核重新編程因子的制作方法

核重新編程因子的制作方法
【專利摘要】作為用于不利用胚和ES細胞而誘導分化細胞的重新編程，簡便且再現性強地建立具有與ES細胞同樣的多能性和增殖能力的誘導式多能性干細胞的方法，本發明提供了含有下述3種基因：Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產物的體細胞的核重新編程因子。
【專利說明】核重新編程因子
[0001]本申請是申請日為2006年12月06日、申請號為200680048227.7的同名申請的
分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及具有使分化的體細胞重新編程來誘導誘導式多能性干細胞的作用的核重新編程因子(nuclear reprogramming factor)。
【背景技術】
[0003]胚胎干細胞(ES細胞)是由人和小鼠的初期胚建立的干細胞，具有能長期進行培養并維持可以分化成存在于生物體中的所有類型細胞的多能性的特征。人們期待利用該性質將人ES細胞作為針對帕金森病、青少年糖尿病、白血病等多種疾病的細胞移植療法的來源。但是，存在著ES細胞的移植與臟器移植同樣會引起排斥反應這樣的問題。而且，對于通過破壞人胚胎建立的ES細胞的利用，出于倫理的觀點的反對意見也很多。如果能夠誘導患者自身的分化體細胞脫分化，建立具有接近于ES細胞的多能性和增殖能力的細胞(該細胞在本說明書中被稱為“誘導式多能性干細胞”(iPS細胞)，但也存在被稱為“胚胎干細胞樣細胞”或“ES樣細胞”的情況)的話，則預期能夠利用它們作為沒有排斥反應和倫理性問題的理想的多能性細胞。
[0004]作為使體細胞核重新編程的方法，已報道了，例如，從將體細胞的核移植到卵細胞中制備的克隆胚中 建立ES細胞的技術(ff.S.Hwang等，Science, 303，pp.1669-74，2004 ;ff.S.Hwang等,Science, 308, pp.1777-83，2005:但是，現已清楚了這些論文都是捏造的，而且已于日后撤下這些論文)。然而，這些技術只是為了建立ES細胞的目的而制備克隆胚，因此與使用不孕治療中產生的剩余胚的常規ES細胞相比，倫理的問題反而大。而且，現已報道了通過使體細胞與ES細胞相融合使體細胞核重新編程的技術(M.Tada等，Curr.Biol.，11, pp.1553-1558，2001 ;C.A.Cowan 等，Science, 309, pp.1369-73，2005)。但是，即使在該方法中也存在以下問題:無法解決由于導致最終使用人ES細胞而產生的倫理性問題。而且，現已報道了使生長于人中的生殖細胞腫瘤來源的細胞株的提取物和分化細胞反應而使細胞核重新編程的技術(C.K.Taranger 等，Mol.Biol.Cell, 16，pp.5719-35，2005)。該方法，提取物中何種成分誘導重新編程完全不清楚，因此在技術的可靠性和安全性上存在問題。
[0005]另一方面，提出了篩選具有使分化的體細胞重新編程來誘導誘導式多能性干細胞的作用的核重新編程因子的方法(國際公開W02005/80598)。該方法包括以下步驟:使含有在受ECAT (ES cellassociated transcript)基因(ES細胞中特異性表達的基因群:ES細胞相關轉錄物)的表達調節區域的表達調節位置上存在標記基因的基因的體細胞與被檢物質相接觸、研究標記基因表達細胞的出現的有無，選擇使該細胞出現的被檢物質作為體細胞的核重新編程因子的候選物。而且，該出版物的實施例6等中公開了使體細胞重新編程的方法。但是，上述出版物中沒有公開實際上鑒定核重新編程因子的報告。[0006]專利文獻I國際公開TO2005/80598
【發明內容】

[0007]本發明的課題在于提供核重新編程因子。更具體的是，本發明的課題在于提供用于不利用卵細胞、胚和ES細胞而誘導分化細胞的重新編程，簡便且再現性強地建立具有與ES細胞同樣的多能性和增殖能力的誘導式多能性干細胞的方法。
[0008]本
【發明者】為了解決上述的課題進行了積極的研究，使用國際公開W02005/80598中記載的核重新編程因子的篩選方法嘗試鑒定核重新編程因子。其結果是，發現了 24種候選作為與核重新編程相關的基因，確認了它們中的3種基因是核重新編程所必需的基因。本發明是基于上述發現而完成的。
[0009]也就是，根據本發明，提供了一種體細胞的核重新編程因子，其含有下述3種基因:Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產物。根據本發明的優選方式，提供了含有下述3種基因:0ct3/4、Klf4和c-Myc的各基因的產物的上述因子。
[0010]而且，根據其它的優選方式還提供了還含有下述基因:Sox家族基因的基因產物的上述因子，作為更優選的方式，提供了含有Sox2的基因產物的上述因子。
[0011]而且，如果根據其它的優選方式，提供了含有細胞因子，該細胞因子和Myc家族基因的基因產物共同存在、或代替Myc家族基因的基因產物。作為更優選方式，提供了細胞因子為堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和/或干細胞因子(SCF)的上述因子。
[0012]如果根據 特別優選的方式，提供了除Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、和Sox家族基因的各基因的產物之外，還含有TERT基因的基因產物的體細胞的核重新編程因子；以及除了 Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Sox家族基因，和TERT基因的各基因的產物之外，還含有從由下述的基因:SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7和Bmil構成的組中選出的一種以上的基因產物的因子。
[0013]除了這些因子，還提供了進一步含有選自于下組中的I種以上的基因的基因產物的上述的因子:Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll 和 β -連環素(catenin)。
[0014]而且，如果根據上述發明的其它優選方式，還提供了進一步含有選自于下組中的I種以上的基因的基因產物的上述的因子，所述組為:ECAT1、EsgU Dnmt3L、ECAT8、Gdf3,Soxl5、ECAT15-l、Fthll7、Sall4、Rexl、UTFl、Stella、Stat3和 Grb2。
[0015]從其它的觀點出發，本發明提供了通過體細胞的核重新編程制備誘導式多能性干細胞的方法，該方法包括使上述的核重新編程因子與體細胞接觸的步驟。
[0016]如果根據本發明的優選方式，提供了包括在體細胞的培養物中添加上述的核重新編程因子的步驟的上述方法；包括在體細胞中導入編碼上述的核重新編程因子的基因的步驟的上述方法；包括使用含有至少I種以上的編碼上述核重新編程因子的基因的重組載體將該基因導入體細胞中的步驟的上述方法；和使用從患者中采集的體細胞作為體細胞的上述方法。
[0017]再從其它的觀點出發，本發明提供了由上述方法獲得的誘導式多能性干細胞。而且，本發明還提供了誘導上述的誘導式多能性干細胞分化而得到的體細胞。
[0018]而且，根據本發明，還提供了一種干細胞療法，該方法包括將對誘導式多能性干細胞進行分化誘導而獲得的體細胞移植到該患者中的步驟，所述誘導式多能性干細胞是通過使用從患者中分離和采集的體細胞用上述方法獲得的。
[0019]而且，本發明還提供了使用對由上述方法獲得的誘導式多能性干細胞進行分化誘導而獲得的各種細胞來評價化合物、藥物、毒物等的生理作用和毒性的方法。
[0020]而且，本發明提供了一種改善細胞的分化能力和/或增殖能力的方法，該方法包括使上述的核重新編程因子與細胞接觸的步驟，以及提供了由上述方法獲得的細胞和對由上述方法獲得的細胞進行分化誘導而得到的體細胞。
[0021]通過使用由本發明提供的核重新編程因子，不利用胚和ES細胞就可以簡便且再現性強地誘導分化細胞核的重新編程，可以建立與ES細胞具有同樣的分化和多能性和增殖能力的未分化細胞-誘導式多能性干細胞。例如、使用本發明的核重新編程因子能夠由患者自身的體細胞制備具有高增殖能力和分化多能性的誘導式多能性干細胞，通過使該細胞分化而獲得的細胞(例如心肌細胞、胰島素產生細胞、或神經細胞等)可以應用于針對心力衰竭、胰島素依賴性糖尿病、帕金森病和脊髓損傷等多種疾病的干細胞移植療法中，由此可以回避使用人胚的倫理問題以及移植后的排斥反應，因此極為有用。而且，可以使誘導式多能性干細胞分化的各種細胞(例如心肌細胞、肝細胞等)，作為用于評價化合物、藥物、毒物等的藥效和毒性的系統極為有用。
附圖簡述
[0022]圖1是表示使用在Fbx15基因中敲入了 β geo的小鼠的胎兒成纖維細胞(MEF)的重新編程因子的篩選方法的圖。
[0023]圖2是表示通過導入表1中所示的24個基因而獲得的iPS細胞的形態的照片。還顯示了分化細胞(MEF)和正常的胚胎干細胞(ES)的形態作為對照。
[0024]圖3是表示iPS細胞中標記基因的表達的圖。顯示了以從iPS細胞、ES細胞和MEF細胞中提取的總RNA作為模板進行RT-PCR獲得的結果。
`[0025]圖4是表示iPS細胞中DNA甲基化狀態的圖。對從iPS細胞、ES細胞、和MEF細胞提取的基因組DNA進行亞硫酸鹽處理，對目的DNA進行PCR擴增后，插入于質粒。每個基因分離出10個克隆的質粒，測定序列。甲基化CpG用黑點表示，非甲基化CpG用白點表示。
[0026]圖5是表示通過24個基因的群、和從24個基因的群中每次除去I個基因后的23個基因的群的導入獲得的G418細胞的克隆數的圖。圖下側表示G418選擇后一周內獲得的集落數，圖上側表示3周內獲得的集落數。當除去用四方形圍起來的基因(基因的編號與表I所示的相同)時，完全沒有獲得集落，或是在3周后只發現少數集落。
[0027]圖6是表示通過10個基因的群、和從10個基因的群中每次除去I個基因后的9個基因的群的導入而獲得的G418細胞的集落數的圖。除了 #14、#15、或#20的各基因時一個集落都沒有獲得。當除去#22的基因時，獲得了少數的G418抗性集落，但是細胞呈現出分化的形態，其明顯與iPS細胞不同。
[0028]圖7是表示由10個基因的群、4個基因的群、3個基因的群、或2個基因的群產生的G418抗性集落(重新編程集落)的出現數的圖。顯示了各集落的代表性形態及大小。
[0029]圖8是表示對將MEF來源的iPS細胞移植到裸鼠皮下形成的腫瘤進行蘇木精一曙紅(H&E)染色的結果的照片。發現了三胚層系向各種組織的分化。
[0030]圖9是表示通過將成體皮膚成纖維細胞來源的iPS細胞移植到小鼠胚泡中，移植到假孕小鼠的子宮中制備的胎兒的照片。由上圖可知在左側的胎兒中來源于iPS細胞的細胞(發出綠色熒光)分布于全身。在下圖中清楚了同一胎兒的心臟、肝臟、脊髓的幾乎全部細胞為GFP陽性，其源于iPS細胞。
[0031]圖10是表示通過RT-PCR確認ES細胞標記基因的表達的結果的照片。圖中，Sox2minus表示在MEF中導入3個基因而建立的iPS細胞，4ECAT表示在MEF中導入4個基因而建立的iPS細胞，10ECAT表示在MEF中導入10個基因而建立的iPS細胞，10ECAT皮膚成纖維細胞表示在皮膚成纖維細胞中導入10個基因而建立的iPS細胞，ES細胞表示小鼠ES細胞，MEF表示沒有進行基因導入的MEF細胞。其下的編號表示克隆編號。
[0032]圖11是表示在由MEF建立iPS細胞中bFGF的效果的圖。在常規的飼養細胞(ST0細胞)(左)和導入了 bFGF表達載體的STO細胞(右)上培養的Fbxl50ge°/ege°小鼠來源的MEF中通過逆轉錄病毒導入4個因子(上部分)或c-Myc以外的3個因子(下部分)。2周內通過G418進行選擇，經晶體藍染色后，拍照。數字表示集落數。
[0033]圖12是對采用Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠的實驗進行說明的圖。A.分離在中心含有小鼠Nanog基因的大腸桿菌人工染色體(BAC)，在Nanog的編碼環形區域的上游通過重組插入EGFP-1RES-Puro盒。B.用改良的BAC制備轉基因小鼠。發現GFP的表達局限于胚泡的內細胞團塊和生殖腺中。
[0034]圖13是表示對使用Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠的實驗進行說明的圖。從Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠的胎兒(受精后13.5日)中除去頭部、內臟和生殖腺，建立MEF。用細胞分選器進行分析的結果是，即使在Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠來源的MEF (Nanog)中，與Fbxl50ge°/ ege。小鼠來源的MEF (Fbxl5)和野生型小鼠來源的MEF (Wild)同樣，幾乎不存在GFP陽性細胞。
[0035]圖14 是由 Nanog-EGFP-1RES-Puro 小鼠 MEF(左)和 Fbxl5ege°/fige。小鼠 MEF(右)建立的iPS細胞的照片。分別用嘌呤霉素和G418進行選擇。
[0036]圖15是表示iPS細胞的增殖的結果的圖。表示將ES細胞、Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠MEF (左)來源的iPS細胞(Nanog iPS)和Fbx150 geo/0 geo小鼠MEF來源的iPS細胞(FbxiPS)各10萬個分別接種于24孔板中，每3天進行一次傳代，測定細胞數的結果。數字表示加倍時間的平均。
[0037]圖16是表示iPS細胞的基因表達的圖。用RT-PCR分析標記基因在MEF、ES細胞、Nanog-EGFP-1RES-Puro 小鼠 MEF(左)來源的 iPS 細胞(Nanog iPS)和 Fbxl50geo/figeo 小鼠MEF來源的iPS細胞(Fbx iPS)中的表達。下面的數字表示傳代數。
[0038]圖17是表示由Nanog iPS細胞形成畸胎瘤的圖。顯示在裸鼠的背部皮下注射100萬個ES細胞或Nanog iPS細胞，3周后產生的腫瘤的外觀(左)和組織圖像(右:H&E染色)。
[0039]圖18是表示用Nanog iPS細胞制備嵌合體小鼠的圖。將Nanog iPS細胞(克隆NPMF4EK-24，傳代數6)移植于胚泡中，誕生出嵌合體小鼠。由90個移植胚誕生出4只嵌合體小鼠。
[0040]圖19是表示由Nanog iPS細胞出發的種系傳遞(germline transmission)的圖。對通過圖18所示的嵌合體小鼠與C57BL/6小鼠的交配所誕生的小鼠進行基因組DNA的PCR分析時，根據在所有的小鼠中存在0ct3/4和Klf4的轉基因，確認了種系傳遞。
[0041]圖20是表示由iPS細胞向神經細胞的分化誘導的圖。顯示由來源于皮膚成纖維細胞的iPS細胞在體外分化成的神經細胞(上:β III微管蛋白陽性)、寡突膠質細胞(左:04陽性)、星形膠質細胞(右:GFAP陽性)。
[0042]圖21是表示對不使用藥物選擇的iPS細胞的建立進行說明的圖。在每個IOcm皿中接種I萬至10萬個MEF，通過逆轉錄病毒導入4個因子。對照(Mock)中沒有產生集落(左)，而導入了 4個因子的皿中，除了扁平的轉化集落，還獲得了與膨脹的iPS細胞相類似的集落(中央)。一旦將這些細胞傳代培養，就獲得了與iPS細胞相類似的細胞(右)。
[0043]圖22是表示通過無藥物篩選建立的細胞的基因表達的圖。從圖21中所示的建立的細胞中提取RNA，用RT-PCR分析ES細胞標記基因的表達。
[0044]圖23是表示人成纖維細胞來源的iPS細胞樣細胞的圖。顯示了通過逆轉錄病毒將4個因子的人同源基因導入于人胎兒來源的成纖維細胞中而獲得的集落(左)、和2次傳代后的細胞(右)。
[0045]圖24是表示由人成體皮膚成纖維細胞建立iPS細胞的圖。通過逆轉錄病毒將左邊部分所示的因子導入到用慢病毒感染了小鼠逆轉錄病毒受體的人成體皮膚成纖維細胞中。照片表示病毒感染后第8天的相位差圖像(物鏡X 10)。
[0046]用于實施發明的最佳方式
[0047]本發明的核重新編程因子的特征在于含有下述3種基因:0ct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產物，在優選方式中，特征在于除了上述的3種基因之外還含有Sox家族基因的基因產物。
[0048]作為確認本發明的核重新編程因子的方法，可以利用例如、國際公開W02005/80598中記載的核重新編程因子的篩選方法。通過參照上述出版物的所有公開的內容，包含于本說明書的公開內容中。本領域人員參照上述出版物篩選核重新編程因子，可以確認本發明的重新編程因子的存在和作`用。
[0049]例如,可以利用Fbxl5基因座中敲入了 Pgeo ( β半乳糖苷酶和新霉素抗性基因的融合基因)的小鼠作為容易觀察重新編程現象的實驗系統。詳細內容示于本說明書的實施例中。小鼠Fbxl5基因是在ES細胞和早期胚等的分化多能性細胞中特異性表達的基因。在小鼠Fbxl5基因中敲入Pgeo的且缺失Fbxl5的功能的同源變異小鼠中，通常沒有觀察到包括分化多能性或發生在內的異常的表現型。在該小鼠中，Pgeo受到Fbxl5基因的增強子和啟動子的表達控制，Pgeo在分化的體細胞中不表達，顯示出對G418的敏感性。另一方面，敲入了 β geo的同源變異ES細胞顯示出對極高濃度(12mg/ml以上)的G418的抗性。利用該現象，可以構建使體細胞的重新編程可視化的實驗系統。
[0050]利用上述實驗系統，可以首先從敲入了 Pgeo的同源變異小鼠的胎兒(受精后13.5天)中分離成纖維細胞(Fbxl50ge°/ege°的MEF)。由于MEF不表達Fbxl5基因，因此也不表達β geo，表現出對G418的敏感性。可是，一旦該MEF與沒有進行基因操作的ES細胞(仍然呈現對G418的敏感性)相融合，MEF的核進行重新編程的結果是，表達β geo而形成G418抗性。因此，通過利用該實驗系統，可以置換成G418抗性使重新編程現象可視化。
[0051]可以使用上述的實驗系統選擇核重新編程因子。作為與核重新編程因子相關的基因的候選物，選擇出多個顯示出在ES細胞中特異性表達的基因和提示在ES細胞的分化多能性維持中起重要作用的基因，通過這些候選物單獨或適當組合可以確認是否引出核重新編程。例如，通過組合所有的選擇出的初次候選物，確認可以將分化細胞重新編程誘導至接近ES細胞的狀態后、制備從前述組合中每次除去I個基因的組合，確認同樣的作用，可以選擇該基因不存在時重新編程誘導能力減弱，或重新編程誘導能力喪失的二次候選物。對于這樣選擇出的二次候選物，通過重復同樣的步驟，可以選擇出必需的核重新編程基因的組合，可以確認Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的3種基因的基因產物的組合作為核重新編程因子起作用，除了這3種基因的基因產物，還可以確認Sox家族基因的基因產物的組合作為核重新編程因子具有極好的性質。核重新編程因子的選擇方法的具體例子具體示于本說明書的實施例中，本領域技術人員參照上述的一般的說明和實施例的具體性說明可以容易地確認這3種基因的組合誘導體細胞的重新編程，和這3種基因產物的組合對于核重新編程是必需的。
[0052]由本發明提供的核重新編程因子至少含有Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的基因產物的組合，包括例如0ct3/4、Klf4和c-Myc這3種基因的基因產物的組合。作為Oct家族基因，可以例舉例如0ct3/4、0ctlA和0ct6等。0ct3/4是屬于POU家族的轉錄因子，據報道其是未分化標記(K.0kamoto等，Cell, 60，pp461-72，1990)。而且，還有報告指出0ct3/4與多能性維持相關(J.Nichols等，Cell, 95，pp379_91，1998)。作為Klf家族基因，可以例舉 Klfl、Klf2、Klf4 和 Klf5 等。據報道 Klf4 (Kruppel like factor-4)是腫瘤抑制因子(A.M.Ghaleb等，Cell Res.，15，pp92_6，2005)。作為Myc家族基因，可以例舉c-Myc>N-Myc和L-Myc等。有報道指出c_Myc是與細胞的分化和增殖相關的轉錄控制因子(S.Adhikary, M.Eilers, Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，6，pp635_45, 2005)，且與多能性維持相關(P.Cartwright 等,Development, 132, pp885_96, 2005)。0ct3/4、Klf4 和 c-Myc 以外的各家族基因的NCBI登錄號如下所示。
[0053]表1
[0054]小鼠人
[0055]
【權利要求】
1.制備誘導式多能性干細胞的方法，其包括下述步驟(1) - (3): (I)從下面選擇基因的組合: (1)在胚胎干細胞表現出特異性或者聞表達的基因； (ii)編碼由fct信號或LIF信號激活的因子的基因； (iii)在胚胎干細胞的分化多能性維持中起重要作用的基因；和 (iv)上述基因的豕族基因； 其中，當將所述的基因的組合導入到體細胞的時候，該基因的組合造成內源性Oct3/4基因、Nanog基因在體細胞內的表達； (2)將步驟(1)中選擇的基因的組合導入到體細胞中，并且 (3)培養 步驟(2)獲得的細胞。
【文檔編號】C12N5/074GK103773804SQ201410006027
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2006年12月6日 優先權日:2005年12月13日
【發明者】山中伸彌 申請人:國立大學法人京都大學