棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因（GhDGAT2-5）及其在植物育種中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因、含有所述基因的表達載體，以及所述基因在制備改良植物品種中的應用；本發明同時還提供了干擾所述基因表達的特異性基因序列，含有所述特異性基因序列的表達載體，以及所述特異性基因序列在制備轉基因棉花中的應用。
【專利說明】棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因(GhDGAT2-5)及其在植物
育種中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程領域，主要涉及一種棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因、干擾其表達的植物表達載體以及所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因在棉花育種中的應用。
【背景技術】 [0002]棉花是世界上最重要的天然纖維作物，也是最重要的經濟作物。我國是世界上最大的紡織品生產國和消費國，棉紡織品是我國出口創匯的重要支柱產業，棉花產業在我國的國民經濟中具有舉足輕重的地位。隨著社會經濟的發展，我國可耕地面積在逐年減少，糧棉爭地矛盾十分突出，棉花生產受到嚴峻挑戰，因此必須改良棉花品種，提高單位產量來應對這種挑戰。棉花的產量和品質性狀為多基因控制的數量性狀。而且，產量與品質性狀之間存在遺傳上的負相關。棉花栽培品種主要是陸地棉，而優良纖維品質基因主要源于二倍體的瑟伯氏棉(纖維強度)、異常棉(纖維強度與細度)以及四倍體的海島棉(纖維強度與細度)等。這些優良性狀基因的利用，在常規育種中受到諸多限制。如二倍體的瑟伯氏棉與異常棉為野生種，與四倍體陸地棉雜交后，存在遠緣雜交帶來的農藝性狀差、后代難于穩定、周期長、容易引入一些不利基因等問題。即便是同為四倍體的海島棉與陸地棉雜交，同樣存在后代分離大、難于穩定，產量-品質負連鎖關系仍難打破等問題(Culp和Harrell，1979)。自1984年我國棉花畝產突破60kg以來，近20年來的平均年產量均在IOOkg左右。同樣，美國棉花的單位面積產量也已進入了停滯不前的平臺期，單靠現有的棉花遺傳種質資源和常規育種手段已經難以大幅度提高棉花產量(Meredith,2000 ；Seagull RW等，2004，J CottonSci,, 8, 105-111)。因此，要進一步提高棉花的單位面積產量，改良纖維品質，應該尋找新的育種途徑。
[0003]棉花纖維是由胚珠外珠被表層細胞經分化突起、伸長和細胞壁增厚而形成的，整個發育過程可分為:纖維原始細胞分化、纖維伸長(初生壁形成)、次生壁形成和纖維脫水成熟四個時期(Zhong，2001)。由于棉纖維是從胚珠表皮直接發育而來，因此，其產量、品質的形成與胚珠發育密切相關。棉花胚珠在開花受精后直接發育為種子，在此發育過程中不僅有胚的形成，而且還有作為主要貯藏物質場所的子葉的形成。棉花子葉中的貯藏物質以蛋白質和脂肪為主，它們的含量呈極顯著負相關(王延琴等，2003)。植物種子中儲存的脂肪酸常以三酰甘油酯(TAGs)的形式存在，即在甘油骨架上附連三個脂肪酸的形式。而脂肪酸成分主要是16至18碳或含一至三個雙鍵的脂肪酸，如硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等。脂肪酸代謝主要是在質體和內質網中進行的，首先，合成脂肪酸的碳源主要是蔗糖，在種子中通過糖酵解途徑將其轉變成己糖，并氧化成乙酰CoA (乙酰輔酶A)。而TAG合成的骨架成分甘油3-磷酸也是通過糖酵解的中間產物合成的。隨后，在質體中經乙酰CoA羧化酶(ACC)將乙酰CoA合成為丙二酰單酰CoA。然后脂肪酸合成酶復合物(FAS)以丙二酸單酰CoA為底物進行連續的聚合反應，經過數次循環聚合反應后，脂肪酸的合成可在酰基-ACP硫酯酶或酰基轉移酶的作用下終止。而終止聚合后的不同碳鏈長度的酰基ACP，在酰基CoA合成酶的作用下合成酰基CoA，并從質體轉運到內質網或胞質中。最后利用貯存在胞質中的酰基CoA池，在內質網上通過三種不同的酰基轉移酶，即甘油3-磷酸酰基轉移酶(G3P-AT)、溶磷脂酸酰基轉移酶(LPA-AT)和二酰甘油酰基轉移酶(DGAT)，分別在甘油上連接脂肪酸以合成三酰甘油酯和結構磷脂(Cahoon等，Curr Opin PlantBiol.2007，10:236-44)。前人的研究(Shockey 等，Plant Cell2006, 18:2294-2313 ；Kroon等，Phytochemistry2006, 67:1166-1176)發現,在發育的種子中，DGAT催化酰基CoA和二酰甘油酯合成TGA的最后一步，雖然對于多種酰基轉移酶之間的相互作用不清楚，但DGAT在油脂的合成中為關鍵限速步驟，直接影響種子中TAG的含量和成分已經明確。
[0004]我們通過抑制陸地棉胚珠發育過程中GhDGAT2_5基因的表達，降低成熟種子的油脂含量，提高了其蛋白質含量，最終達到增加種子重量和纖維產量的目的，從而在農業生產中創造更大的經濟效益和社會效益。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是提供一種分離自棉花的棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因(GhDGAT2-5)，具有如SEQ ID N0.1所示的序列。所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因編碼的蛋白質，其具有如SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列。
[0006]本發明還提供了含有所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因的表達載體。優選地，所述表達載體具有如圖2B所示的結構。
[0007]本發明的又一個目的是提供一種提高植物種子含油量的方法，包括將所述的二酯酰甘油酰基轉移酶基因(GhDGAT2-5)整合進入植物構建轉基因植物，并使所述二酯酰甘油酰基轉移酶基因在植物種子中表達的步驟。
[0008]本發明的另一個`目的是提供一種干擾所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因表達的特異性基因干擾序列，具有如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。以及含有所述特異性基因干擾序列的干擾表達載體，優選地，所述干擾表達載體具有如圖3B所示的結構。
[0009]本發明的又一個目的是提供一種轉基因棉花的制備方法，包括以下步驟:
[0010](I)構建含有如3B所示結構的干擾表達載體；
[0011](2)將所述干擾表達載體轉化宿主，獲得轉化體；
[0012](3)將所述轉化體轉化棉花，獲得轉基因棉花。
[0013]本發明的又一個目的是提供一種提高棉花種子蛋白質含量和纖維產量的方法，包括構建干擾SEQ ID N0.1所示序列的二酯酰甘油酰基轉移酶基因(GhDGAT2-5)表達的干擾表達載體并轉化到棉花宿主中，干擾所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因表達的步驟。
[0014]本發明的又一個目的是提供所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因或干擾所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因表達的特異性基因干擾序列基因在改良植物品種中的應用。
[0015]具體地，本發明以煙草為例，提高煙草種子含油量的方法是通過在煙草種子中特異表達本發明所述的棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因，以增加煙草種子中TAG的量，最終達到提高煙草種子含油量的目的。本發明提高棉花種子蛋白質含量和纖維產量的方法，是通過在棉花中表達一種陸地棉甘油二酯酰酰基轉移酶基因的一段特異序列，干擾陸地棉甘油二酯酰酰基轉移酶基因的表達，以增加棉花種子中蛋白質含量和種子重量，提高纖維產量目的。試驗結果證明，將該基因在煙草中正義表達后，煙草種子的含油量最高可提高
7.15%。同時，在陸地棉中表達該基因的特異片段，干擾該基因的表達，轉基因棉花種子重量增加的幅度在9.9%到71.82%之間，蛋白質含量的增幅為0.08%~2.42%，纖維的增幅為
11.2%~35.4%。本發明方法簡便易行，效果顯著，不僅能提高棉花種子的蛋白質含量，提高棉籽餅的飼料利用價值，而且，能增加棉花纖維產量產生巨大的經濟效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1:陸地棉甘油二酯酰酰基轉移酶(GhDGAT2_5)的同源性比對。
[0017]Mt:苜猜，Gm:大豆,Jc:麻風樹，Vv:葡萄，Ag:花生,Oe:油橄欖,Re:蓖麻，At:擬南芥，Ha:向日葵，Pt:楊樹，Bn:油菜，Zm:玉米,Sb:高粱，Eo:油棕，Os:水稻，Hv:大麥，Gh:棉花
[0018]圖2:2A是陸地棉甘油二酯酰酰基轉移酶基因(GhDGAT2_5)正義表達載體的構建流程圖；2B是正義表達載體pCB2012-GhDGAT2-5的結構圖。
[0019]其中載體主要元件標示，gus::npt:β-葡萄糖酸苷酶與新霉素磷酸轉移酶的融合基因；nos:終止子；kanamycin:卡那霉素抗性基因；35S:來源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動子；CaMV35S poly A:35S終止子；35S P:35S組成型啟動子；T-Border =T-DNA插入邊界。
[0020]圖3:3A是陸地棉甘油二酯酰酰基轉移酶基因干擾表達載體的構建流程圖；3B是干擾表達載體p5-35S-GhDGAT2-5RNAi的結構圖。
[0021]載體主要元件標示，Km:卡那霉素抗性基因；35S:來源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動子；gus::npt: β -葡萄糖酸苷酶與新霉素磷酸轉移酶的融合基因；poly A:35S終止子；35S P:35S組成型啟動子；LB =T-DNA左邊界；RB =T-DNA右邊界。
[0022]圖4是Ttl代不同轉基因煙草株系中GhDGAT2_5基因的表達量
[0023]35S::GhDGAT2-5轉基因煙草10個株系與野生型進行GhDGAT2_5的表達分析，結果Nt3#、Nt13#表達水平較高，分別比野生型提高了 600~850倍。Nt3、Nt4、Nt7、Nt8、Nt9、NtlO、Ntll、Nt2、Ntl3和Ntl5:不同的煙草TO代轉基因株系，WT:野生型煙草。
[0024]圖5是Ttl代不同轉基因煙草株系中種子油脂含量
[0025]通過測定野生型和轉基因植株種子中的油脂含量，結果發現所有轉基因株系種子的油脂含量均高于野生型。野生型煙草種子的脂質含量為38.66%，轉化GhDGAT2-5基因的轉基因Ttl代煙草種子的油脂含量均在40%以上，Ntl3達到了 41.44%。相比與野生型脂質含量，轉基因植株提高了 5.6%和7.18%。Nt3、Ntl3 =Ttl代轉基因煙草植株，WT:野生型煙草。
[0026]圖6:轉基因棉花胚珠中GhDGAT2_5基因的表達量檢測
[0027]提取轉基因植株和野生型冀棉14的40DPA胚珠的RNA，反轉錄成cDNA，用于分析GhDGAT2-5基因在轉基因植株中的表達量。實時定量PCR分析結果表明:與野生型棉花的GhDGAT2-5基因表達水平相比，1-3#株系抑制了 68%，1-5#和5-2#株系抑制了約86%，尤其是轉基因棉花1-7#, 1-8#, 2-7#, 3-8#, 4-1#, 4-5#等六個株系，GhDGAT2_5基因的表達抑制達90%以上。
[0028]圖7:轉基因棉花種子大小的變化
[0029]1-3:35Sl-3植株種子，4-l:35S4-l植株種子，l-7:35Sl-7植株種仁，WT:野生型種子和種仁。A1、A2:轉基因35S1-3、35S4-1植株的棉籽大小與野生型(WT)的比較。A3:轉基因35S1-7植株的棉籽仁大小與野生型的比較。由圖A可見轉基因棉花種子和種仁均大于野生型的。
[0030]B1、B2為野生型和Ttl轉基因棉花種子大小測定結果的柱形圖，由圖可見=Ttl代轉基因種子的長和寬均大于野生型，其中長度增加了 5.3%~29%，寬度增加了 21.9%~24.3%，表明轉基因棉花種子的體積增加了。
[0031]圖8:陸地棉甘油二酯酰酰基轉移酶基因(GhDGAT2_5)在陸地棉不同組織及胚珠各個發育階段的表達測定。
[0032]A:flower:花，stem:^,root:根,petiole:葉柄，ovule40d:開花后 40 天的胚珠；B:ovule xd:開花后不同天數的胚珠。
[0033]利用實時定量RT-PCR檢測了 GhDGAT2_5基因在冀棉14的根、莖、葉、花等不同組織中的表達，結果顯示GhDGAT2-5基因在莖和葉柄中的表達水平極低，在胚珠中的表達水平比根的高10倍。進一步檢測了 GhDGAT2-5基因在棉花胚珠O~40d發育時期的表達水平，結果表明該基因在Od~IOd其表達量呈現一個小高峰，15d~30d表達量較低，而在35d~40d表達較高。
[0034]圖9:轉基因棉花株系種子籽指的統計。
[0035]A表示Ttl代籽指測定結果的柱形圖，由圖可見轉基因棉花的籽指升高，野生型棉花的籽指為10.002g，轉基因35S4-1植株的籽指最高為14.55g，六個不同的轉化子，其籽指均高于野生型，增加的幅度在19%和45%之間。B表示T1代籽指測定結果的柱形圖，其中，T1代轉基因棉花分別來源于3-8株系和5-2株系，命名為3-8-1#，3-8-3#, 3-8-4#和5-2-2#，3-8#株系的T1代對照是Nul 11，5-2株系的T1代對照是Nul 12。對照Nul 11的籽指為6.023g，轉基因棉花3-8-1#, 3-8-3`#, 3-8-4#提高的幅度在71.82%和26.48%之間。Null2的籽指為7.68g，轉基因棉花5-2-2#的籽指提高了 9.9%。Null:從轉基因棉花中分離出的非轉基因對照。
[0036]圖10 =T0代不同轉基因棉花株系種子油脂含量測定
[0037]選擇GhDGAT2_5基因表達水平較低的Ttl代轉基因棉花種子，索氏抽提法提取棉籽油脂。結果顯示:野生型棉花種子的含油量為25.96%，而抑制GhDGAT2-5基因的Ttl代轉基因棉花種子的含油量均低于野生型棉花，其中植株1-5#的含油量為21.12%，是所測株系中最低的。相較于野生型油脂含量，轉基因植株降低了 4%~18.64%。轉基因植株1-3#, 1-7#, 1-8#, 4-1#做了三個重復，經t-測驗分析，植株1-8#，4-1#的平均含油量與WT的差異均達到顯著水平(0.01 < P < 0.05)，植株1-7#的平均含油量與WT的差異達到極顯著水平(P < 0.01)。
[0038]35S1-3, 35S1-5, 35S1-7, 35S1-8, 35S4-1, 35S5-2 為不同的 TO 代轉基因植株，WT:
野生型棉花。
[0039]圖11 =Ttl代不同轉基因棉花株系種子的蛋白含量測定
[0040]采用凱氏定氮法測定了 8個轉基因株系種子的粗蛋白質含量，根據蛋白的測定結果，轉基因植株4-1#的棉籽蛋白含量與野生型相比基本沒有變化，其他五個植株的棉籽蛋白含量都上升了，增幅為0.08%~2.42%，經t-測驗分析，植株1-8#的蛋白含量呈現顯著性差異(0.01 < P < 0.05)。所以，與野生型相比，轉基因植株的棉籽蛋白含量總體趨勢是升聞的。
[0041]圖12 =T0代不同轉基因棉花纖維產量測定
[0042]A =T0代轉基因棉花的衣分，B =T0代轉基因棉花的纖維長度，C =T0代轉基因棉花的衣指，35S1-3，35S1-7, 35S1-8, 35S4-1, 35S5-2為不同的Ttl代轉基因植株，WT:野生型棉花。
[0043]與野生型相比，1-7#轉基因棉花的衣分增加了 0.94%，1-3#, 1-8#, 4-1#, 5-2#轉基因棉花的衣分降低了 0.55%~0.6% (圖12A);而4-1#，5-2#轉基因棉花成熟棉纖維長度分別比野生型對照減少了 12.6%, 7.6%，1-3#轉基因棉花成熟棉纖維長度增加了 1.34% (圖12B);除植株1-3#外，T0代轉基因棉花植株衣指都比野生型高，增幅為11.2%~35.4% (圖12C)。表明抑制GhDGAT2-5的表達，T0代轉基因棉花纖維的衣分變化不大，纖維長度有所下降，而衣指增加了。 [0044]圖13 =T1代不同轉基因棉花纖維產量測定
[0045]A =T1代轉基因棉花的衣分，B =T1代轉基因棉花的纖維長度，C =T1代轉基因棉花的衣指。35S3-8-1, 35S3-8-3, 35S3-8-4, 35S5-2-2 分別為 T1 代的轉基因株系，Nulll, Null2分別為35S3-8和35S5-2的對照。
[0046]對于T1代轉基因棉花的種子，分析了纖維的衣分，長度及衣指等相關指標:對照Nulll的纖維長度是3.15cm,衣分是40.27%，衣指是4.06g,對照Null2的纖維長度是
3.23cm,衣分是39.24%，衣指是4.958g。與對照相比(圖13C)，3-8-4#株系的衣指略微降低，3-8-1#，3-8-3#, 5-2-2#三個株系的衣指增幅為30.8%~53.4%。轉基因5-2-2#株系的衣分提高了 20.8%，其他三個株系的衣分與野生型基本一致(圖13A)。轉基因株系3-8-1#, 3-8-3#, 3-8-4#的纖維長度下降了 1.1%~4.4%，轉基因株系5-2-2#的纖維長度增加了 5.2% (圖 13B)。
[0047]圖14:油脂、糖酵解及蛋白合成途徑中的關鍵基因在轉基因棉花1-7#中的表達
[0048]以1-7#植株40DPA的胚珠cDNA為檢測對象，實時定量PCR分析顯示:乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的表達變化不明顯。FAD家族中除FAD2表達水平基本不變，其他三個基因的表達水平都高于野生型，尤其是FAD7基因，增加了約4.5倍；KAS1、KASII的表達量與野生型相比提高了 I倍以上；LPAAT、PAP、ACCase四個基因的表達水平變化不明顯；而RODl基因的表達水平下降了 50%以上。與野生型陸地棉相比，GPAC.PDHa的表達水平提高了 2.5倍以上，而PFK的表達水平略低于野生型。蛋白質合成中的2個關鍵基因GPT和GS基因的表達水平分別降低了 39.1%和36%。
【具體實施方式】
[0049]以下結合附圖對本發明進行進一步的詳細說明，但以下說明并不對本發明進行限定，任何對本發明的變形和改變，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求所定義的范圍。
[0050]本發明實例中的試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體說明的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell, 2001)。
[0051]【實施例1】陸地棉甘油二酯酰酰基轉移酶基因(GhDGAT2_5)的克隆
[0052]利用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒(Aidlab)提取棉花胚珠的RNA。參照 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (clontech)說明書進行 cDNA 的合成，用作GhDGAT2-5基因克隆的模板。最后用設計合成的該基因的特異引物1&2 (SEQ ID N0.4&5),以上述的cDNA為模板，擴增該基因的完整cDNA序列。擴增條件如下:
[0053]
【權利要求】
1.一種分離的棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因，具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因編碼的蛋白質，其具有如SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。
3.含有如權利要求1所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因的表達載體。
4.如權利要求3所述的表達載體，其特征在于，具有如圖2B所示的結構。
5.一種提高植物種子含油量的方法，包括將權利要求1所述的二酯酰甘油酰基轉移酶基因整合進入植物構建轉基因植物，并使所述二酯酰甘油酰基轉移酶基因在植物種子中表達的步驟。
6.權利要求1所述的基因在改良植物品種中的應用。
7.一種干擾表達載體，其含有干擾權利要求1所述棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因表達的特異性基因干擾序列。
8.如權利要求7所述的干擾表達載體，其特征在于，所述特異性基因干擾序列如SEQID N0.3 所示。
9.如權利要求8所述的干擾表達載體，其特征在于，具有如圖3B所示的結構。
10.一種轉基因棉花的制備方法，包括以下步驟: (O構建含有如權利要求9所述的干擾表達載體； (2)將所述干擾表達載體轉化宿主，獲得轉化體； (3)將所述轉化體轉化棉花，獲得轉基因棉花。
11.一種提高棉花種子蛋白質含量和纖維產量的方法，包括構建干擾權利要求1所述基因表達的干擾表達載體并轉化到棉花宿主中，干擾棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因表達的步驟。
12.干擾棉花二酯酰甘油酰基轉移酶基因表達的DNA在改良棉品種中的應用，其中所述的DNA具有如SEQ ID N0.3所示的序列。
【文檔編號】C12N15/84GK103773782SQ201410014304
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】侯磊, 魏茂瓊, 裴炎, 梁愛敏, 李先碧, 張覓, 羅明, 肖月華, 李德謀, 宋水清 申請人:西南大學