一種重組大腸桿菌Pfu DNA聚合酶的微波輔助提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組大腸桿菌Pfu?DNA聚合酶的微波輔助提取方法，包括向重組表達Pfu?DNA聚合酶的大腸桿菌菌體細胞團中加入緩沖液和助提劑，使菌體細胞分散均勻；將所得混合液置于功率為200～1000W的微波場中進行提取，提取期間使混合液溫度保持在70～95℃的溫度范圍。本發明所述方法可在同一裝置內、一步完成細胞破壁及熱變性的過程，與傳統方法比較，減少了操作時間及提取步驟，減少了操作設備投資，而且微波輻射加熱能效較高，節能環保，反應過程可控，易于放大。
【專利說明】—種重組大腸桿菌Pfu DNA聚合酶的微波輔助提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及從重組工程菌中提取重組耐熱聚合酶的方法，具體地，涉及了一種從重組大腸桿菌微波輔助提取重組耐熱Pfu DNA聚合酶的方法。
【背景技術】
[0002]DNA聚合酶(DNA polymerase)，是細胞DNA復制的重要酶，主要應用在聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)中。DNA聚合酶主要分為六個類型:A、B、C、D、X、Y,通常所用的屬于B型聚合酶。Pfu DNA聚合酶是從Pyrococcus furiosis中提取的耐高溫DNA聚合酶，是保真性最好的聚合酶之一。[0003]最初使用的Pfu DNA聚合酶直接從菌體中分離純化，但難以得到大量的酶，后來的研究者將其基因重組到其它宿主細胞中得以表達，再經提取純化即可滿足應用要求。根據現有文獻所述，Pfu DNA聚合酶的提取一般需要兩個步驟，第一個步驟為破壁，將得到的重組菌體用超聲、溶菌酶等方法或者兩種方法結合來破碎細胞壁，此步驟需要冰浴低溫，防止酶變性失活。第二個步驟為熱變性，將破碎后的細胞或將破碎后的細胞離心取上清液置于75-800C的水浴中20-30min，利用聚合酶的耐熱性，去除其余大部分不耐熱雜質蛋白，減小后續純化分離的雜質干擾,這也是其它重組耐熱DNA聚合酶的常用的提取方法。Dabrowski等人(Dabrowski et al., Cloning and Expression in Escherichia coli of theRecombinant His-Tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcuswoesei, Protein expression and purification, 1998，14 (I): 131 - 138)提取重組 PfuDNA聚合酶時，將所得菌體超聲破碎，離心后上清液于75°C水浴30min，再次離心獲取上清液即為粗提液。吳海洪等(吳海洪等乳糖誘導Pfu DNA聚合酶基因的表達及酶的純化，科技通報，2008, 24(1):23-28)在菌體加入緩沖液、PMSF和溶菌酶，之后超聲波破碎。離心后上清液75°C水浴20min再次離心可得粗酶液。Kim等人(Kim et al., Crystal structureof Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus, InternationalJournal of Biological Macromolecules, 2008，42 (4): 356-361.)在菌體中加入 Tris-HCl緩沖液，置于冰上超聲，超聲后立即75°C加熱30min，在4°C離心即得粗酶液。從現有提取技術可看出，重組細胞破碎后需要再次轉移到新的儀器中進行熱變性，提取步驟較為繁瑣，而且超聲破碎處理量較小，規模化放大不易實現。
[0004]微波提取技術是近些年發展起來的一門新的提取技術，具有能耗低、操作時間短、溶劑耗量少、選擇性高、目標組分得率高等優點。微波提取是利用微波場將電能轉化為熱能，導致細胞內的極性物質尤其是水分子吸收微波能，產生大量的熱能，使細胞內溫度迅速上升，液態水汽化后產生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小的孔洞。進一步加熱，導致細胞內部和細胞壁的水分減少，細胞收縮，表面出現裂紋。孔洞或裂紋的存在使得胞外溶劑容易進入細胞內，溶解并釋放出胞內物質。利用微波這種較優越的破壁性能，主要從動植物細胞中提取多糖、脂類、酮類、色素、蛋白或一些其它特殊成份。近來也有研究利用微波從微生物細胞中提取一些成份，Yang等人(Yang et al., Microwave-assisted aciddigestion protocol for the determination of methionine and selenomethionine inselenium-enriched yeast by species specific isotope dilution GC-MS, AnalyticalMethods, 2013，5(2):525-529.)用 4M 甲基磺酸在 200W、165°C、20min 的微波提取條件下從富硒酵母較好的提取了蛋氨酸和硒代蛋氨酸。Jin等人(Jin et al., Enzyme-assistedextraction of lipids directly from the culture of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides, Bioresource Technology, 2012, 111:378-382.) 用圓紅冬孢酵母提取脂質時，使用微波預處理，條件為800W、60s、100°C，提取效果好。明紅梅等(明紅梅，方春玉等.MAE法在胞內紅曲色素提取中的應用.食品研究與開發，2010, 31 (8): 171-173.)用微波輔助提取技術從紅曲霉菌體內提取紅曲色素，優化了提取條件，表明70s、70°C、乙醇溶劑濃度45%、液固比20:1和600W的條件下能有較好的提取效果。但是由于微波輻射時產生熱量，使得大部分蛋白質變性失活，失去生理活性，所以很少用微波輻射來提取酶。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提出一種重組大腸桿菌Pfu DNA聚合酶的微波輔助提取方法。該方法可在同一裝置內、一步完成細胞破壁及熱變性的過程，與傳統方法比較，減少了操作時間及提取步驟，減少了操作設備投資，而且微波輻射加熱能效較高，節能環保，反應過程可控，易于放大。 [0006]為達此目的，本發明采用以下技術方案:
[0007]一種重組大腸桿菌Pfu DNA聚合酶的微波輔助提取方法，包括:
[0008](I)向重組表達Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌菌體細胞團中加入緩沖液和助提劑，使菌體細胞分散均勻；
[0009](2)將步驟(1)所得混合液置于功率為200~1000W的微波場中進行提取，提取期間使混合液溫度保持在70~95 °C的溫度范圍。
[0010]上述微波輔助提取方法中，重組Pfu DNA聚合酶的構建及表達培養過程參見文獻(Dabrowski et al., Cloning and Expression in Escherichia coli of theRecombinant His-Tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcuswoesei, Protein expression and purification, 1998, 14(1): 131 - 138.)，本領域技術人員能夠重組表達Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌均可用于本發明。培養結束后離心收集得到的濕菌體，即為本發明的提取對象，菌體含水量在75%~80%。
[0011]作為優選，步驟(1)中，按大腸桿菌菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為1: (10~40)、優選為1: (15~30)、進一步優選為1:(18~25)加入所述緩沖液。
[0012]在【具體實施方式】中，大腸桿菌菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比可以為I:12,1:15,1:18,1:20,1:23、1:25、1:27、1:30、1:32、1:35、1:38、1:40。
[0013]在本發明中，術語“濕菌體”是指離心除去培養基后的菌體。
[0014]在【具體實施方式】中，所述菌體干重的確定方法為:
[0015](i)稱取離心除去培養基后的菌體(即濕菌體)質量；
[0016](ii)將濕菌體置于80°C的烘箱干燥24h以上至恒重，稱取干燥后的菌體質量；
[0017](iii)將干燥前、后菌體質量的變化除以步驟(i)所稱濕菌體質量，即為濕菌體中水的百分含量，簡稱濕菌體的含水量；按此方法確定的濕菌體的含水量通常為75~80% ；
[0018]( iv)根據濕菌體的含水量，計算菌體的干重，即菌體干重=濕菌體X ( 100%-濕菌體的含水量)。
[0019]作為優選，步驟(1)所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。緩沖液的配比按本領域研究人員常用配比即可。
[0020]優選地，所述緩沖液的pH值為6.0~9.0，進一步優選為6.5~8.5，更進一步優選為7.0~8.0。
[0021]在【具體實施方式】中，所述緩沖液的pH值例如為6.2,6.4,6.5,6.6,6.8,7.0,7.1、
7.3、7.5、7.6、7.8、8.0、8.2、8.5、8.6、8.8。
[0022]優選地，所述緩沖液中的離子濃度為0.01~0.08mol ? L—1，優選為0.02~0.06mol ? L \ 進一步優選為 0.03 ~0.04mol ? L、[0023]在【具體實施方式】中，所述緩沖液中的離子濃度例如為0.02mol ? U\0.03mol ? L'0.04mol ? L \0.05mol ? L \0.06mol ? L \0.07mol ? L 1O
[0024]作為優選，步驟(1)所述助提劑為表面活性劑，例如為Triton X-100, Tween20、Tween80、SDS, Span、LAS、PEG、CPB或BAB ;進一步優選地，所述助提劑為非離子型表面活性劑，例如為 Triton X-100、Tween20 或 Tween80。
[0025]優選地，按g/mL計的質量體積百分比，所述助提劑的添加終濃度為0.2~1.5%，進一步優選為0.4~1.2%，更進一步優選為0.6~1.0%。
[0026]在【具體實施方式】中，按g/mL計的質量體積百分比，所述助提劑的添加終濃度例如為 0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%。
[0027]作為優選，步驟(2)所述微波場的頻率為2450MHz。
[0028]作為優選，，步驟(2)所述微波場的功率優選為300~800W，進一步優選為400~600W。
[0029]在【具體實施方式】中，步驟(2)所述微波場的功率例如為300W、400W、500W、600W、700W、800W、900W。
[0030]步驟(2)所述提取期間，通過開、關微波輻射使混合液溫度保持在70~95°C、優選為75~90°C、進一步優選為80~85°C的溫度范圍。溫度的選取以使其它雜質蛋白失活而不影響目標蛋白Pfu DNA聚合酶的活性為準。
[0031]在【具體實施方式】中，步驟(2)所述提取溫度例如為73°C、75°C、78°C、80°C、82°C、85°C、88°C、90°C、92°C、94°C。
[0032]作為優選，步驟(2)所述提取時間為5~30min，進一步優選為10~25min，更進一步優選為15~20min。
[0033]在【具體實施方式】中，步驟(2)所述提取時間例如為7min、9min、10min、12min、13min、15min、16min、18min、20min、22min、24min、25min、27min、28mino
[0034]作為優選，步驟(2)所述提取期間，保持攪拌所述混合液。
[0035]所述攪拌可以為本領域技術人員已知的任何攪拌方式，優選為磁力攪拌。
[0036]優選地,所述攪拌轉速為100~800rpm,進一步優選為200~600rpm,更進一步優選為300~400rpm ;在【具體實施方式】中，所述攪拌轉速例如為200rpm、300rpm、400rpm、500rpm、600rpm、700rpm。[0037]優選地，上述微波輔助提取方法還包括將步驟(2)所得提取液進行離心、取上清的步驟；進一步優選地，所述離心為在O~4°C、優選4°C，以8000~15000rpm、優選10000~12000rpm離心10~30分鐘；
[0038]在【具體實施方式】中，上述微波輔助提取方法具體包括如下步驟:
[0039](1)按大腸桿菌菌體干重與緩沖液的g/mL計的質量體積比為1: (10~40)、優選為1: (15~30)、進一步優選為1:(18~25)，向重組表達Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌菌體細胞團中加入緩沖液；再加入助提劑使其以g/ml計的質量體積百分濃度為0.2~1.5%、、優選為0.4~1.2%、進一步優選為0.6~1.0%，振蕩使菌體細胞分散均勻；
[0040]所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液；所述緩沖液的pH值為6.0~9.0，優選為6.5~8.5，進一步優選為7.0~8.0 ;所述緩沖液中的離子濃度為0.01~0.08mol ?Ι/1，優選為0.02~0.06mol .l-1，進一步優選為0.03~0.04mol.L 1 ；
[0041]所述助提劑為表面活性劑，優選為非離子型表面活性劑，進一步優選為TritonX-100、Tween20 或 Tween80 ；
[0042](2)在轉速為100~800rpm、優選200~600rpm、進一步優選300~400rpm的攪拌下，將步驟(1)所得混合液置于頻率為2450MHz，功率為200~1000W、優選為300~800W、進一步優選為400~600W的微波場中進行提取，提取期間通過開、關微波輻射使混合液溫度保持在70~95°C的溫度范圍、優選在80~85°C的溫度范圍內，提取時間為5~30min、優選為10~25min、進一步優選為15~20min ；
[0043](3)將步驟(2)所得提取液冰浴冷卻后，在O~4°C、優選4°C，以8000~15000rpm、優選10000~12000rpm離心10~30分鐘，即得含有Pfu DNA聚合酶的上清液。
[0044]與現有技術相比，本發明具有以下特點:
[0045](I)本發明可采用同一裝置完成破壁和熱變性，能夠減少操作步驟和時間，減少設備投入，降低成本，提高生產效率。
[0046](2)本發明采用微波輔助提取技術，微波破壁效果好，而且微波輻射加熱比普通加熱方式更高效節能。
[0047]( 3 )本發明中的微波提取裝置易放大，易實現自動化控制，有利于規模化應用。【具體實施方式】
[0048]下面結合【具體實施方式】來進一步說明本發明的技術方案。
[0049]實施例1
[0050]將重組Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌進行誘導、培養，獲得重組表達Pfu DNA聚合酶的菌體細胞，然后采用如下步驟:
[0051](1)根據已確定的濕菌體的含水量(75%)計算干重，按菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為1:10加入0.03mol.l-1磷酸鹽緩沖液(pH5.0)，然后，按g/mL計的質量體積百分比為0.2%的添加比例加入20 μ g Tween20振蕩均勻，直到底部沒有菌塊。
[0052](2)在混合液中加入磁性轉子，放入微波反應器中開始攪拌，轉速為500rpm。
[0053](3)選擇微波功率700W，開始微波輻射，提取溫度設定在80~95°C，當溫度達到80°C時,開始計時，繼續福射，當溫度達到95°C時停止福射，當溫度降到80°C時,繼續福射，直到溫度再次升到設定范圍上限時停止微波輻射，此過程維持5min。
[0054](4)反應結束后，停止攪拌，將混合液置于冰浴冷卻，4°C、1000Orpm離心15min取上清液即為粗酶液。
[0055]實施例2
[0056]將重組Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌進行誘導、培養，獲得重組表達Pfu DNA聚合酶的菌體細胞，然后采用如下步驟:
[0057](1)根據已確定的濕菌體的含水量(80%)計算干重，按菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為I:40加入0.05mol ? L-1 Tris-HCl緩沖液(pH9.0)，然后，按g/mL計的質量體積百分比為1.2%的添加比例加入480 u L SDS振蕩均勻，直到底部沒有菌塊。
[0058](2)在混合液中加入磁性轉子,放入微波反應器中開始攪拌,轉速為lOOrpm。
[0059](3)選擇微波功率200W，開始微波輻射，提取溫度設定在70~90°C，當溫度達到70°C時，開始計時，繼續輻射，當溫度達到90°C時停止輻射，當溫度降到70°C時，繼續輻射，直到溫度再次升到設定范圍上限時停止微波輻射，此過程維持30min。
[0060](4)反應結束后，停止攪拌，將混合液置于冰浴冷卻，4°C、1000Orpm離心15min取上清液即為粗酶液。
[0061]實施例3
[0062]將重組Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌進行誘導、培養，獲得重組表達Pfu DNA聚合酶的菌體細胞，然后采用如下步驟:
[0063](1)根據已確定的濕菌體的含水量(78%)計算干重，按菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為I:20加入0.02mol ? L-1Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，然后，按g/mL計的質量體積百分比為1.0%的添加比例加入200 ii L Triton X-100振蕩均勻，直到底部沒有菌塊。
[0064](2)在混合液中加入磁性轉子,放入微波反應器中開始攪拌,轉速為300rpm。
[0065](3)選擇微波功率500W，開始微波輻射，提取溫度設定在75~90°C，當溫度達到75°C時，開始計時，繼續輻射，當溫度達到90°C時停止輻射，當溫度降到75°C時，繼續輻射，直到溫度再次升到設定范圍上限時停止微波輻射，此過程維持25min。
[0066](4)反應結束后，停止攪拌，將混合液置于冰浴冷卻，4°C、12000rpm離心15min取上清液即為粗酶液。
[0067]實施例4
[0068]將重組Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌進行誘導、培養，獲得重組表達Pfu DNA聚合酶的菌體細胞，然后采用如下步驟:
[0069](1)根據已確定的濕菌體的含水量(75%)計算干重，按菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為1:30加入0.01mol ? L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH7.0)，然后，按g/mL計的質量體積百分比為0.8%的添加比例加入240 u L BAB振蕩均勻，直到底部沒有菌塊。
[0070](2)在混合液中加入磁性轉子,放入微波反應器中開始攪拌,轉速為400rpm。
[0071](3)選擇微波功率600W，開始微波輻射，提取溫度設定在80~95°C，當溫度達到80°C時,開始計時，繼續福射，當溫度達到95°C時停止福射，當溫度降到80°C時,繼續福射，直到溫度再次升到設定范圍上限時停止微波輻射，此過程維持15min。
[0072](4)反應結束后，停止攪拌，將混合液置于冰浴冷卻，4°C、15000rpm離心12min取上清液即為粗酶液。
[0073]實施例5
[0074]將重組Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌進行誘導、培養，獲得重組表達Pfu DNA聚合酶的菌體細胞，然后采用如下步驟:
[0075](I)根據已確定的濕菌體的含水量(76%)計算干重，按菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為1:25加入0.08mol ? L—1醋酸鹽緩沖液(pH6.0)，然后，按g/mL計的質量體積百分比為1.5%的添加比例加入375 u L Tween80振蕩均勻，直到底部沒有菌塊。
[0076](2)在混合液中加入磁性轉子,放入微波反應器中開始攪拌,轉速為800rpm。
[0077](3)選擇微波功率1000W，開始微波輻射，提取溫度設定在90~95°C，當溫度達到90°C時，開始計時，繼續福射，當溫度達到95°C時停止福射，當溫度降到90°C時,繼續福射，直到溫度再次升到設定范圍上限時停止微波輻射，此過程維持5min。
[0078](4)反應結束后，停止攪拌，將混合液置于冰浴冷卻，4°C、8000rpm離心30min取上清液即為粗酶液。
[0079]取上清液即為粗酶液。
[0080]實施例6
[0081]將重組Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌進行誘導、培養，獲得重組表達Pfu DNA聚合酶的菌體細胞，然后采用如下步驟:`[0082](I)根據已確定的濕菌體的含水量(77%)計算干重，按菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為1:35加入0.04mol ? L—1磷酸鹽緩沖液(pH7.3)，然后，按g/mL計的質量體積百分比為0.4%的添加比例加入140 u L Span振蕩均勻，直到底部沒有菌塊。
[0083](2)在混合液中加入磁性轉子，放入微波反應器中開始攪拌，轉速為200rpm。
[0084](3)選擇微波功率300W，開始微波輻射，提取溫度設定在75~85°C，當溫度達到75°C時，開始計時，繼續輻射，當溫度達到85°C時停止輻射，當溫度降到75°C時，繼續輻射，直到溫度再次升到設定范圍上限時停止微波輻射，此過程維持24min。
[0085](4)反應結束后，停止攪拌，將混合液置于冰浴冷卻，4°C、15000rpm離心IOmin取上清液即為粗酶液。
[0086]取上清液即為粗酶液。
[0087]實施例7
[0088]將重組Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌進行誘導、培養，獲得重組表達Pfu DNA聚合酶的菌體細胞，然后采用如下步驟:
[0089](I)根據已確定的濕菌體的含水量(79%)計算干重，按菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為1:18加入0.07mol ? L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH8.2)，然后，按g/mL計的質量體積百分比為0.5%的添加比例加入90 ii L PEG振蕩均勻，直到底部沒有菌塊。
[0090](2)在混合液中加入磁性轉子,放入微波反應器中開始攪拌,轉速為700rpm。
[0091](3)選擇微波功率400W，開始微波輻射，提取溫度設定在78~88°C，當溫度達到78°C時，開始計時，繼續輻射，當溫度達到88°C時停止輻射，當溫度降到78°C時，繼續輻射，直到溫度再次升到設定范圍上限時停止微波輻射，此過程維持18min。
[0092](4)反應結束后，停止攪拌，將混合液置于冰浴冷卻，4°C、12000rpm離心20min取上清液即為粗酶液。[0093]取上清液即為粗酶液。
[0094]實施例8
[0095]將重組Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌進行誘導、培養，獲得重組表達Pfu DNA聚合酶的菌體細胞，然后采用如下步驟:
[0096](I)根據已確定的濕菌體的含水量(76%)計算干重，按菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為1:32加入0.06mol.L-1醋酸鹽緩沖液(pH7.6)，然后，按g/mL計的質量體積百分比為0.9%的添加比例加入288 μ L CPB振蕩均勻，直到底部沒有菌塊。
[0097](2)在混合液中加入磁性轉子,放入微波反應器中開始攪拌,轉速為600rpm。
[0098](3)選擇微波功率800W，開始微波輻射，提取溫度設定在82~92°C，當溫度達到82°C時，開始計時，繼續輻射，當溫度達到92°C時停止輻射，當溫度降到82°C時，繼續輻射，直到溫度再次升到設定范圍上限時停止微波輻射，此過程維持13min。
[0099](4)反應結束后，停止攪拌，將混合液置于冰浴冷卻，4°C、1000Orpm離心20min取上清液即為粗酶液。
[0100] 申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的技術方案，但本發明并不局限于上述實施例，即不意味著本發明必須依賴上述實施例的技術條件才能實施。所屬【技術領域】的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
【權利要求】
1.一種重組大腸桿菌PfU DNA聚合酶的微波輔助提取方法，其特征在于，包括: (1)向重組表達PfuDNA聚合酶的大腸桿菌菌體細胞團中加入緩沖液和助提劑，使菌體細胞分散均勻； (2)將步驟(1)所得混合液置于功率為200~1000W的微波場中進行提取，提取期間使混合液溫度保持在70~95 °C的溫度范圍。
2.根據權利要求1所述的微波輔助提取方法，其特征在于，步驟(1)中，按大腸桿菌菌體干重與緩沖液的g/mL計的重量體積比為1:(10~40)、優選為1: (15~30)、進一步優選為1: (18~25)加入所述緩沖液。
3.根據權利要求1或2所述的微波輔助提取方法，其特征在于，步驟(1)所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液； 優選地，所述緩沖液的pH值為6.0~9.0，進一步優選為6.5~8.5，更進一步優選為7.0 ~8.0 ; 優選地，所述緩沖液中的離子濃度為0.01~0.08mol ? L'進一步優選為0.02~0.06mol ? L'更進一步優選為 0.03 ~0.04mol ? L4。
4.根據權利要求1-3任一項所述的微波輔助提取方法，其特征在于，步驟(1)所述助提劑為表面活性劑，優選為 Triton X-100、Tween20、Tween80、SDS, Span、LAS、PEG、CPB 或BAB ； 優選地，所述助提劑為非離子型表面活性劑，進一步優選為Triton X-100、Tween20或Tween80 ； 優選地，按g/mL計的質量體積百分比，所述助提劑的添加終濃度為0.2~1.5%，進一步優選為0.4~1.2%，更進一步優選為0.6~1.0%。
5.根據權利要求1-4任一項所述的微波輔助提取方法，其特征在于，步驟(2)所述微波場的頻率為2450MHz ； 優選地，所述微波場的功率為300~800W，進一步優選為400~600W。
6.根據權利要求1-5任一項所述的微波輔助提取方法，其特征在于，步驟(2)所述提取期間，通過開、關微波輻射使混合液溫度保持在70~95°C、優選為75~90°C、進一步優選為80~85 °C的溫度范圍。
7.根據權利要求1-6任一項所述的微波輔助提取方法，其特征在于，步驟(2)所述提取時間為5~30min，優選為10~25min，進一步優選為15~20min。
8.根據權利要求1-7任一項所述的微波輔助提取方法，其特征在于，步驟(2)所述提取期間，保持攪拌所述混合液； 優選地，所述攪拌為磁力攪拌； 優選地，所述攪拌轉速為100~800rpm,進一步優選為200~600rpm,更進一步優選為300 ~400rpm。
9.根據權利要求1-8任一項所述的微波輔助提取方法，其特征在于，還包括將步驟(2)所得提取液進行離心、取上清的步驟； 優選地,所述離心為在0~4°C、優選4°C，以8000~15000rpm、優選10000~12000rpm的轉速離心10~30分鐘。?
10.根據權利要求1-9任一項所述的微波輔助提取方法，其特征在于，包括如下步驟:(1)按大腸桿菌菌體干重與緩沖液的g/mL計的質量體積比為1:(10~40)、優選為1:(15~30)、進一步優選為1:(18~25)，向重組表達Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌菌體細胞團中加入緩沖液；再加入助提劑使其以g/mL計的質量體積百分濃度為0.2~1.5%、優選為.0.4~1.2%、進一步優選為0.6~1.0%，振蕩使菌體細胞分散均勻； 所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液；所述緩沖液的PH值為6.0~9.0，優選為6.5~8.5，進一步優選為7.0~8.0 ;所述緩沖液中的離子濃度為0.01~0.08mol ?Ι/1，優選為0.02~0.06mol ?Ι/1，進一步優選為0.03~.0.04mol.L 1 ； 所述助提劑為表面活性劑，優選為非離子型表面活性劑，進一步優選為Triton X-100、Tween20 或 Tween80 ； (2)在轉速為100~800rpm、優選200~600rpm、進一步優選300~400rpm的攪拌下，將步驟(1)所得混合液置于頻率為2450MHz、功率為200~1000W、優選為300~800W、進一步優選為400~600W的微波場中進行提取，提取期間通過開、關微波輻射使混合液溫度保持在70~95°C的溫度范圍、優選在80~85°C的溫度范圍內，提取時間為5~30min、優選為10~25min、進一步優選為15~20min ； (3)將步驟(2)所得提取液冰浴冷卻后，在O~4°C、優選4°C，以8000~15000rpm、優選10000~12000rpm的轉速離心10~30分鐘，即得含有Pfu DNA聚合酶的上清液。
【文檔編號】C12N9/12GK103740671SQ201410001371
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】劉春朝, 胡建華, 王 鋒 申請人:中國科學院過程工程研究所