菊屬及近緣屬植物通用ssr分子標記cssr2及應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2，用于PCR擴增所述標記CSSR2的引物序列如Seq?ID?No.1和2所示。本發明還提供了所述SSR標記在菊屬與亞菊屬的屬間雜交種鑒定中的應用。另外，本發明還提供了擴增所述SSR分子標記的方法，建立了一個在菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料之間通用的SSR分子標記技術體系，該標記可以用于進行菊屬，亞菊屬及太行菊屬屬內和屬間的雜種鑒定，植物遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助育種等，應用前景十分廣闊。
【專利說明】菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及一種菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2及應用。
【背景技術】
[0002]菊屬(Chrysanthemum)屬于雙子葉植物綱菊科，原產于我國的菊屬植物主要有:野菊(C.1ndicum)、神農香菊(C.1ndicum var.aromaticum),毛華菊(C.vestitum)、甘菊(C.1avandulifolium)> 小紅菊(C.chanetii )、紫花野菊(C.zawadskii )、菊花腦(C.mankingense)等。其中，菊花(Chrysanthemum morrofolium)是觀賞價值最高的種，菊花是中國十大名花和世界四大切花之一，在中國有三千多年的栽培歷史，形成了花型豐富、花色多樣的品種群。除觀賞價值外，菊屬植物還有很高的藥用價值和食用價值等。菊花含有水蘇堿、刺槐甙、木樨草甙、大波斯菊甙、腺膘呤、膽堿、葡萄糖甙等成分，尤其富含揮發油，并且油中主要為菊酮、龍腦、龍腦已酸酯等物質。功效作用方面，菊花具有平肝明目、散風清熱、消咳止痛的功效，用于治療頭痛眩暈、目赤腫痛、風熱感冒、咳嗽等病癥效果顯著。
[0003]亞菊屬(Ajania),屬于雙子葉植物綱菊科，主要分布于我國除東南半壁以外的廣大地區。蒙古、蘇聯及朝鮮北部和阿富汗北部也有少數種。亞菊屬的野生種磯菊(A.acificum)，原產于我國臺灣和日本，已經較為廣泛的應用于我國東南沿海以及日本、荷蘭等國的園林中， 作為地被以及盆栽植物栽培。其葉片光亮革質具有較高的觀賞價值。菊花育種工作者也把磯菊作為親本和菊屬植物進行雜交育種，以提高菊花的枝葉觀賞性。
[0004]太行菊屬(Opisthopappus),菊科,包括太行菊(0.taihangensis)和長裂太行菊(0.1ongilobus)兩種，主要分布于我國山西、河北、河南等地，植株匍匐生長，多生于陡坡，峭壁的巖石縫隙中，耐瘠薄，耐寒以及耐旱性強，已成為園藝工作者的重要育種材料。
[0005]亞菊屬和太行菊屬作為菊屬的近緣屬，已成為新的種質資源被菊花育種工作者用來與菊花進行遠緣雜交，以提高現有菊花品種群的抗性和觀賞性。
[0006]簡單重復序列(simplesequence repeat, SSR),也稱微衛星 DNA(microsatellite),是一種由2~5個核苷酸為單位多次串聯重復的長達幾十甚至幾百個核苷酸的序列。這些序列廣泛存在于真核生物基因組的不同座位上，每個座位重復單位的數量可能不完全相同，因而形成多態性。由于其具有多態性豐富、重復性高、共顯性遺傳等優點，被廣泛應用于植物的群體和進化遺傳研究、種質資源遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建等領域。
[0007]然而，目前菊花的SSR標記開發處于起步階段，亞菊屬(Ajania)和太行菊屬(Opisthopappus)由于缺乏基因序列信息，尚未發現SSR標記開發相關研究的報導；因此目前亞菊屬(Ajania)和太行菊屬(Opisthopappus)還沒有SSR分子標記被開發出來,也沒有能夠用于菊屬以及近緣屬之間通用的SSR標記；因此，開發菊屬、亞菊屬和太行菊屬微衛星標記，對于菊屬，亞菊屬和太行菊屬的野生資源的開發利用，開展屬間遠緣雜交育種以及分子水平研究具有重要意義。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2及應用。
[0009]為了實現本發明目的，本發明的一種菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2，用于PCR擴增分子標記CSSR2的引物對為:
[0010]上游引物:5’-TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3’和
[0011]下游引物:5’-CACATAACCACCACTACCACCA-3’。
[0012]本發明中涉及的近緣屬植物包括但不限于菊屬(Chrysanthemum)、亞菊屬(Ajania)、太行菊屬(Opisthopappus)等。
[0013]本發明還提供所述分子標記在菊屬及近緣屬植物屬內或屬間雜種鑒定、植物材料遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建及分子標記輔助育種等方面的應用。
[0014]本發明進一步提供一種鑒定菊屬及近緣屬植物品種的方法，包括以下步驟:
[0015]I)提取待測植物的基因組DNA ；
[0016]2)以待測植物的基因組DNA為模板，利用上述用于PCR擴增分子標記CSSR2的引物對進行PCR擴增；
[0017]3 )檢測PCR擴增產物。
[0018]步驟2)中PCR反應體系為:引物各0.32 μ Μ/μ L，Taq DNA聚合酶0.2U/μ L，dNTP0.4 μ M/ μ L, Mg2+0.65 μ M/ μ L,模板 DNA2 ~4ng/ μ L，以 ddH20 配制。
[0019]步驟2)中 PCR 擴增程序為-MV 5min ；94°C 0.5min，50 ~62°C 0.5min，72°C lmin,共 30 個循環；72°C 5min。優選地，PCR 擴增程序為-MV 5min ；94°C 0.5min,58°C 0.5min,72 °C lmin，共 30 個循環；72°C 5min。
[0020]本發明首次提供一種在菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料之間通用的SSR分子標記一CSSR2。本發明還提供了該SSR標記在菊屬與亞菊屬的屬間雜交種鑒定中的應用。另外，本發明還提供了擴增該SSR位點的引物序列和擴增方法，建立了一個在菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料之間通用的SSR分子標記技術體系，該標記可以用于進行菊屬，亞菊屬及太行菊屬屬內和屬間的雜種鑒定，植物遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助育種等，應用前景十分廣闊。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為本發明CSSR2位點的SSR引物擴增的菊屬、亞菊屬及太行菊屬植物材料基因組DNA的STR分型圖；其中，I~28分別對應表1中列出的菊屬、亞菊屬及太行菊屬的28種植物材料，橫坐標代表擴增產物大小，縱坐標代表擴增強度。
[0022]圖2為亞菊屬野生種磯菊(母本)，菊屬地被菊品種“鋪地淡粉”(父本)，及其雜交后代 AP1、AP2、AP3。
【具體實施方式】
[0023]以下實施例用于說明 本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。[0024]實施例1菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2的獲得
[0025](I)在美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Genbank/)下載網站上截至2012年4月公布的所有菊屬植物的7180個EST序列，應用CAP3軟件進行拼接處理，得到拼接基因序列。然后利用SSRIT軟件(http://www.gramene.0rg/db/markers/ssrtool)進行SSR位點搜索,然后利用Primer Premier5.0軟件進行SSR位點上、下游引物的設計。
[0026]其中擴增所述分子標記CSSRl和CSSR2的引物為如下引物對:
[0027]CSSR2 上游引物 F: 5’ -TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3’
[0028]CSSR2 下游引物 R: 5，-CACATAACCACCACTACCACCA-3’
[0029](2)提取了菊屬(Chrysanthemum)、亞菊屬(Ajania),太行菊屬(Opisthopappus)的常見植物材料的DNA樣品(見表1)。
[0030]表1菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料
[0031]
【權利要求】
1.菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2，其特征在于，用于PCR擴增分子標記CSSR2的引物對為: 上游引物:5，-TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3，和 下游引物:5’-CACATAACCACCACTACCACCA-3’。
2.根據權利要求1所述的分子標記，其特征在于，所述近緣屬植物包括但不限于菊屬(Chrysanthemum)、亞菊屬(Ajania)、太行菊屬(Opisthopappus)。
3.權利要求1或2所述分子標記在菊屬及近緣屬植物屬內或屬間雜種鑒定、植物材料遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建及分子標記輔助育種中的應用。
4.一種鑒定菊屬及近緣屬植物品種的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取待測植物的基因組DNA； 2)以待測植物的基因組DNA為模板，利用權利要求1所述的用于PCR擴增分子標記CSSR2的引物對進行PCR擴增； 3)檢測PCR擴增產物。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR反應體系為:引物各0.32 μ M/ μ L, Taq DNA 聚合酶 0.2U/ μ L, dNTP0.4 μ M/ μ L, Mg2+0.65 μ M/ μ L,模板 2 ~4ng/μ L,以ddH20配制。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR擴增程序為:94°C5min ；94°C 0.5min，50 ~62°C 0.5min,72°C lmin，共 30 個循環；72°C 5min。`
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR擴增程序為:94°C5min ；94°C 0.5min,58°C 0.5min,72°C lmin，共 30 個循環；72°C 5min。
8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述近緣屬植物包括但不限于菊屬、亞菊屬、太行菊屬。
【文檔編號】C12N15/11GK103773762SQ201410016955
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月14日 優先權日:2014年1月14日
【發明者】張啟翔, 劉華, 孫明, 高亦珂, 潘會堂, 程堂仁, 王佳, 楊煒茹 申請人:北京林業大學