羰基還原酶、其基因及用于度洛西汀手性中間體的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種來源于金黃桿菌（Chryseobacteriumsp.CA49）的羰基還原酶ChKRED15及其編碼基因，并利用該羰基還原酶作為生物催化劑制備度洛西汀手性醇中間體(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。產物的對映體過量值大于99.9%。以ChKRED15粗酶液（2U/mL）可催化20g/L的底物，2h內獲得99%以上轉化率，且輔酶循環體系簡單、具有較大的工業應用前景。
【專利說明】羰基還原酶、其基因及用于度洛西汀手性中間體的制備
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種新的基因及其蛋白質產物，具體涉及一種來源于金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49)的新型羰基還原酶ChKRED15及其基因，并利用這種羰基還原酶作為生物催化劑制備度洛西汀手性中間體，屬于應用微生物與酶工程領域。
【背景技術】
[0002]度洛西汀是第三代抗抑郁藥，是市場銷售最主要的抗抑郁藥，能有效地抑制5-羥色氨和去甲腎上腺素的再攝取(Wong DT’et al.Life Sci，1988，43:2049-2057)，高效、安全、副作用小，對其他癥狀如全身疼痛和胃腸道紊亂也有療效(Bymaster FP, et al.Neuropsychopharmacology, 2001, 25:871-880)。該藥還被批準用于糖尿病引起的神經疼痛以及女性尿失禁的治療(Norton PA, et al.Am J Obstet Gynecol, 2002, 187:40-48)。
[0003]度洛西汀含有一個手性中心，研究表明僅⑶構型的對映體具有藥物活性。
(S)-度洛西汀的合成關鍵步驟為(S)構型手性醇中間體的獲得。目前對(S)構型手性醇中間體的獲得主要通過化學途徑，但存在諸多問題，如化學拆分需要使用大量的拆分劑，反應步驟長，能耗高以及廢物排放量大等；基于過渡金屬手性配體催化氫化體系，由于產品光學純度不高以及重金屬殘留等問題，導致其難以應用于醫藥中間體的生產。
[0004]與化學方法相比，生物催化過程具有高度的化學、區域和立體選擇性，反應條件溫和，后處理容易，能耗較低，是一種環境友好的合成方法，也是當今化工生產和相關領域發展一大潮流。其中生物催化不對稱還原已經發展成為全球各大醫藥公司研發部門的重要組成部分。然而，迄今為止的絕大部分研究集中于苯基酮為骨架的底物，而以雜芳環酮為骨架的底物研究較少見，其中與度洛西汀手性中間體合成相關的更是屈指可數(Wada M, et al.Biosci` Biotechnol Biochem, 2004, 68:1481-1488; Stiirmer R, etal., 2008, US0318288A1;Tang CG, et al.Biotechnol Lett, 2011，33:1435-1440)。其中，湯傳根等(Tang CG, et al.Biotechnol Lett, 2011，33:1435-1440) 2011 年報道了粘紅酵母菌(Rhodotorula sp.CY12)催化雜芳環酮為骨架的底物N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-度洛西汀關鍵醇中間體合成路線，該工藝以原始菌休止細胞為生物催化劑，48h內可轉化底物濃度為30g/l，為(S)-度洛西汀關鍵醇中間體提供了一種可選擇方法。為該底物篩選更多優良催化劑可進一步豐富生物催化工具箱，發掘更多有潛力的備用酶源。
【發明內容】
[0005]本發明公開了一種來源于金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49)的羰基還原酶ChKRED15及其基因，并提供了該酶異源表達體系的構建方法以及該酶作為生物催化劑用于制備度洛西汀手性中間體的方法。
[0006]羰基還原酶ChKRED15的基因的核苷酸序列(738bp)為SEQ ID N0.1所示。
[0007]羰基還原酶ChKRED15基因編碼的蛋白質(245aa)的氨基酸序列為SEQ ID N0.2所/Jn ο
[0008]羰基還原酶ChKRED15從金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因組中克隆獲得，該菌的保藏編號為CCTCC M2012484 (中國武漢，中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012 年 11 月 27 日)。
[0009]通過設計如下引物:正向:5'-GCG GAATTC ATG AAA ACA GTA TTA ATT ACA GGCGCC-3'(酶切位點:EcoR I );反向:5' -GCG AAGCTT CTA CCA CGG ACT GAT TCC GG-3'(酶切位點=Hind III)，以金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因組DNA為模板，經PCR擴增獲得目標基因，該基因編碼的蛋白質命名為羰基還原酶ChKRED 15。將目標基因連入pET28a(+)載體，并轉入E.coli BL21(DE3)，構建pET28a(+)-BL21異源表達體系。異源表達產物經純化后得到純酶。 [0010]根據現有公共知識，任何基因經操作或者改造后連入各類表達載體，轉化至合適宿主細胞，經適當條件誘導均能過量表達目的蛋白。因此，羰基還原酶ChKRED15表達的載體可以為PET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表達宿主可以為大腸桿菌，畢赤酵母，鏈霉菌等。
[0011]本發明還提供了羰基還原酶ChKRED15作為生物催化劑在轉化底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺中的應用。上述應用中，所述的催化條件可按本領域此類反應的常規條件進行選擇。羰基還原酶ChKRED15作催化劑時，反應體系為:羰基還原酶ChKRED15，磷酸鉀緩沖液或Tris-HCl緩沖液，NADH或NADPH，底物N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺(由于底物在水中的溶解度較低，因此先溶解于DMSO中配成40%的底物貯存液，再加入到反應體系中，w/v)。反應體系的酶濃度、NADH或NADPH量、底物濃度等可以調整。反應結束后，乙酸乙酯萃取終止反應，獲得產物。經驗證該酶能夠高選擇性(ee>99%)地催化N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的羰基不對稱還原。
[0012]可進行上述生物催化反應的包括羰基還原酶ChKRED15純酶、相應的重組菌休止細胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形態。采用羰基還原酶ChKRED15重組菌休止細胞作催化劑時，通常用輔酶循環底物代替輔酶進行反應，常用的輔酶循環底物為:葡萄糖和/或異丙醇。
[0013]根據現有的公共知識，任何基因通過DNA突變技術可以改變其序列，從而產生各種不同的突變體，這些突變體所表達的蛋白質往往具有相同的功能。本發明涉及基因及其產物也具有相同的特點。經等位基因突變或者經添加、插入、缺失或/和取代一個或多個氨基酸且編碼具有同等活性蛋白的氨基酸序列同樣能作為生物催化劑轉化底物N-甲基_3_氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成⑶-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
[0014]本發明涉及的羰基還原酶ChKRED15可高效轉化N-甲基_3_氧_3-(2_噻吩基)丙酰胺生成S-醇，為(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺生物催化合成提供了可供選擇的新型酶源。
[0015]羰基還原酶ChKRED15的潛力:該蛋白在大腸桿菌中過量表達后制成粗酶液，2U/HiL酶量便可在2h內轉化20g/L的底物，且轉化率為99%以上，ee值大于99.9%。粗酶液轉化工藝簡單，輔酶循環體系穩定，具有較大的工業應用前景。【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1羰基還原酶ChKRED15蛋白過量表達后的SDS-PAGE圖，M為marker，I:E.coli(pET28a)空載體，2:E.coli (pET28a_ChKRED15)全細胞，3:E.coli (pET28a_ChKRED15)細胞破碎后上清，4 =ChKRED15純化后。
【具體實施方式】
[0017]以下結合實施例詳細地說明本發明。實施方案為便于更好的理解本發明，但并非對本發明的限制。
[0018]實施例1羰基還原酶(ChKRED15)基因的擴增
[0019]根據金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49)全基因組測序信息,挖掘其中大量的羰基還原酶，其中一個具有催化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺功能的酶為本發明涉及的羰基還原酶ChKRED15，該基因獲取過程為常規的操作方法。設計如下引物:正向:5' -GCG GAATTC ATG AAA ACA GTATTA ATT ACA GGC GCC-3'(酶切位點:EcoR I );反向:5' -GCG AAGCTT CTA CCA CGG ACTGAT TCC GG-3'(酶切位點:Hind III)，以金黃桿菌CCTCC M2012484基因組DNA為模板，經PCR擴增獲得羰基還原酶ChKRED15基因。
[0020]PCR 程序為:95°C預變性 5min，94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，30 個循環，最后72°C延伸IOmin。
[0021 ] 將PCR產物以0.8%的瓊脂糖電泳后經瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段(天根生化科技北京有限公司)，而后以EcoR I /Hind III雙酶切后連接到具有相同酶切位點的pET28a(+)載體，得到重組質粒pET28a-ChKRED15，并送至上海生工生物工程公司測序。經測序，目標基因全長738bp,其`喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
[0022]將測序正確的質粒化學轉化至E.coli BL21 (DE3)感受態細胞，得重組子E.coli(pET28a-ChKRED15)。
[0023]實施例2羰基還原酶(ChKRED15)的誘導表達
[0024]挑取實施例1所構建的重組子E.coli (pET28a-ChKRED15)單克隆，接種于含50 μ g/mL卡那霉素的LB培養基中，于37°C，180rpm培養16h作為種子液，以1%接種率轉接至新鮮LB或者TB培養基中(500mL容量搖瓶裝液200mL培養基)，于37°C振蕩培養4h，隨后加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導羰基還原酶ChKRED15基因的表達，于30°C誘導36h后,4°C, 8000rpm冷凍離心IOmin收獲菌體。
[0025]菌體可作為生物催化劑或者用于蛋白純化。
[0026]實施例3羰基還原酶(ChKRED15)的分離純化
[0027]將實施例2中獲得的菌體以結合緩沖液(lOOmM，pH8.0磷酸鈉緩沖液，含300mMNaCl, 5mM咪唑)重懸后，經高壓均質機破碎，12000rpm離心15min，上清與經上述結合液平衡過的Ni親和層析樹脂孵育后，使用漂洗緩沖液(IOOmM, pH8.0磷酸鈉緩沖液，含300mMNaCl，IOmM咪唑)漂洗至基本無雜蛋白，隨后以洗脫緩沖液(lOOmM，pH8.0磷酸鈉緩沖液，含300mM NaCl, 250mM咪唑)洗脫并收集目的蛋白，電泳鑒定純度后合并目的蛋白并以透析緩沖液(lOOmM，pH8.0磷酸鉀緩沖液)透析48h,超濾濃縮后利用BCA Protein Assay kit測定蛋白濃度為8mg/mL,將酶液稀釋至終濃度為5mg/mL分裝,凍存于_80°C (羰基還原酶ChKRED15蛋白電泳圖見附圖1)。[0028]實施例4羰基還原酶(ChKRED15)的活性測定
[0029]將實施例3中分離純化得到的羰基還原酶ChKRED15純酶用于催化底物N-甲基-3-氧-3- (2-噻吩基)丙酰胺。
[0030]反應體系10mL，包括磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH8.0),純酶濃度0.lg/L，底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺lg/L，NADPHlOmM。30°C，轉速50rpm，轉化30min。反應結束后用一倍體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機層并用無水硫酸鈉干燥，氮吹儀氮吹后除去乙酸乙酯，所得殘余物用0.1mL異丙醇(HPLC級)充分溶解，取2μ I樣品，HPLC檢測轉化率和ee值(檢測方法見實施例5)。計算轉化率為66%，ee值>99.9% (S型)。以下實施例中產物均為S構型。
[0031]底物和產物數據如下:
[0032]
【權利要求】
1.一種羰基還原酶GKRED15的基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
2.一種羰基還原酶GKRED15，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
3.權利要求2所述的羰基還原酶GKRED15作為生物催化劑在轉化底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺中的應用。
【文檔編號】C12P17/00GK103740738SQ201410012492
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月12日 優先權日:2014年1月12日
【發明者】吳中柳, 任志強, 劉艷, 湯脫險, 裴小瓊 申請人:中國科學院成都生物研究所