目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了即使減少檢測(cè)探針的使用量,也不降低檢測(cè)靈敏度(S/N比),能夠高靈敏度地檢測(cè)目標(biāo)核酸的目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法。通過(guò)使用與目標(biāo)核酸雜交的檢測(cè)探針以及固定于支持體的捕捉探針的夾心雜交法來(lái)進(jìn)行的目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法中,檢測(cè)探針和/或捕捉探針的核酸分子中的至少一個(gè)核酸堿基被替換為光反應(yīng)性基團(tuán),具有對(duì)目標(biāo)核酸與檢測(cè)探針和/或捕捉探針雜交而形成的復(fù)合體進(jìn)行光照射,從而在光反應(yīng)性基團(tuán)與目標(biāo)核酸中的核酸堿基之間形成共價(jià)鍵的工序。
【專利說(shuō)明】目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用夾心雜交法的目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 各種生物的遺傳信息分析的研究已經(jīng)開(kāi)始,關(guān)于以人類基因?yàn)槭椎拇罅炕蚣捌?堿基序列、還有由基因序列所編碼的蛋白質(zhì)和由這些蛋白質(zhì)二次加工成的糖鏈的信息正在 迅速被闡明。對(duì)于序列被闡明的基因、蛋白質(zhì)、糖鏈等高分子體的功能,可以通過(guò)各種方法 來(lái)調(diào)查。作為主要的方法,對(duì)于核酸,可以利用RNA印跡(northernbloting)、或者DNA印 跡(southernbloting)這樣的各種核酸/核酸間的互補(bǔ)性來(lái)調(diào)查各種基因與其生物體功 能表達(dá)的關(guān)系。對(duì)于蛋白質(zhì),可以利用以蛋白質(zhì)印跡(westernbloting)為代表的蛋白質(zhì) /蛋白質(zhì)間的反應(yīng)來(lái)調(diào)查蛋白質(zhì)的功能和表達(dá)。
[0003] 作為核酸檢測(cè)方法之一,已知夾心雜交法。夾心雜交法使用被固定于過(guò)濾器上的 捕捉探針。捕捉探針與目標(biāo)核酸的第1部分互補(bǔ)。在一個(gè)階段中,使結(jié)合于過(guò)濾器的捕捉 探針暴露于應(yīng)對(duì)于目標(biāo)核酸序列進(jìn)行調(diào)查的樣品,進(jìn)一步暴露于與目標(biāo)核酸的第2部分互 補(bǔ)的帶有標(biāo)記的檢測(cè)探針,但前述的第2部分與第1探針?biāo)パa(bǔ)的目標(biāo)部分不同(S卩,與它 們不重復(fù))(專利文獻(xiàn)1、2、非專利文獻(xiàn)1)。該方法消除了在過(guò)濾器上固定化樣品所需的工 夫,另外可以選擇第1探針使其適合支持體。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005] 專利文獻(xiàn)
[0006] 專利文獻(xiàn)1 :美國(guó)專利第4, 486, 539號(hào)
[0007] 專利文獻(xiàn)2 :日本特開(kāi)平7-75600號(hào)公報(bào)
[0008] 非專利文獻(xiàn)
[0009] 非專利文獻(xiàn)I:Sinikka Parkkinen et al.,Journal of Medical Virology20:279-288 (1986)
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010] 發(fā)明要解決的課題
[0011]目前,在捕捉探針固定化支持體上使用夾心雜交法來(lái)檢測(cè)目標(biāo)核酸時(shí),為了提高 檢測(cè)靈敏度,必須使用相對(duì)于目標(biāo)核酸量為過(guò)量的檢測(cè)探針。例如,根據(jù)文獻(xiàn)(日本特開(kāi) 2001-69997號(hào)公報(bào)),相對(duì)于目標(biāo)核酸量,需要25萬(wàn)倍當(dāng)量的檢測(cè)探針。但是,如果使用過(guò) 量的檢測(cè)探針,則剩余的檢測(cè)探針與用于捕捉其他目標(biāo)核酸的捕捉探針交叉雜交(非特異 性吸附),其結(jié)果存在檢測(cè)靈敏度(S/N比)降低這樣的課題。
[0012] 本發(fā)明的目的是提供即使減小檢測(cè)探針的使用量,也不降低檢測(cè)靈敏度(S/N 比),能夠高靈敏度地檢測(cè)目標(biāo)核酸的目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法。
[0013] 用于解決課題的方法
[0014] 本申請(qǐng)
【發(fā)明者】們進(jìn)行深入研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn),在夾心雜交法中,通過(guò)在目標(biāo)核酸與 檢測(cè)探針和/或捕捉探針雜交而形成的復(fù)合體中,在檢測(cè)探針和/或捕捉探針中替換了核 酸堿基的光反應(yīng)性基團(tuán)與目標(biāo)核酸中的核酸堿基之間通過(guò)光照射而形成共價(jià)鍵,從而不使 用過(guò)量的檢測(cè)探針也能夠高靈敏度地檢測(cè)目標(biāo)核酸,于是完成了本發(fā)明。
[0015] 即,本發(fā)明提供以下(1)?(4)。
[0016] (1)目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法,是通過(guò)夾心雜交法來(lái)檢測(cè)目標(biāo)核酸的方法,所述夾心雜 交法使用與目標(biāo)核酸雜交的檢測(cè)探針以及固定于支持體的捕捉探針,
[0017] 檢測(cè)探針和/或捕捉探針的核酸分子中的至少一個(gè)核酸堿基被替換為光反應(yīng)性 基團(tuán),
[0018] 該檢測(cè)方法具有對(duì)目標(biāo)核酸與檢測(cè)探針和/或捕捉探針雜交而形成的復(fù)合體進(jìn) 行光照射,從而在光反應(yīng)性基團(tuán)與目標(biāo)核酸中的核酸堿基之間形成共價(jià)鍵的工序。
[0019] (2)根據(jù)(1)所述的檢測(cè)方法,檢測(cè)探針的核酸分子中的至少一個(gè)核酸堿基被替 換為光反應(yīng)性基團(tuán)。
[0020] (3)根據(jù)(2)所述的檢測(cè)方法,捕捉探針的核酸分子中的至少一個(gè)核酸堿基被替 換為光反應(yīng)性基團(tuán)。
[0021] (4)根據(jù)(1)?(3)的任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法,光反應(yīng)性基團(tuán)是選自3-氰基乙烯 基咔唑基、對(duì)氨基甲酰基乙烯基苯酚基、4, 5',8-三甲基補(bǔ)骨脂素基以及N3-甲基-5-氰基 乙烯基尿嘧啶基中的至少1種。
[0022] 發(fā)明的效果
[0023] 根據(jù)本發(fā)明,能夠降低使用的檢測(cè)探針的量,因而能夠抑制與捕捉探針的交叉雜 交(非特異性吸附)。其結(jié)果能夠提高檢測(cè)靈敏度(S/N比),所以能夠高靈敏度地檢測(cè)微 量的目標(biāo)核酸。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 作為供于本發(fā)明的檢測(cè)方法的目標(biāo)核酸,可列舉例如,病原菌和/或病毒等的基 因、遺傳病的病原基因等及其一部分等,但不限于這些。另外,作為包含這些目標(biāo)核酸的樣 本,可列舉血液、血清、血漿、尿、糞便、腦脊液、唾液、粘液、各種組織液等體液、和/或各種 組織、石蠟包埋樣本(FFPE)及其切片、各種飲食物以及它們的稀釋物等,但不限于這些。另 夕卜,成為被檢物質(zhì)的目標(biāo)核酸可以是從血液和/或細(xì)胞通過(guò)常規(guī)方法提取的樣本核酸,也 可以使用從樣本提取的DNA和/或RNA等。作為DNA,可以使用染色體DNA、病毒DNA、細(xì)菌、 霉等的DNA、將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄而得的cDNA、作為它們的一部分的片段等,但不限于這些。作 為RNA,可以使用信使RNA、核糖體RNA、小RNA(smallRNA)和/或作為它們的一部分的片段 等,但不限于這些。另外,化學(xué)合成的DNA或者RNA等也可以作為目標(biāo)核酸使用。
[0025] 所述樣本核酸有時(shí)還包含除了作為測(cè)定對(duì)象的目標(biāo)核酸以外的核酸成分(非目 標(biāo)核酸)。這些非目標(biāo)核酸既可以考慮與目標(biāo)核酸的性狀的差而除去,也可以不除去地作為 被檢物質(zhì)使用。
[0026] 目標(biāo)核酸也可以是以該目標(biāo)核酸作為模板通過(guò)PCR等核酸擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增而得 的,這種情況下,可以大幅提高測(cè)定靈敏度。在以核酸擴(kuò)增產(chǎn)物作為目標(biāo)核酸的情況下, 通過(guò)在用熒光物質(zhì)等進(jìn)行了標(biāo)記的核苷三磷酸的存在下進(jìn)行擴(kuò)增,可以將擴(kuò)增核酸進(jìn)行標(biāo) 記。
[0027] 本發(fā)明的方法可以在區(qū)別目標(biāo)核酸的有無(wú)、病毒的基因型、細(xì)菌的種和株、霉的種 和株等的檢測(cè)、SNP(單堿基多態(tài)性)的檢測(cè)、信使RNA的檢測(cè)、miRNA的檢測(cè)、CGH、拷貝數(shù) 變化、基因組DNA序列的缺失?重復(fù)?融合、或者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的缺失?重復(fù)?融合的檢測(cè)中使 用。另外,通過(guò)測(cè)定來(lái)自檢測(cè)探針的信號(hào)強(qiáng)度,還可以應(yīng)用于目標(biāo)核酸的定量。此外,如果 進(jìn)行目標(biāo)核酸的定量,則必然要進(jìn)行目標(biāo)核酸的檢測(cè),因此本發(fā)明的"檢測(cè)方法"也包含伴 隨定量的情況。
[0028] 本發(fā)明的方法中可以直接應(yīng)用目標(biāo)核酸,也可以應(yīng)用目標(biāo)核酸的片段化處理物。 對(duì)于目標(biāo)核酸的長(zhǎng)度,只要捕捉探針、檢測(cè)探針能雜交就不特別限制,在目標(biāo)核酸較長(zhǎng)的情 況(1500個(gè)堿基以上、特別是4000個(gè)堿基以上的情況)下,優(yōu)選應(yīng)用通過(guò)片段化處理而片 段化成如后述那樣適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度而得的片段化處理物。片段化處理物不需要從產(chǎn)生的核酸片 段中選擇特定的核酸片段,可以將片段化處理物直接供于本發(fā)明的方法,從而可以提高檢 測(cè)靈敏度。
[0029] 作為為了片段化而將目標(biāo)核酸切斷的方法,可以使用照射超聲波而切斷的方法、 用酶切斷的方法、用限制性酶切斷的方法、使用霧化器的方法、用酸和/或堿切斷的方法 等。在用超聲波切斷的方法的情況下,可以通過(guò)控制照射于目標(biāo)核酸的超聲波的輸出強(qiáng)度 和照射時(shí)間來(lái)切斷成所期望的長(zhǎng)度。
[0030] 支持體可以使用載玻片、膜、珠等。對(duì)支持體的材質(zhì)不特別限定,可列舉玻璃、陶 瓷、硅等無(wú)機(jī)材料、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、醋酸纖維素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯 酸甲酯、硅膠等聚合物等。通過(guò)使用將多種捕捉探針固定于支持體上而成的微陣列,能夠同 時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)核酸。
[0031] 本發(fā)明的目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法優(yōu)選應(yīng)用夾心雜交法。在夾心雜交法中,使用固定 于支持體的捕捉探針、以及檢測(cè)探針。捕捉探針、檢測(cè)探針是通常分別具有與目標(biāo)核酸的不 同部分互補(bǔ)的堿基序列,能與目標(biāo)核酸雜交而選擇性地結(jié)合的物質(zhì)。目標(biāo)核酸與檢測(cè)探針 和/或捕捉探針雜交,形成復(fù)合體。通過(guò)檢測(cè)(測(cè)定)與該復(fù)合體中的檢測(cè)探針結(jié)合的標(biāo) 記體,能夠檢測(cè)目標(biāo)核酸。
[0032] 在本發(fā)明中,作為捕捉探針,具體可以使用DNA、RNA、PNA(肽核酸)、LNA(鎖核酸, LockedNucleicAcid)等的核酸衍生物。這里衍生物在核酸的情況下,是指利用突光基團(tuán) 等形成的標(biāo)識(shí)化衍生物、包含修飾核苷酸(例如受到了包含鹵素、甲基等烷基、甲氧基等烷 氧基、硫代、竣甲基等基團(tuán)的核昔酸和喊基的再構(gòu)成、雙鍵的飽和、脫氣基化、氧分子向硫分 子的替換等的核苷酸等)的衍生物等化學(xué)修飾衍生物。
[0033] 具有特定堿基序列的單鏈核酸,與具有與該堿基序列或其一部分互補(bǔ)的堿基序列 的單鏈核酸選擇性地雜交而結(jié)合,因此相當(dāng)于本發(fā)明中所說(shuō)的捕捉探針。本發(fā)明中使用捕 捉探針可以是市售的,另外,也可以是從活細(xì)胞等得到的。作為捕捉探針,特別優(yōu)選的是核 酸。該核酸中,被稱為寡核酸的長(zhǎng)度為200個(gè)堿基以下的核酸可以用合成儀容易地人工合 成。
[0034]捕捉探針可以含有與目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)的序列,也可以選擇任何區(qū)域。優(yōu)選與以 下所述的檢測(cè)探針的序列不重復(fù)。另外,還可以使用與目標(biāo)核酸的不同區(qū)域雜交的多種捕 捉探針。
[0035]在目標(biāo)核酸是雙鏈DNA或雙鏈RNA的情況下,可以選擇與正義鏈、反義鏈的任一鏈 互補(bǔ)的序列作為捕捉探針。這種情況下,以下所述的檢測(cè)探針與捕捉探針優(yōu)選選擇同一鏈 的序列。
[0036] 在將樣本核酸所含的不同目標(biāo)核酸進(jìn)行區(qū)別檢測(cè)的情況下,例如,將感染患者的 病毒的型進(jìn)行區(qū)別檢測(cè)等,優(yōu)選從樣本核酸所能包含的核酸序列中選擇特異性高的序列區(qū) 域。即,是指,選作捕捉探針的序列,在樣本核酸所含的全部序列中,在除了該區(qū)域以外不存 在同源性高的序列。
[0037] 本發(fā)明中使用的檢測(cè)探針、捕捉探針中的任一核酸分子中的至少一個(gè)核酸堿基被 替換為光反應(yīng)性基團(tuán),或者檢測(cè)探針、捕捉探針兩者的核酸分子中的各有至少一個(gè)核酸堿 基被替換為光反應(yīng)性基團(tuán)。
[0038] 這里,光反應(yīng)性基團(tuán)是通過(guò)特定波長(zhǎng)的光照射而有機(jī)合成反應(yīng)中的反應(yīng)性被激活 的有機(jī)基團(tuán)(光反應(yīng)性部位)。探針中的核酸堿基被替換為光反應(yīng)性基團(tuán)后的探針,能夠與 替換前的核酸堿基同樣地與目標(biāo)核酸雜交而形成復(fù)合體。對(duì)核酸堿基被替換為光反應(yīng)性基 團(tuán)后的捕捉探針和/或檢測(cè)探針與目標(biāo)核酸雜交而形成的復(fù)合體照射能激活該光反應(yīng)性 基團(tuán)的光反應(yīng)性部位的波長(zhǎng)的光,則該光反應(yīng)性部位被激活,在該光反應(yīng)性基團(tuán)與目標(biāo)核 酸中的核酸堿基之間形成共價(jià)鍵。
[0039] 作為這樣的光反應(yīng)性基團(tuán),可列舉3_氰基乙烯基咔唑基及其衍生物 (W02009/066447(EP2216338,US2010-274000A),YoshinagaYoshimuraetal. ,Organic Letters10:3227-3230(2008))、對(duì)氨基甲酰基乙烯基苯酚基(TakehiroAmiet al. ,Organic&BiomolecularChemistry5:2583-2586 (2007))、4, 5',8-三甲基補(bǔ)骨脂素基 (AkioKoborietal·,ChemistryLetters38:272-273(2009))以及N3-甲基 _5_ 氰基 乙烯基尿啼陡基(KenzoFujimotoetal·,ChemicalCommunications:3177_3179(2005) 等。這些文獻(xiàn)通過(guò)參照而被引入本說(shuō)明書中。其中,優(yōu)選3-氰基乙烯基咔唑基及其衍生物 (W02009/066447),特別優(yōu)選3-氰基乙烯基咔唑基。
[0040] 這里,3-氰基乙烯基咔唑基及其衍生物如W02009/066447所記載的那樣,是下述 式⑴所示的基團(tuán)。
[0041]
【權(quán)利要求】
1. 目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法,是通過(guò)夾心雜交法來(lái)檢測(cè)目標(biāo)核酸的方法,所述夾心雜交法 使用與目標(biāo)核酸雜交的檢測(cè)探針以及固定于支持體的捕捉探針, 檢測(cè)探針和/或捕捉探針的核酸分子中的至少一個(gè)核酸堿基被替換為光反應(yīng)性基團(tuán), 該檢測(cè)方法具有對(duì)目標(biāo)核酸與檢測(cè)探針和/或捕捉探針雜交而形成的復(fù)合體進(jìn)行光 照射,從而在光反應(yīng)性基團(tuán)與目標(biāo)核酸中的核酸堿基之間形成共價(jià)鍵的工序。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法,檢測(cè)探針的核酸分子中的至少一個(gè)核酸堿基被替 換為光反應(yīng)性基團(tuán)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法,捕捉探針的核酸分子中的至少一個(gè)核酸堿基被替 換為光反應(yīng)性基團(tuán)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3的任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法,光反應(yīng)性基團(tuán)是選自3-氰基乙烯基 咔唑基、對(duì)氨基甲?;蚁┗椒踊?、4, 5',8-三甲基補(bǔ)骨脂素基以及N3-甲基-5-氰基乙 烯基尿嘧啶基中的至少1種。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK104428424SQ201380034120
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月31日
【發(fā)明者】平野泰亮, 中村史夫, 上田洋二, 藤本健造 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社