體積比為(6-12):(1.2-3.4):(0.5-1.6): (0.2-0.8):(3.0-4.`5)；
[0028]第二步、向反應管A、B中分別加入體積相同的待測核酸樣品，蓋好反應管A、B后混勻；
[0029]第三步、將反應管A、B先分別在60°C -65 °C恒溫條件下放置25_60min進行RT-LAMP擴增，再于80°C _95°C下放置2_10min結束反應；
[0030]第四步、觀察反應液A、B的顏色，若反應液A顏色為天藍色，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢灘型；若反應液B顏色為天藍色，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢城型；若反應液A、B顏色均為紫羅蘭色，則待測核酸樣品中不含腎綜合征出血熱病毒漢灘型和腎綜合征出血熱病毒漢城型。
[0031]采用該檢測方法后，可直觀地根據反應液顏色判斷結果，快速準確。
[0032]上述技術方案的替換方案為:第一步中，反應管A、B中均不加顯色液；在第一步結束時先以濁度儀檢測反應液A、B的濁度，再進行第二步；第四步中，以濁度儀檢測結束反應后的反應液A、B濁度，并觀察反應前后反應液A、B的濁度變化，若反應液A濁度上升，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢灘型；若反應液B濁度上升，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢城型；若反應液A、B濁度均無變化，則待測核酸樣品中不含腎綜合征出血熱病毒漢灘型和腎綜合征出血熱病毒漢城型。
[0033]優選地，第二步結束時，反應液A或B中含有:2μ I待測核酸樣品，20-30mmol/LTris-HCl (ρΗ8.8)，9-15mmol/L KC1，5_15mM(NH4) 2S04，質量濃度 0.05-0.15%Triton X-100,1.4-1.8mmol/L dNTPs, 0.4-1.0mmol 甜菜堿 C5H11NO2, 7-1OmmoI MgSO4,6-12U BstDNA 聚合酶，8-16U AMV逆轉錄酶，4-6pmol外引物對，30_50pmol內引物對，10_30pmol環引物對。
[0034]優選地,第二步中,加入待測核酸樣品后,反應管A、B中的反應液體積均為25 μ I ;第三步中，RT-LAMP擴增條件為:63°C恒溫條件下放置30min ;結束反應的條件為:80°C下放置 2min。
[0035]與現有技術相比，本發明的有益效果如下:
[0036](I)發明人針對腎綜合征出血熱病毒漢灘型(HTNV)的S基因、腎綜合征出血熱病毒漢城型(SEOV)的S基因，分別設計出6條能特異性識別靶序列不同區域的引物(即外弓丨物對、內引物對、環引物對)，使本發明的RT-LAMP法能實現比其它核酸擴增檢測方法更高的特異性，并且不會與其它常見病原發生交叉反應。[0037](2)與普通PCR和熒光定量PCR相比，本發明的RT-LAMP法的靈敏度可達到熒光定量PCR的水平，檢測下限可達IOcopies/μ 1，比RT-PCR要高10倍。
[0038](3)本發明RT-LAMP法結果鑒定方便直觀，通過觀察反應液顏色或濁度即可判定反應結果；操作簡單，一步即可完成實驗操作，不需要大型復雜的儀器；快速高效，整個過程一小時內即可完成，且擴增效率高；此外，涵蓋并能準確鑒定腎綜合征出血熱病毒在我國的分布型別。
[0039]本發明結果可靠，能快速、高效、高特異性、高靈敏性的檢測腎綜合征出血熱病毒，并準確分型，不需要大型儀器設備，成本相對低廉，為腎綜合征出血熱病毒的檢測提供了便捷的技術平臺，也為腎綜合征出血熱病毒的基層檢測提供便利，適合大范圍推廣應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為本發明實施例2的重組質粒HTNV-PCR II結構示意圖，其中Spe I為酶切位點(用于體外轉錄前的線性化，以產生固定長度的RNA片段，便于準確定量拷貝數)，HTNV-S為腎綜合征出血熱病毒漢灘型的S基因序列，T7pix)m0ter為質粒PCR II上自帶的體外轉錄啟動子，箭頭所指為體外轉錄的方向。
[0041]圖2為本發明實施例2的重組質粒SEOV-PCR II結構示意圖，其中Sac I為酶切位點(用于體外轉錄前的線性化，以產生固定長度的RNA片段，便于準確定量拷貝數)，SEOV-S為腎綜合征出血熱病毒漢城型的S基因序列，T7pix)m0ter為質粒PCR II上自帶的體外轉錄啟動子，箭頭所指為體外轉錄的方向。
[0042]圖3為本發明實施例2的PCR II質粒圖譜。
[0043]圖4為本發明實施例5中，逆轉錄實時熒光定量PCR (HTNV-rRT-PCR)檢測梯度稀釋的HTNV陽性標準品，Ct值< 38判定為陽性，陰性對照使用超純水代替模板樣品。
[0044]圖5為本發明實施例5中，逆轉錄實時熒光定量PCR (SEOV-rRT-PCR)檢測梯度稀釋的SEOV陽性標準品，Ct值< 38判定為陽性，陰性對照使用超純水代替模板樣品。
[0045]圖6為本發明實施例5中，以實施例2試劑盒按濁度判斷方式檢測梯度稀釋的HTNV陽性標準品，濁度值> 0.1判定為陽性。
[0046]圖7為本發明實施例5中，以實施例2試劑盒按濁度判斷方式檢測梯度稀釋的SEOV陽性標準品，濁度值> 0.1判定為陽性。[0047]圖8為本發明實施例5中，以實施例2試劑盒按顯色判斷方式檢測梯度稀釋的HTNV陽性標準品，天藍色判定為陽性，紫羅蘭色為陰性。除10°管和NTC管為紫羅蘭色外，其余各管均為天藍色。NTC為以超純水代替模板樣品的陰性對照管。
[0048]圖9為本發明實施例5中，以實施例2試劑盒按顯色判斷方式檢測梯度稀釋的SEOV陽性標準品，天藍色判定為陽性，紫羅蘭色為陰性。除IO1管、10°管、NTC管為紫羅蘭色外，其余各管均為天藍色。NTC為以超純水代替模板樣品的陰性對照管。
[0049]圖10為本發明實施例6中，以實施例2試劑盒HTNV引物組按顯色判斷方式檢測各樣品。其中，I至8管的樣品依次為腎綜合征出血熱病毒漢灘型標準株76118、腎綜合征出血熱病毒漢城型標準株R22、登革熱病毒、大腸桿菌0157、鉤端螺旋體、瘧原蟲、恙蟲病東方體以及流感病毒H1N1，天藍色判定為陽性，紫羅蘭色為陰性。除I管為天藍色外，其余管均為紫羅蘭色。 [0050]圖11為本發明實施例6中，以實施例2試劑盒SEOV引物組按顯色判斷方式檢測各樣品。其中，I至8管的樣品依次為腎綜合征出血熱病毒漢城型標準株R22、腎綜合征出血熱病毒漢灘型標準株76118、登革熱病毒、大腸桿菌0157、鉤端螺旋體、瘧原蟲、恙蟲病東方體以及流感病毒H1N1，天藍色判定為陽性，紫羅蘭色為陰性。除I管為天藍色外，其余管均為紫羅蘭色。
[0051]圖12為本發明實施例6中，以實施例2試劑盒HTNV引物組按濁度判斷方式檢測各樣品。其中，各樣品為腎綜合征出血熱病毒漢灘型標準株76118 (HV)、登革熱病毒(Dengue Virus, DV)、大腸桿菌 0157 (Ecol1.0157)、鉤端螺旋體(Leptospira)、痕原蟲(Plasmodium)、恙蟲病東方體(R.tsutsugamushi)以及流感病毒H1N1,池度值> 0.1判定為陽性。其中NTC為陰性對照(使用超純水代替模板)。
【具體實施方式】
[0052]下面參照附圖并結合實施例對本發明作進一步詳細描述。但是本發明不限于所給出的例子。
[0053]以下內容中涉及的實驗操作，如未注明具體實驗條件，則按照常規條件進行，例如，可參照SAMBR00K.J等編著的《分子克隆實驗指南》第3版(Molecular Cloning:ALaboratory Manual ;NEW York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中述及的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0054]以下內容中涉及的實驗材料和試劑，如未特別說明則為市售品。
[0055]實施例1:HTNV弓丨物組和SEOV弓丨物組
[0056]首先，從美國基因數據庫檢索獲得腎綜合征出血熱病毒漢灘型(HTNV)基因序列(GenBank號:M14626.1)和腎綜合征出血熱病毒漢城型(SEOV)基因序列(GenBank號:AF488707.1)，其中，腎綜合征出血熱病毒漢灘型(HTNV)的S基因序列如SEQ ID N0:1所示，腎綜合征出血熱病毒漢城型(SEOV)的S基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0057]然后，先通過BLAST軟件進行同源性分析，得到兩種基因的特異性保守序列；再通過LAMP引物設計軟件(Primer Explorer software, version 4.0),針對上述特異性保守序列分別進行LAMP引物設計，根據專業經驗進行了人工選擇和校正，再根據多輪實驗對比，從合成的若干套引物組合中篩選出可應用于同一反應體系的HTNV引物組和SEOV引物組。[0058]HTNV引物組包括外引物對HTNV-F3和HTNV-B3，內引物對HTNV-FIP和HTNV-BIP，以及環引物對HTNV-LF和HTNV-LB ；
[0059]HTNV-F3 的序列如 SEQ ID NO: 3 所示，HTNV-B3 的序列如 SEQ ID NO: 4 所示，HTNV-FIP 的序列如 SEQ ID NO:5 所示，HTNV-BIP 的序列如 SEQ ID NO:6 所示，HTNV-LF 的序列如SEQ ID NO:7所示，HTNV-LB的序列如SEQ ID NO:8所示。
[0060]SEOV引物組包括外引物對SE0V-F3和SE0V-B3，內引物對SE0V-FIP和SE0V-BIP，以及環引物對SEOV-LF和SEOV-LB ；
[0061]SEOV-F 的序列如 SEQ ID NO:9 所示，SE0V-B3 的序列如 SEQ ID NO: 10 所示，SEOV-FIP 的序列如 SEQ ID NO: 11 所示，SEOV-BIP 的序列如 SEQ ID NO: 12 所示，SEOV-LF的序列如SEQ ID NO: 13所示，SEOV-LB的序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0062]實施例2:以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒
[0063]本實施例的試劑盒包括實施例1的HTNV弓丨物組和SEOV引物組。其中，由HTNV弓丨物組構成的引物混合液放置于I管中，外引物對HTNV-F3和HTNV-B3、內引物對HTNV-FIP和 HTNV-BIP、及環引物對 HTNV-LF 和 HTNV-LB 的摩爾比為 1: (6-10): (3-6)，優選 1:8:4。由SEOV弓丨物組構成的引物混合液放置于II管中，外引物對SE0V-F3和SE0V-B3、內引物對SEOV-FIP 和 SE0V-BIP、及環引物對 SE0V-LF 和 SE0V-LB 的摩爾比為 1: (6-10): (3-6)，優選1:8:4。
[0064]例如:I管中，每 2.5 μ I 引物混合液含有 4pmoI HTNV-F3 和 4pmoI HTNV-B3、32pmoIHTNV-FIP和 32pmol HTNV-BI P,以及 16pmol HTNV-LF和 16pmol HTNV-LB ; II 管中，每 2.5 μ I引物混合液含有 4pmol SE0V-F3 和 4pmol SE0V_B3、32pmol SE0V-FIP 和 32pmol SEOV-BIP、以及 16pmol SEOV-LF 和 16pmoI SEOV-LB0
[0065]本實施例試劑盒還包括:
[0066](I)陽性對照品:包括HTNV陽性對照品和SEOV陽性對照品，濃度分別為30-100mg/L，優選分別為 50mg/L。
[0067]獲得方法如下:將腎綜合征出血熱病毒漢灘型標準株76118毒株和腎綜合征出血熱病毒漢城型標準株R22毒株分別接種l-5d齡的乳沙鼠，每只腦內0.02ml，15d左右收獲發病小鼠，無菌取腦，研磨腦組織，分別提取兩病毒株的RNA，進行RT-PCR擴增出兩者的S基因全長片段(分別如SEQ ID NO: 1、2所示)，分別TA克隆至PCR II質粒(美國Invitrogen公司，如圖3所示)并測序，命名為HTNV-PCR II和SEOV-PCR II (分別如圖1、圖2所示)。將HTNV-PCR II質粒用SpeI限制性內切酶(日本Takara公司)，SEOV-PCR II用Sac I限制性內切酶(Takara)進行酶切線性化，分別割膠純化后作為模板，使用RiboMaxT7 In VitroTranscription System (美國Promega公司)分別進行體外轉錄，用Dnase試劑除去DNA模板后，分別用RNA純化試劑盒(北京天根公司)純化轉錄產物，以分光光度計測定濃度，以RNA-free H2O將其稀釋至50mg/L，所得cRNA片段分別為HTNV陽性標準品和SEOV陽性標準品。
[0068](2) 2X反應緩沖液:該反應緩沖液包括40-60mmol/L (優選40mmol/L) pH8.8的Tris-HCl，18-30mmol/L(優選 20mmol/L)的 KCl，10_30mmol/L(優選 20mmol/L)的(NH4)2SO4,質量濃度為0.1-0.3% (優選0.2%)的TritonX-100，由濃度均為2.8-3.6mmol/L (優選
2.8mmol/L)的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 組成的 dNTPs，0.8-2.0mmoI/L (優選 1.6mmol/L)的甜菜堿 C5H11NO2,以及 14_20mmol/L (優選 16mmol/L)的 MgS04。
[0069](3)酶液:包括濃度為8_12υ/μ1 (優選8U/μ I)的BstDNA聚合酶(大片段，美國NEB公司)，以及濃度為10-16υ/μ I (優選IOU/μ I) AMV逆轉錄酶(美國NEB公司)。
[0070](4)顯色液:濃度4_20mmol/L (優選4mmol/L)的金屬離子指示劑HNB (hydroxynaphthol blue，羥基萘酚藍)儲存液；在反應前加入反應體系內，從而實現不開蓋可視化檢測。具體地，指示劑HNB購自美國Sigma-Alorich公司，貨號CAS 63451_35_4，規格33936-10G ;該指示劑加入反應體系后的終濃度為120-160 μ mol/L。
[0071]實施例3:非診斷目的以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的快速檢測方法
[0072]本實施例檢測方法采用實施例2試劑盒進行檢測。
[0073]本實施例檢測方法包括以下步驟:
[0074]第一步、向透明反應管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2X反應緩沖液、I管或II管的引物混合液、酶液、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應液A、B ;其中反應管A中加入I管的引物混合液，反應管B中加入II管的引物混合液；試劑盒2X反應緩沖液、I管或II管的引物混合液、酶液、顯色液、超純水的體積比為(6-12):(1.2-3.4):(0.5-1.6):(0.2-0.8):(3.0-4.5)；
[0075]例如，反應液A可以按下表得到:
[0076]
【權利要求】
1.一種用于以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物，其特征是，包括HTNV引物組和SEOV引物組；其中， HTNV引物組包括外引物對HTNV-F3和HTNV-B3，內引物對HTNV-FIP和HTNV-BIP，以及環引物對HTNV-LF和HTNV-LB ； HTNV-F3 的序列如 SEQ ID NO: 3 所示，HTNV-B3 的序列如 SEQ ID NO:4 所示，HTNV-FIP的序列如SEQ ID NO:5所示，HTNV-BIP的序列如SEQ ID NO:6所示，HTNV-LF的序列如SEQID NO:7所示，HTNV-LB的序列如SEQ ID NO:8所示； SEOV引物組包括外引物對SE0V-F3和SE0V-B3，內引物對SEOV-FIP和SE0V-BIP，以及環引物對SEOV-LF和SEOV-LB ； SEOV-F 的序列如 SEQ ID NO:9 所示，SE0V-B3 的序列如 SEQ ID NO: 10 所示，SEOV-FIP的序列如SEQ ID NO: 11所示，SEOV-BIP的序列如SEQ ID NO: 12所示，SE0V-LF的序列如SEQ ID NO: 13 所示，SEOV-LB 的序列如 SEQ ID NO: 14 所示。
2.—種以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，其特征是，包括權利要求1所述用于以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物，其中由HTNV弓丨物組構成的引物混合液放置于I管中，由SEOV引物組構成的引物混合液放置于II管中；還包括反應緩沖液和酶液，所述酶液含有BstDNA聚合酶和AMV逆轉錄酶。
3.根據權利要求2所述以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，其特征是，所述I管中，外引物對HTNV-F3和HTNV-B3、內引物對HTNV-FIP和HTNV-BIP、以及環引物對HTNV-LF和HTNV-LB的摩爾比為1: (6-10): (3-6);所述II管中，外引物對SE0V-F3和SE0V-B3、內引物對SEOV-FIP和SE0V-BIP、以及環引物對SEOV-LF和SEOV-LB的摩爾比為1:(6-10):(3-6)。`
4.根據權利要求3所述以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，其特征是，還包括陽性對照品:包括HTNV陽性對照品和SEOV陽性對照品，濃度分別為30-100mg/L，且由以下方法獲得:構建含有腎綜合征出血熱病毒漢灘型的S基因的質粒HTNV-PCR I1、并構建含有腎綜合征出血熱病毒漢城型的S基因的質粒SEOV-PCR II，然后分別進行酶切線性化、體外轉錄及RNA純化，所得cRNA片段分別為HTNV陽性對照品和SEOV陽性對照品；所述腎綜合征出血熱病毒漢灘型的S基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述腎綜合征出血熱病毒漢城型的S基因序列如SEQ ID NO: 2所示。
5.根據權利要求4所述以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，其特征是，所述反應緩沖液為2X反應緩沖液，包括40-60mmol/L pH8.8的Tris_HCl，18-30mmol/L 的 KCl, 10-30mmol/L 的(NH4)2SO4,質量濃度為 0.1-0.3% 的 Triton X-100，由濃度均為2.8-3.6mmol/L 的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 組成的 dNTPs，0.8-2.0mmoI/L 的甜菜堿 C5H11NO2,以及 14-20mmol/L 的 MgSO4 ； 所述酶液包括濃度為8-12U/ μ I的BstDNA聚合酶，以及濃度為10-16U/ μ I AMV逆轉錄酶； 還包括顯色試劑，所述顯色試劑為濃度4-20mmol/L的金屬離子指示劑HNB儲存液。
6.權利要求1所述引物用于制作以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒的用途。
7.一種非診斷目的以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的快速檢測方法，其特征是，采用前述以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，該方法包括以下步驟:第一步、向透明反應管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2X反應緩沖液、I管或II管的引物混合液、酶液、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應液A、B;其中反應管A中加入I管的引物混合液，反應管B中加入II管的引物混合液；試劑盒2X反應緩沖液、I管或II管的引物混合液、酶液、顯色液、超純水的體積比為(6-12):(1.2-3.4):(0.5-1.6):(0.2-0.8):(3.0-4.5)； 第二步、向反應管A、B中分別加入體積相同的待測核酸樣品，蓋好反應管A、B后混勻；第三步、將反應管A、B先分別在60°C _65°C恒溫條件下放置25-60min進行RT-LAMP擴增，再于80°C -95°C下放置2-10min結束反應； 第四步、觀察反應液A、B的顏色，若反應液A顏色為天藍色，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢灘型；若反應液B顏色為天藍色，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢城型；若反應液A、B顏色均為紫羅蘭色，則待測核酸樣品中不含腎綜合征出血熱病毒漢灘型和腎綜合征出血熱病毒漢城型。
8.根據權利要求7所述非診斷目的以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的快速檢測方法，其特征是，第一步中，反應管A、B中均不加顯色液；在第一步結束時先以濁度儀檢測反應液A、B的濁度，再進行第二步；第四步中，以濁度儀檢測結束反應后的反應液A、B濁度，并觀察反應前后反應液A、B的濁度變化，若反應液A濁度上升，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢灘型；若反應液B濁度上升，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢城型；若反應液A、B濁度均無變化，則待測核酸樣品中不含腎綜合征出血熱病毒漢灘型和腎綜合征出血熱病毒漢城型。
9.根據權利要求7或8所述非診斷目的以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的快速檢測方法，其特征是，第二步結束時，反應液A或B中含有:2μ I待測核酸樣品，20-30mmol/LTris-HCl (ρΗ8.8)，9-15mmol/L KC1，5_15mM(NH4) 2S04，質量濃度 0.05-0.15%Triton X-100,.1.4-1.8mmol/L dNTPs，0.4-1.0mmol 甜菜堿 C5H11NO2, 7-1OmmoI MgSO4,6-12U BstDNA 聚合酶，8-16U AMV逆轉錄酶，4-6pmol外引物對，30_50pmol內引物對，10_30pmol環引物對。
10.根據權利要求7或8所述非診斷目的以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的快速檢測方法，其特征是，第二步中，加入待測核酸樣品后，反應管A、B中的反應液體積均為.25 μ I ;第三步中，RT-LAMP擴增條件為:63°C恒溫條件下放置30min ;結束反應的條件為:.80°C下放置2min。
【文檔編號】C12N15/11GK103725798SQ201410016990
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】王長軍, 胡丹, 張錦海, 郝麗娜, 呂恒, 譚維國 申請人:中國人民解放軍南京軍區軍事醫學研究所