一株高效降解染料的菌株的制作方法

一株高效降解染料的菌株的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株高效降解染料的菌株。所述菌株為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussp.）FS1，于2013年11月10日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2013561。本發明所述菌株生長迅速，環境適應性強，具有廣譜的染料降解能力，對多種染料都具有很好的脫色效果，培養10h即能達到最大脫色率，脫色率可達90%以上，最大脫色濃度達5000mg/L。將本發明菌株應用于印染廢水以及相關的染料廢水脫色處理，能有效避免難于自然降解的染料分子直接進入水體導致的環境污染，且無二次污染，具有良好的生態效率和應用前景。本發明賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussp.）可很好地應用于染料降解，填補了國內技術空白，為解決染料污水處理尤其是脫色問題提供有力的技術基礎。
【專利說明】一株高效降解染料的菌株
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，更具體地，涉及一株高效降解染料的菌株。
【背景技術】
[0002]人工合成染料廣泛應用于印染、皮革、食品、化妝品、紙制品等行業，由此產生大量的染料廢水。由于染料廢水具有色度高、組分復雜、化學穩定性強、生物可降解性差等特點，大量的染料隨著工業廢水的排放進入環境中，多數偶氮染料具有潛在的三致效應(致畸、致癌、致突變)，對環境和人類健康具有嚴重的危害。目前我國珠三角地區染料年使用量超過2 X IO4噸，其中有10~20%染料直接排放到環境中，偶氮類染料占總排放量的50%左右。
[0003]目前對染料廢水的處理方法有很多，化學法如絮凝法、氧化法、電化學法、物理法如氣浮法、超聲波法、膜分離法、吸附及萃取等，這些方法雖然有效、處理效果好，但處理成本較高，容易造成二次污染。傳統的活性污泥法、膜生物法等生物處理法雖然成本低，無二次污染，但由于染料的可降解性差，無法被普通的微生物徹底降解，其應用受到一定的限制。
[0004]從環境中分離和篩選出能夠高效降解染料的微生物菌種，將其應用于染料廢水的處理，是行之有效的生物處理法，具有良好的應用前景和生態效益。目前對現有的賴氨酸芽孢桿菌sp.)的研究主 要集中在其還原重金屬的能力或對持久性的有機污染物的降解能力，例如專利CN 102363756A公布一株賴氨酸芽孢桿菌
sp.GY32對多氯聯苯醚BDE209的降解，專利CN103395893A公布了一株能還原Cr6+的賴氨酸芽孢桿菌。而目前國內還未見賴氨酸芽孢桿菌用于染料脫色的研究文獻和專利報道。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題是填補本【技術領域】空白，提供一株能夠高效降解染料的賴氨酸芽孢桿菌株。
[0006]本發明要解決的另一技術問題是提供所述菌株的分離方法以及培養方法。
[0007]本發明的目的通過以下技術方案予以實現:
提供一株高效降解染料的賴氨酸芽孢桿菌菌株sp.)FS1,于2013年11月10日保藏于中國典型培養物保藏中心(地址是中國湖北省武漢市珞珈山武漢大學)，保藏編號為:CCTCC NO:M 2013561。保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M 2013561。
[0008]所述菌株為桿菌，革蘭氏陽性，菌落圓形、表面光滑扁平、邊緣整齊、淡黃色、不透明、有珍珠光澤、菌落直徑2mm~6mm,該菌株16S rDNA的序列如SEQ ID N0.1所示。與Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717 (NCBI 登錄號 AB271743)具有 99% 的同源性。
[0009]本發明所述高效降解染料的菌株FSl在染料降解方面獲得很好的應用效果，尤其是在染料廢水脫色方面。
[0010]本發明同時提供了所述高效降解染料的菌株FSl的分離方法，是將采集的活性污泥樣品經菌種富集培養基富集培養至有明顯脫色現象后，梯度稀釋，將梯度稀釋后的菌液涂于篩選培養基平板上，培養24~48h，挑取明顯脫色圈，37°C連續劃線、挑單菌落于篩選培養基培養直至無雜菌后，挑取單菌落于脫色培養基中，于37°C靜置培養即得。
[0011]本發明提供所述分離方法分離得到的高效降解染料的菌株FSl在染料降解方面的應用，尤其是在染料廢水脫色方面具有很好的應用效果。
[0012]所述富集培養基的組成為:牛肉膏lg，蛋白胨2g，葡萄糖3g，K2HP04 2g，NaH2PO40.5g, MgSO4.7H20 0.2g, MnSO4.7H20 0.02g, FeCl3.7H20 0.01g, CaCl2 0.02g，無菌水 1L,pH 7.2 ；
所述篩選培養基的組成為:酵母粉5g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，瓊脂20g，無菌水1L，ρΗ7.2 ；
所述脫色培養基的組成為:碳源2g，氮源lg，NaH2PO4 0.5g，K2HPO4 2g，FeSO4.7H200.01g, MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，無菌水 1L, pH 7.2。
[0013]以上培養基均可在121°C滅菌15~30min。
[0014]本發明所述菌株最初是從廣東省廣州市某工業園廢水處理曝氣池活性污泥中分離得到。
[0015]本發明所述高效降解染料的菌株FSl的培養方法，是將所述菌種接種于液體培養基中，于30~37° C下搖床培養10~24h即得所述菌株的培養液；
所述液體培養基的組成為:葡萄糖2g，氯化銨lg，NaH2PO4 0.5g, K2HPO4 2g, FeSO4.7H20
0.01g, MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，水 1L, pH7.2。
[0016]本發明所述培養方法培養得到的菌株培養液在染料降解方面具有很好的應用。尤其是在染料廢水脫色方面具有很好的應用效果。
[0017]本發明所述菌株及其培養液在染料脫色方面的應用涉及多種染料，特別對偶氮染料廢水降解效果更佳。
[0018]更為優選地，對甲基橙、酸性紅B、中性紅和/或亞甲基藍等多種染料具有優良的降解效果。
[0019]優選地，所述應用最適用的染料的濃度范圍為80~5000mg/L，能獲得優良的脫色效果。
[0020]優選地,菌株sp.FSl對亞甲基藍的脫色濃度不高于4000mg/L。
[0021]優選地,菌株sp.FSl對中性紅的脫色濃度不高于2000mg/L。
[0022]優選地,菌株577.FSl對甲基橙的脫色濃度不高于500mg/L。
[0023]優選地,菌株sp.FSl對酸性紅B的脫色濃度不高于5000mg/L。
[0024]優選地，所述應用中，是將所述高效降解染料的菌株FSl培養至對數生長期，取培養液，按體積比為I~5%的接種量接入脫色基礎培養基中，加入所述染料進行常溫培養，實現脫色。優選地，所述常溫培養的溫度為10~40°C，pH6~9，培養時間10~24h。
[0025]優選地，所述應用中，是將高效降解染料的菌株/?/的菌株培養液按體積比為I~5%的接種量接入脫色基礎培養基中，加入所述染料進行常溫培養，實現脫色。
[0026]優選地，所述常溫培養的溫度為10~40°C，pH6~9，培養時間10~24h。
[0027]本發明有益效果:
本發明提供了一株新的菌株，該菌株分離自工業園廢水處理曝氣池活性污泥中，分離步驟簡單，制備成本較低。所述菌株生長迅速，環境適應性強，具有廣譜的染料降解能力，對多種染料都具有很好的脫色效果，培養IOh即能達到最大脫色率，脫色率可達90%以上，最大脫色濃度達5000mg/L。
[0028] 本發明將所述菌株應用于印染廢水以及相關的染料廢水脫色處理，可解決已有技術中缺乏高效降解效果、環境適應能力差等特點，能有效避免難于自然降解的染料分子直接進入水體導致的環境污染，且無二次污染，具有良好的生態效率和應用前景。
[0029]本發明首次將賴氨酸芽孢桿菌iLysinibacillus sp.)應用于染料降解,填補了國內技術空白，為解決染料污水處理尤其是脫色問題提供有力的技術基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1 -,Lysinibacillus sp.FSl 的掃描電鏡圖，標尺=1 Mm。
[0031]圖2 'Lysinibacillus sp.FSl 的系統發育樹。
[0032]雇..Lysinibacillus sp.FSl對不同濃度亞甲基藍的脫色效果。
[0033]圖4 'Lysinibacillus sp.FSl對不同濃度中性紅的脫色效果。
[0034]風b..Lysinibacillus sp.FSl對不同濃度甲基橙的脫色效果。
[0035]圖6 'Lysinibacillus sp.FSl對不同濃度酸性紅B的脫色效果。
[0036]^r1--Lysinibacillus sp.FSl 對酸性紅 B 的吸附與降解。
[0037]臀[私-.Lysinibacillus sp.FSl降解酸性紅B的光譜掃描圖。
【具體實施方式】
[0038]下面結合附圖和具體實施例進一步說明本發明。除非特別說明，本發明采用的原理和方法、設備為本領域常規使用的原理、方法和設備。
[0039]實施例1 Lysinibacillus sp./?1/菌株的分離獲得
1.菌株活化與富集
取50mL活性污泥樣品(取自廣東省廣州市工業園廢水處理曝氣池)，放入盛有50mL無菌水的錐形瓶中(內有數顆玻璃珠)，于搖床振蕩30min充分打散泥樣。取打散后的懸浮泥樣5mL，接種至盛有IOOmL的富集培養基中，加入30mg/L的酸性紅B染料，37°C、200rpm振蕩培養16~24h。
[0040]所述富集培養基的組成為:牛肉膏lg，蛋白胨2g，葡萄糖3g，K2HP04 2g，NaH2PO40.5g，MgSO4.7H20 0.2g, MnSO4.7H20 0.02g, FeCl3.7H20 0.01g, CaCl2 0.02g，無菌水1L, pH 7.2 ;將培養基在121°C滅菌15~30min即得。
[0041]2.菌株篩選和純化
將有明顯脫色效果的富集后的培養液，用無菌生理鹽水試管逐級稀釋到10'10_2、10' 10_4、10_5、10_6、10_7共7個梯度。每個梯度取0.1mL的稀釋液涂布于含有30mg/L的酸性紅B的篩選培養基平板上，37°C培養24~48h。觀察單個菌株周圍是否有脫色圈出現。挑取具有脫色能力的菌株，37°C連續劃線接種到篩選培養基平板上，進一步純化和確認獲得一株高效降解染料的賴氨酸芽孢桿菌菌株sp.)/^57,所述菌株為桿菌,革蘭氏陽性，菌落圓形、表面光滑扁平、邊緣整齊、淡黃色、不透明、有珍珠光澤、菌落直徑2mm~6mm,附圖1為菌株的電鏡掃描圖。該菌株16S rDNA濃擇魏與Lysinibacillus fusiformisNBRC 15717 (NCBI登錄號AB271743)具有99%的同源性。該菌株的系統發育樹見附圖2。
[0042]將所述菌株于2013年11月10日保藏于中國典型培養物保藏中心(地址是中國湖北省武漢市珞珈山武漢大學)，保藏編號為=CCTCC NO:M 2013561。保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013561。
[0043]實施例2 Lysinibacillus sp.FSl對不同濃度亞甲基藍的脫色效果試驗 將本發明所述高效降解染料的菌株FSl接種于液體培養基中，于30~37°C、150rpm下
搖床培養10~24h即得所述菌株的培養液；所述液體培養基的組成為:葡萄糖2g，氯化銨lg, NaH2PO4 0.5g, K2HPO4 2g, FeSO4.7H20 0.01g, MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，水 1L,pH7.2。
[0044]取對數生長期(OD6qq=I)的sp.FSl 培養液，按 1% (V/V)接入IOOmL的脫色基礎培養基中，分別加入不同濃度梯度(80mg/L、500mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L)的亞甲基藍染料。三個平行，常溫培養，每隔5~24 h測定培養液的吸光值。
[0045]用脫色率來考察菌株FSl的脫色能力。在200~800 (nm)波長范圍內掃描染料溶液的吸光值，選出最大吸收峰M的波長作為染料吸光值的測定波長。將待測培養液于5000rpm條件下離心10min。取上層清液測定吸光值。按照公式計算脫色率:
脫色率(η) =A0-A1/A0X 100%
A0:培養液初始的吸光值-,A1:培養一段時間后的吸光值
結果如附圖3所示，亞甲基藍濃度為80~500mg/L時脫色率在IOh內就可以達到80%以上。雖然當亞甲基藍濃度高于500mg/L時，菌株FSl對其的脫色率隨著染料濃度升高而降低，但在4000mg/L濃度下仍有一定脫色能力，脫色率為40%。HLysinibacillus sp.FSl對亞甲基藍的最高脫色濃度高達4000mg/L。
[0046]實施例3 Lysinibacillus sp.FSl對不同濃度中性紅的脫色效果試驗
參照實施例2，培養所述菌株，取對數生長期(0D_=1)的菌株FSl培養液，按1% (V/V)接入IOOmL的脫色基礎培養基中，分別加入不同濃度梯度(80mg/L、300mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L)的中性紅染料。其他同實施例2。
[0047]試驗結果如附圖4所示，當中性紅濃度為300~1000mg/L時脫色率在IOh基本達到最大脫色率90%左右，當濃度升高時菌株脫色時間增長約為48h。隨著中性紅濃度的提高，菌株對其的脫色能力逐漸下降，由99%下降為30%。舊麻LysinibaciIIus sp.FSl對中性紅的最高脫色濃度高達2000mg/L。
[0048]實施例4 Lysinibacillus sp.FSl對不同濃度甲基橙的脫色效果試驗
參照實施例2，培養所述菌株，取對數生長期(0D_=1)的菌株FSl培養液，按1%(V/V)接入IOOmL的脫色基礎培養基中，分別加入不同濃度梯度(80mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L)的甲基橙染料。其他同實施例2。
[0049]結果如附圖5所示，甲基橙濃度為80~300mg/L時，IOh脫色率為90%左右。但當濃度進一步升高時(400~500mg/L)時，脫色率雖然下降，但也能去除60%左右。菌株Lysinibacillus sp.FSl對甲基橙的最佳脫色濃度為500mg/L。
[0050]實施例5 Lysinibacillus sp./?1/對不同濃度酸性紅B的脫色效果驗證取對數生長期(0D_=1)的菌株FSl培養液，按1% (V/V)接入IOOmL的脫色基礎培養基中，分別加入不同濃度梯度(80mg/L、300mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L)的酸性紅B染料。其他同實施例2。
[0051]結果如附圖6所示，當酸性紅B濃度為80~1000mg/L時脫色率在10~24h基本達到最大90%左右。雖然隨著酸性紅B濃度由80mg/L提高到5000mg/L，菌株對其的脫色能力由93%逐漸下降，但最低也有28%。具有明顯的降解脫色處理效果。菌株FSl對酸性紅B的最聞脫色濃度聞達5000mg/L。
[0052]實施例6 Lysinibacillus sp.FSl對酸性紅B吸附與降解效果的驗證實驗 取對數生長期(OD6tltol=I)的菌株FSl培養液，其中一組進行高壓滅菌作為滅活組，另一
組不滅活作為未滅活組。兩組菌液分別用海藻酸鈉進行固定，制成直徑5mm左右的固定化小球，按1%接種量接種到含有80mg/L酸性紅B的脫色培養基中。其他同實施例2。
[0053]結果如附圖7所示，未滅活組在20h時脫色率就可以達到93%左右，而滅活組脫色率一直維持在O~7%以內。滅活組的脫色率下降是因為菌體和小球吸附導致的，而未滅活組的脫色率下降是吸附和細菌降解共同作用導致。
[0054]此外,在培養過程中每隔3h在200~800nm波長范圍內掃描未滅活組培養液光譜的吸光值。結果如附圖8所示，光譜曲線從上到下依次為0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h的光譜掃描曲線。可見，在Oh時最大吸收峰515nm的吸光值為2.2，培養到3h、6h、9h、12h、15h、18h時最大吸收峰的吸光值分別降至2.0、1.9、1.7、1.5,0.3，脫色率分別為10%、14%、23%、32%,86% ;從圖中可以發現隨著培養時間的增長，最大吸收峰的吸光值逐漸下降，在18h時已經沒有最大吸收峰， 曲線基本平滑，表明酸性紅B確實被sp.FSl所降解。因此，本發明所述的sp.FSl對染料的脫色作用主要是通過菌株的生物降解作用實現的。
【權利要求】
1.一株高效降解染料的菌株如Ci77m 577.) FSl，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013561。
2.根據權利要求所述高效降解染料的菌株FS1，其特征在于，所述菌株16SrDNA的序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據權利要求所述高效降解染料的菌株FS1，其特征在于，所述菌株為桿菌，革蘭氏陽性，菌落圓形、表面光滑扁平、邊緣整齊、淡黃色、不透明、有珍珠光澤、菌落直徑2mm~6mm ο
4.權利要求1、2或3所述高效降解染料的菌株FSl的分離方法，其特征在于，是將采集的活性污泥樣品經菌種富集培養基富集培養至有明顯脫色現象后，梯度稀釋，將梯度稀釋后的菌液涂于篩選培養基平板上，培養24~48h，挑取明顯脫色圈，37°C連續劃線、挑單菌落于篩選培養基培養直至無雜菌后，挑取單菌落于脫色培養基中，于37°C靜置培養即得。
5.根據權利要求4所述的分離方法，其特征在于，所述富集培養基的組成為:牛肉膏lg，蛋白胨 2g，葡萄糖 3g, K2HPO4 2g,NaH2PO4 0.5g,MgSO4.7Η20 0.2g,MnSO4.7Η20 0.02g,FeCl3.7Η20 0.01g, CaCl20.02g，無菌水 1L, pH 7.2 ； 所述篩選培養基的組成為:酵母粉5g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，瓊脂20g，無菌水1L，ρΗ7.2 ； 所述脫色培養基的組成為:碳源2g，氮源lg，NaH2PO4 0.5g，K2HPO4 2g，FeSO4.7H20.0.01g, MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，無菌水 1L, pH 7.2。
6.權利要求1、2或3所述高效降解染料的菌株FSl的培養方法，其特征在于，將所述菌種接種于液體培養基中，于30~37°C下搖床培養10~24h即得所述菌株的培養液。
7.根據權利要求6所述高效降解染料的菌株FSl的培養方法，其特征在于，所述液體培養基的組成為:葡萄糖 2g，氯化銨 lg, NaH2PO4 0.5g，K2HPO4 2g，FeSO4.7H20 0.01g,MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，水 1L, pH7.2。
【文檔編號】C12R1/01GK103937697SQ201410015741
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年1月14日 優先權日:2014年1月14日
【發明者】陶然, 楊揚, 蘇萌, 趙建成, 鐘勝強 申請人:暨南大學