極地雪藻固定化保種方法

極地雪藻固定化保種方法
【專利摘要】本發明屬于微藻養殖領域，尤其涉及一種極地雪藻固定化保種方法。極地雪藻傳統保種方法存在很多缺點：保種時間短，為1-2年，營養鹽消耗快，培養基易老化，需頻繁更換培養基，工作量大，細胞存活率低，易污染。本發明用蛋白胨代替傳統的褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，且在培養基中增加了檸檬酸鐵、山梨酸鉀、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液等營養成分，并添加了乙二醇作為抗凍劑，接種后的培養基置于溫度為-50±2℃、光照強度200-400lx的低溫、弱光培養箱中保存。新方法能顯著提高藻細胞的存活率，大大降低工作量，不易污染，種質純正，保種時間長達6-8年而且保種成本降為原來的1/3。
【專利說明】極地雪藻固定化保種方法【技術領域】
[0001]本發明屬于微藻養殖領域，尤其涉及一種極地雪藻固定化保種方法。
【背景技術】
[0002]雪藻snow algae是生活在兩極及相似極端環境中的一類特殊的單細胞微藻類群，已發現有幾十種，分屬不同門類。大部分分布在雪地幾厘米深的表層，冰雪融化時形成雪地藻華snow algal bloom,因細胞富含奸青素而呈深紅色，因此又稱血雪blood snow。其中極地雪藻Chlamydomonas nivalis是一種淡水單細胞綠藻,在分類學上屬于綠藻門Chlorophata、綠藻綱Chlorophyceae、團藻目Volvocales。研究發現，細胞內的奸青素有抗紫外輻射功效。極地雪藻最適生長溫度是8-10°C，在營養豐富和低光強下保持綠色并快速生長，而在營養貧乏和高光強等極端環境下細胞生長緩慢并開始大量積累紅色類胡蘿卜素一蝦青素。極地雪藻還具有生產高不飽和脂肪酸的潛在前途，在理想的培養條件下，極地雪藻含有的不飽和脂肪酸占總脂肪酸的80%以上。 [0003]在微藻的培養和應用中，保種工作十分重要，它是微藻培養和進一步應用的基礎和關鍵。由于藻種極易受污染，分離和純化技術較復雜而且耗時較長，因此在微藻保種中要盡量減少接種次數，避免藻種被雜藻、細菌或原生動物污染。傳統的保種方法是用褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，接種后的固體培養基置于溫度為3-6°C，光照強度為1000-15001x的條件下保存。該方法存在很多缺點:保種時間短，為1-2年，營養鹽消耗快，培養基易老化，需頻繁更換培養基，工作量大，細胞存活率低，僅為37 %左右，易因污染而導致保種失敗。
[0004]本發明是用蛋白胨代替傳統的褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，而且在培養基中增加了碳酸氫鈉、檸檬酸鐵、山梨酸鉀、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、絡合劑乙二胺四乙酸等營養成分，營養更加全面并添加了乙二醇作為抗凍劑，接種后的培養基置于溫度為-50±2°C、光照強度200-4001X的低溫、弱光培養箱中保存。采用本方法保存極地雪藻能顯著提高藻細胞的存活率，存活率由原來的37%提高到了 94%，大大降低了工作量，不易污染，種質純正，大大延長保種時間，長達6-8年而且保種成本降為原來的1/3。

【發明內容】

[0005]為了克服目前技術的不足，本發明提供了一種極地雪藻固定化保種方法，方法如下:
[0006]一種極地雪藻固定化保種所用軟蛋白胨固體培養基，配方如下:
[0007]A 溶液:NH4N0340 毫克，NaN035 毫克，尿素 5 毫克，KH2PO4L 8 毫克，Na2Si038 毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升；
[0008]B溶液:即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升；
[0009]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；(:溶液配制完后裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶，置于4°C低溫冰箱備用；
[0010]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進行混合，使用前兩個棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調節值到7.5左右，按重量比6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入重量比0.5%。的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無菌培養容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，即可。
[0011]一種極地雪藻固定化保種方法，步驟如下:
[0012](I)極地雪藻預先進行提純和液體培養，以確保接種時藻種處于指數生長期，所述液體培養是本領域常規的培養方法，只要能確保接種時藻種處于指數生長期即可；
[0013](2)液體培養基的配制
[0014]A 溶液:NH4N0340 毫克，NaN035 毫克，尿素 5 毫克，KH2PO4L 8 毫克，Na2Si038 毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升；
[0015]B溶液:即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升；
[0016]C溶液:即f/2維生素溶液:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫開；
[0017]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；(:溶液配制完后裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶(所述C溶液不要煮沸，因維生素遇高溫易分解變性)，置于4°C低溫冰箱備用；
[0018](3)軟蛋白胨固體培養基制備
[0019]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進行混合，使用前兩個棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調節值到7.5左右，按6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入0.5%o的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無菌培養容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，次日待用。
[0020](4 )軟蛋白胨固體培養基接種和培養
[0021]將軟蛋白胨固體培養基放在六孔電熱水浴鍋中，調至42°C，此時軟蛋白胨固體培養基呈液化狀態；于無菌超凈工作臺上，用液槍吸取0.1毫升藻種液，迅速注射到呈液化狀態的培養基中，搖勻，立即放到常溫、流動的自來水中降溫(30秒內完成)；然后將接種完畢的固體培養基置于10± 1°C的培養箱內培養，光強4000-5000lx，約15-20天，可見長出的藻細胞團。
[0022](5)低溫保存
[0023]在超凈工作臺環境中挑選藻種群生長良好的三角燒瓶，在其表面覆蓋0.2厘米厚的液體培養基(用A溶液200毫升，B溶液I毫升，C溶液I毫升混合而成的單細胞培養液)，置于-50±2°C的低溫培養箱中，200-4001x弱光照射，在此培養條件下，藻種可保存6_8年。
[0024]有益效果極地雪藻傳統的固定化保種方法是用褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，接種后的培養基置于溫度3-6°C，光照強度1000-15001X的環境中保存。該方法存在很多缺點:保種時間短，為1-2年，營養鹽消耗快，培養基易老化，需頻繁地更換培養基，工作量大，細胞存活率低，僅為37%左右，易因污染而導致保種失敗。我發明的新方法是用蛋白胨代替傳統的褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，而且在培養基中我增加了碳酸氫鈉、檸檬酸鐵、山梨酸鉀、葡萄糖、海泥抽提液等營養成分，有利于極地雪藻的存活，并添加了乙二醇作為抗凍劑，接種后的培養基置于溫度為_50±2°C、光強200-4001x的低溫、弱光條件下保存。采用新方法保存極地雪藻能顯著提高藻細胞的生命活力，細胞存活率高達92%，大大降低工作量，不易污染，種質純正，大大延長保種時間，長達6-8年而且保種成本降為原來的1/3。【具體實施方式】
[0025]極地雪藻培養基制備方法
[0026]I)九二 O植物生長刺激素為白色結晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小時以上)，再按所需濃度兌水稀釋；
[0027]2)因檸檬酸鐵(FeC6H5O7.5H20)較難溶解，可加少量自來水在火爐上微熱至80-90°C，并不斷攪拌至全部融化；
[0028]3)各種營養鹽按配方中提供的順序加入，以免發生化學反應；
[0029]4)各種營養鹽特別是f/2微量元素溶液和f/2維生素溶液均需預先配成母液備用；但放置時間不要超過7天，且最好放進4°C冰箱冷藏保存備用；
[0030]5)人尿制備方法:取人尿1000毫升，燒瓶煮沸后冷卻備用；
[0031]6)海泥抽取液制備方法:取比較肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加2分淡水，充分攪拌均勻，靜置1-2分鐘，取上層泥漿于鋁鍋中，按每1000毫升泥漿加I克NaOH的量加入NaOH，煮沸20-30分鐘。煮時需不斷攪拌均勻，煮后靜置24小時取上清液備用；
[0032]7) 土壤抽出液制備方法:取土壤I千克，加蒸餾水1000毫升，再加入Na0H2_3克，煮沸120分鐘，冷卻后過濾，將清液置于暗處靜置2天，取上清液備用。
[0033]8)所有藥品純度均需化學純級別。
[0034]極地雪藻固定化保種方法
[0035]I藻類生物材料預先進行提純和液體培養，以確保接種時藻種處于指數生長期。
[0036]2液體培養基的配制
[0037]A 溶液:NH4N0340 暈克，NaN035 暈克，尿素 5 暈克，KH2PO4L 8 暈克，Na2Si038 暈克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升。
[0038]B溶液即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升。
[0039]C溶液即f/2維生素溶液:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫升。
[0040]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存。C溶液配制完后裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶(不要煮沸，因維生素遇高溫易分解變性)，置于4°C低溫冰箱備用。
[0041]3軟蛋白胨固體培養基制備
[0042]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進行混合，使用前兩個棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中。混合液用I %的氫氧化鈉溶液調節值到7.5左右，按6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入0.5%o的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化。培養液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無菌培養容器封口膜封口。將上述配制好的固體培養基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，次日待用。
[0043]4軟蛋白胨固體培養基接種和培養
[0044]將軟蛋白胨固體培養基放在六孔電熱水浴鍋中，調至42°C，此時軟蛋白胨固體培養基呈液化狀態。于無菌超凈工作臺上，用液槍吸取0.1毫升即100 μ l藻種液，迅速注射到呈液化狀態的培養基中，搖勻，立即放到常溫、流動的自來水中降溫(30秒內完成)。然后將接種完畢的固體培養基置于10± 1°C的培養箱內培養，光強4000-5000lx，約15-20天，可見長出的藻細胞團。
[0045]5低溫保存
[0046]在超凈工作臺環境中挑選藻種群生長良好的三角燒瓶，在其表面覆蓋0.2厘米厚的液體培養基(用A溶液200毫升，B溶液I毫升，C溶液I毫升混合而成的單細胞培養液)，置于-50±2°C的低溫培養箱中，200-400Ix弱光照射，在此培養條件下，藻種可保存6_8年。
[0047]一種極地雪藻固定化保種所用軟蛋白胨固體培養基，配方如下:
[0048]A 溶液:NH4N0340 暈克，NaN035 暈克，尿素 5 暈克，KH2PO4L 8 暈克，Na2Si038 暈克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升；
[0049]B溶液:即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升；
[0050]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；(:溶液配制完后裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶，置于4°C低溫冰箱備用；
[0051]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進行混合，使用前兩個棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調節值到7.5左右，按重量比6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入重量比0.5%。的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無菌培養容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，即可。
[0052]一種極地雪藻固定化保種方法，步驟如下:
[0053](I)極地雪藻預先進行提純和液體培養，以確保接種時藻種處于指數生長期，所述液體培養是本領域常規的培養方法，只要能確保接種時藻種處于指數生長期即可；
[0054](2)液體培養基的配制
[0055]A 溶液:NH4N0340 毫克，NaN035 毫克，尿素 5 毫克，KH2PO4L 8 毫克，Na2Si038 毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升；
[0056]B溶液:即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，FeC6H 5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升；
[0057]C溶液:即f/2維生素溶液:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫升；
[0058]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；(:溶液配制完后裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶(所述C溶液不要煮沸，因維生素遇高溫易分解變性)，置于4°C低溫冰箱備用；
[0059](3)軟蛋白胨固體培養基制備
[0060]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進行混合,使用前兩個棕色瓶均充分搖勻,取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調節值到7.5左右，按6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入0.5%o的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無菌培養容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，次日待用。
[0061](4)軟蛋白胨固體培養基接種和培養
[0062]將軟蛋白胨固體培養基放在六孔電熱水浴鍋中，調至42°C，此時軟蛋白胨固體培養基呈液化狀態；于無菌超凈工作臺上，用液槍吸取0.1毫升藻種液，迅速注射到呈液化狀態的培養基中，搖勻，立即放到常溫、流動的自來水中降溫(30秒內完成)；然后將接種完畢的固體培養基置于10± 1°C的培養箱內培養，光強4000-5000lx，約15-20天，可見長出的藻細胞團。
[0063](5)低溫保存
[0064]在超凈工作臺環境中挑選藻種群生長良好的三角燒瓶，在其表面覆蓋0.2厘米厚的液體培養基(用A溶液200毫升，B溶液I毫升，C溶液I毫升混合而成的單細胞培養液)，置于-50±2°C的低溫培養箱中，200-4001x弱光照射，在此培養條件下，藻種可保存6_8年。 [0065]最后應說明的是:以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和范圍。
【權利要求】
1.一種極地雪藻固定化保種所用軟蛋白胨固體培養基，其特征在于配方如下: A溶液:NH4N0340毫克，NaN035毫克，尿素5毫克，KH2PO4L 8毫克，Na2Si038毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升； B 溶液:即 f/2 微量元素溶液=ZnSO4.4Η2023 毫克，MnCl2.4Η20178 毫克，CuSO4.5Η2010毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35 克，蒸餾水1000毫升； 將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；C溶液配制完后裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶，置于4°C低溫冰箱備用； 從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進行混合，使用前兩個棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調節值到7.5左右，按重量比6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入重量比0.5%。的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無菌培養容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，即可。
2.一種極地雪藻固定化保種方法，其特征在于步驟如下: (1)極地雪藻預先進行提純和液體培養，以確保接種時藻種處于指數生長期； (2)液體培養基的配制 A溶液:NH4N0340毫克，NaN035毫克，尿素5毫克，KH2PO4L 8毫克，Na2Si038毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升； B 溶液:即 f/2 微量元素溶液=ZnSO4.4Η2023 毫克，MnCl2.4Η20178 毫克，CuSO4.5Η2010毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35 克，蒸餾水1000毫升； C溶液:即f/2維生素溶液:維生素B120.5毫克,維生素B1IOO毫克,維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫升； 將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；C溶液配制完后裝入高壓滅菌過的棕色試劑瓶，置于4°C低溫冰箱備用； (3)軟蛋白胨固體培養基制備 從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進行混合，使用前兩個棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調節值到7.5左右，按6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入0.5%。的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無菌培養容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，次日待用。 (4)軟蛋白胨固體培養基接種和培養 將軟蛋白胨固體培養基放在六孔電熱水浴鍋中，調至42°C，此時軟蛋白胨固體培養基呈液化狀態；于無菌超凈工作臺上，用液槍吸取0.1毫升藻種液，迅速注射到呈液化狀態的培養基中，搖勻，立即放到常溫、流動的自來水中降溫(30秒內完成)；然后將接種完畢的固體培養基置于10±1°〇的培養箱內培養，光強4000-500011，約15-20天，可見長出的藻細胞團。 (5)低溫保存 在超凈工作臺環境中挑選藻種群生長良好的三角燒瓶，在其表面覆蓋0.2厘米厚的液體培養基(用A溶液200毫升，B溶液I毫升，C溶液I毫升混合而成的單細胞培養液)，置于_50±2°C的低溫培養 箱中，200-4001x弱光照射，在此培養條件下，藻種可保存6_8年。
【文檔編號】C12R1/89GK103740692SQ201410016830
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】王培磊, 王博侖 申請人:臨沂大學