用于真核細胞的培養基的制作方法

用于真核細胞的培養基的制作方法
【專利摘要】本發明涉及(i)一種或多種C2-C6α-羥基酸、這些酸的鹽、這些酸的酯和它們的組合；以及(ii)一種或多種選自以下各項的化合物：-由γ-谷氨酰基氨基酸、焦谷氨酰基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸、N-乙酰基氨基酸和甘氨酰基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組；-酚酸衍生物；-直鏈C2-C6或環狀C6糖醇；-吡啶酸衍生物；和-選自尿嘧啶、腺嘌呤、3’-單磷酸腺苷(3’-AMP)和5’-單磷酸腺苷(AMP)的核堿基和/或核苷酸，在用于培養真核細胞的培養基中作為生長和生產促進成分的用途。本發明進一步涉及包含在至少0.001mg/l的水平的這些組分的培養基。
【專利說明】用于真核細胞的培養基

【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于培養真核、具體地動物細胞的培養基的生產，W及因此生產的細 胞培養基，和其用于真核、具體地動物細胞的體外培養的的用途。

【背景技術】
[0002] 通過培養哺乳動物、植物或昆蟲細胞，有價值的生物化學品和生物醫藥品，例如抗 體和抗生素的生產需要適當的培養基。已經用包含未定義的成分（如胎牛血清（FCS)，幾 種動物來源的蛋白質和/或牛來源的蛋白質水解產物）的一系列添加物補充細胞培養基成 分。
[0003] 在動物細胞培養中使用的血清或血清來源的物質，如白蛋白、轉鐵蛋白或膜島素， 可W包含可能污染培養物W及由該些所獲得的生物醫藥產品的不需要的試劑。此外，像牛 肉或膠原水解產物的牛來源蛋白產品承受BSE污染的風險。而且，必須對所有已知的病毒， 包括可W通過血清傳輸的肝炎和HIV，測試來源于人類血清中的添加劑。
[0004] 總之，通過未知的試劑可W污染所有血清衍生的產品。在細胞培養中，在血清或蛋 白質添加劑來源于人類或其它動物來源的情況下，無數的問題（例如，不同批次的質量和 組成變化，W及病毒、支原體或BSE污染的風險）可W發生。因此，植物蛋白質水解產物或 植物蛋白腺普遍使用于應當不含動物組分的培養基。
[0005] 然而，在沒有動物來源的細胞培養添加劑的培養基中，動物細胞的生長和產率總 是無法令人滿意的。頻繁地觀察到，體外培養的動物細胞成團（in lump)生長。該被認為 是欠佳的條件，因為剝奪了在團的核也的細胞的營養物，并且細胞將會死亡。在下游處理過 程中，還存在堵塞管路或過濾器的風險。通過它們的外觀也可W評估細胞下降的活力。具 有下降的活力的細胞顯示出不規則的形狀，即不圓的外形，并且還具有不同于具有完全明 亮的和透明的細胞內含物的健康細胞的"成粒"細胞內含物。
[0006] W02006/123926涉及在至少一種植物蛋白來源（優選地，來自油菜、小麥或香菜） 的基礎上的一種用于生長和/或培養微生物和/或細胞的膚組合物。在實施例中介紹了小 麥水解產物的效果。
[0007] W02006/128764公開了用于培養生產復合蛋白質的哺乳動物細胞的方法，其中，向 細胞培養物中進料一種或多種植物來源的蛋白腺。舉例證明了植物來源大豆、棉巧和魏豆。 在伴隨實施例中顯示了大豆水解產物對CHO細胞培養的影響。
[0008] W02009/020389公開了向日葵屬（向日葵）物質的蛋白質水解產物作為用于培養 真核、具體地動物細胞的培養基組分的用途。
[0009] US2003/0203448A1描述了用于細胞培養的無蛋白質的和無血清的培養基，包含大 豆水解產物和可選地添加的游離氨基酸。
[0010] US2002/0039787公開了用于在體外培養微血管內皮細胞的方法，所述方法包括， 在存在有效量的人類血清下，培養微血管內皮細胞的富集群。
[0011] 植物蛋白質水解產物的功能性是它的化學成分的直接結果。它受到如原料、加工 因素、過程控制和儲存條件的幾個因素的影響。因此，它導致一種持久的仍很少研究的定義 為"批次間偏差"的現象。
[0012] 生物制藥工業對其表示了重要的關注，其是該些水解產物的消費者，因為它可W 意味著在產品收率上10%至25%的偏差W及它具有直接的財政后果。本發明旨在解決該 些憂慮。


【發明內容】

[001引已發現Cs-Ce a -輕基酸、該些酸的鹽、該些酸的醋和它們的組合，結合選自W下各 項的一種或多種化合物：由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基酸、包含谷氨酸或包含 脯氨酸的二膚、氧代氨基酸、高氨基酸化omo-amino acid)、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜 基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組；酷酸衍生物；直鏈Cs-Ce或環狀Ce糖醇；化巧酸衍生 物；W及選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧（3' -AMP) W及5'-單磯酸腺巧（AMP)的核 堿基和/或核巧酸，或者來自該些化合物組的化合物的組合，對真核細胞尤其是動物細胞 體外細胞培養具有強的生長和生產促進效果。該些化合物的最低水平的存在致使一致的并 且因此商業上有吸引力的產品性能。包含該些組分的培養基極其適用于培養真核、具體地 動物細胞。因此本發明提供了一種包含該些特定組分的細胞培養基，W及生產該些培養基 的方法和使用包含作為培養基組分的該些組分的組合物用于在體外培養動物細胞的方法。

【具體實施方式】
[0014] 本發明涉及一種生產用于培養真核細胞、尤其是動物細胞的培養基的方法，包括 使用（i) 一種或多種Cs-Qa-輕基酸、該些酸的鹽、該些酸的醋和它們的組合；W及 [001引 扣）一種或多種選自W下各項的化合物：由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨 基酸、包括谷氨酸鹽/醋或包括脯氨酸的二膚、氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W 及甘氨醜基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組；酷酸衍生物；直鏈Cs-Ce或環狀Ce糖醇；口比 巧酸衍生物；W及選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧（3' -AMP) W及5'-單磯酸腺巧 (AM巧的核堿基和/或核巧酸，或來自該些化合物組的化合物的組合，作為生長促進或者生 產改進的成分。本發明也涉及用于培養真核、具體地動物細胞的培養基，基于干重，包含至 少0. 02ppm(0. 02mg/kg)，優選地至少0. 2mg/kg，更優選地至少2mg/kg，甚至更優選地至少 20mg/kg，最優選地至少50ppm(50mg/kg)的一種或多種W上限定的組分。
[0016] 在本文描述的任何地方，給定的本發明的細胞培養基的成分的量都是基于干重， 通過任意地取5% (50g/l)的干固體含量可W得出在液體培養基中的最終濃度，并且反之 亦然。因此，為了得到優選的水平，lOOmg/kg干物質的量對應5mg/l的最終的液體培養基。 該決不意味著液體培養基的干固體含量應當是5%。取決于具體的細胞培養濃度，干固體 的水平可W選擇為例如0. 5wt %至30wt %，優選地0. 5wt %至15wt %，更優選地Iwt %至 15wt %，最優選地Iwt %至5wt %。
[0017] C-C g -時某酸
[0018] 根據本發明供使用的Cs-Ce a -輕基酸在Cs-Ce主鏈處可W可選地被取代。適合的 取代基包括團素、醋、離、輕基、氨基W及芳香族基團。
[0019] 根據本發明，供使用的特別優選的C2-Ce a-輕基酸是乳酸、k3-苯基乳酸、巧樣 酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-輕基下酸、a-輕基異戊酸、a-輕基 異己酸和H輕基下酸，該些酸的鹽和該些酸的醋。
[0020] 本發明優選的鹽是Cs-Ce a -輕基酸的軸、鐘、巧、鎮或饋鹽。
[0021] 本發明優選的醋是Cs-Ce a -輕基酸的直鏈或支鏈C1-C4醋。
[0022] 根據本發明供使用的特別優選的C2-Ce a -輕基酸是軸-k乳酸鹽、粘酸和甲 基-L-3-苯基乳酸。
[0023] 氨某酸衍牛物
[0024] 優選的Y-谷氨醜基氨基酸是衍生自較大的芳族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、和色 氨酸的那些。Y-谷氨醜基衍生物通過Y-駿基連接至其他氨基酸。優選的Y-谷氨醜基 氨基酸是Y-谷氨醜基-酪氨酸和Y-谷氨醜基-苯丙氨酸。
[0025] 優選的焦谷氨醜氨基酸是焦谷氨醜基-谷氨酸和焦谷氨醜基-甘氨酸。焦谷氨醜 基是下述谷氨醜基，其中a-氨基和Y-駿基縮合W形成環狀基團，并且因此焦谷氨醜基是 5-氧代化咯焼-2-基撰基氨基。
[0026] 優選的含谷氨酸或者含脯氨酸的二膚是額氨醜基谷氨酸和甘氨醜基脯氨酸；其他 優選的二膚是環二膚，例如環（甘氨醜基-谷氨酸）。
[0027] 優選的氧代氨基酸是5-氧代脯氨酸和S-氧代-甲硫氨酸（甲硫氨酸亞諷 (methionine sulfoxide))。
[0028] 高氨基酸中"高"表示在常規氨基酸（通過遺傳密碼翻譯直接可獲得的20種氨基 酸中的一種）的主鏈上加入一個亞甲基，優選的高氨基酸是目-丙氨酸、高絲氨酸和2-氨 基-下酸（"高丙氨酸"）。
[0029] 優選的N-己醜基氨基酸是單個氨基酸的N-己醜基氨基衍生物，特別是較大的氨 基酸，如亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、瓜氨酸、 精氨酸。具體地優選的N-己醜基氨基酸是N-己醜基-甲硫氨酸、N-己醜基苯丙氨酸和 N-己醜基-鳥氨酸。
[0030] 根據本發明供使用的最優選的氨基酸衍生物是Y-谷氨醜基-酪氨酸和Y-谷氨 醜基-苯丙氨酸、環甘氨醜基-谷氨酸、額氨醜基谷氨酸、5-氧代脯氨酸和目-丙氨酸。 [00引]齡酸衍牛物
[0032] 在本發明的上下文中，術語"酷酸衍生物"理解為包括含有酷環和有機駿酸官能團 的具有Ci-Ce骨架的全部有機化合物，并且其可W進一步在Ci-Ce骨架和/或者酷環上被例 如團素、醋、離、輕基、氨基和/或者芳族基團取代。
[0033] 根據本發明供使用的特別優選的酷酸衍生物是阿魏酸（巧)-3-(4-輕基-3-甲氧 基-苯基）丙-2-帰酸）、下香酸（4-輕基-3, 5-二甲氧基苯甲酸）、香草酸（4-輕基-3-甲 氧基苯甲酸）、芥子酸（3- (4-輕基-3, 5-二甲氧基苯基）丙-2-帰酸），該些酸的醋，或該 些酸的鹽。最優選的酷酸衍生物是阿魏酸、下香酸，該些酸的醋或該些酸的鹽，該些酸的鹽 和該些酸的醋。
[0034] 優選的鹽是W上限定的酷酸衍生物的軸、鐘、巧、鎮、或者饋鹽。
[0035] 優選的醋是W上限定的酷酸衍生物的直鏈或者支鏈C1-C4醋。
[0036] 育鏈C。-。或者環狀。糖醇
[0037] 在本發明的上下文內，術語"Cs-Ce糖醇"是指具有通式H(HCHO)WH的直鏈化合物， 其中n是1、3、4或5 W及環狀Ce化合物環己焼-1，2, 3, 4, 5, 6-六醇。該些化合物的典型 實例分別是木糖醇、蘇糖醇、甘露醇、和肌醇、異肌醇、k手性肌醇和D-手性肌醇。
[0038] 根據本發明，供使用的特別優選的Cs-Ce糖醇是手性肌醇、赤薛醇、蘇糖醇及山梨 醇。
[0039] 口比畦酸衍牛物
[0040] 術語"化巧酸衍生物"理解為包括含有化巧咕&腳環和有機駿酸官能團的所有具 有Ci-Ce骨架的有機化合物，并且其可W進一步在Ci-Ce骨架和/或者化巧環處被例如團素、 醋、離、輕基、氨基和/或者芳族基團取代。化巧氮還可W被季饋化，即，使用直鏈、支鏈、飽 和或者不飽和脂肪或者芳族姪基焼基化。
[0041] 優選的鹽是如上限定的化巧酸衍生物的軸、鐘、巧、鎮、或者饋鹽。
[0042] 優選的醋是如上限定的化巧酸衍生物的直鏈或者支鏈C1-C4醋。
[0043] 根據本發明，供使用的特別優選的化巧酸衍生物是葫蘆己堿（1-甲基化巧-3-駿 酸鹽）。
[0044] 典型地，本發明的細胞培養基包含至少（i) 一種Cs-Ce a-輕基酸或者其鹽或醋， 和（ii)至少一種選自如上詳細限定的化合物組a)至e)中的化合物。例如細胞培養基可 W包含如本文限定的濃度的Cs-Ce a -輕基酸如乳酸，和酷酸衍生物如阿魏酸。可替換地， 細胞培養基可W包含至少（i) 一種Cs-Qa -輕基酸，或者其鹽或醋，和（ii)兩種或更多種 選自如上詳細限定的化合物組a)至e)的化合物，其中，后面的兩種或更多種化合物可W選 自相同的化合物組，或者兩個不同的組。例如，細胞培養基可W包含如本文限定的濃度的 Cs-Ce a -輕基酸如乳酸，W及糖醇赤薛醇和蘇糖醇。可替換地，細胞培養基可W包含如本文 限定的濃度的Cs-Ce a -輕基酸如乳酸，氨基酸衍生物如Y -谷氨醜基-苯丙氨酸，和化巧酸 衍生物葫蘆己堿。
[0045] 根據本發明使用的細胞培養基組分可W像該樣使用。大部分組分是商購的。或者， 它們可W通過通常已知的合成或半合成過程產生。大部分的衍生物也可W從適合的蛋白質 部分或水解產物，特別地植物來源的蛋白質如從大豆、魏豆、扁豆、小麥（款質）、棉巧（棉 子）、稻谷、向日葵、紅花等中分離得到。從蛋白質部分、或更方便地從蛋白質水解產物中提 取或富集它們。該些方法在本領域中是已知的。
[0046] 因此本發明涉及通過將一定量的W下各項加入至培養基的另外組分來生產細胞 培養基的方法：
[0047] a) -種或多種Cs-Ce a -輕基酸、該些酸的鹽、該些酸的醋和它們的組合；W及
[004引 （ii) 一種或多種選自W下化合物的組的化合物：
[0049] a)由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二膚、 氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組；
[0050] b)酷酸衍生物；
[0051] C)直鏈Cs-Ce或者環狀Ce糖醇；
[005引 d)化巧酸衍生物；W及
[005引 e)選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧（3' -AMP)和5'-單磯酸腺巧（AMP)的核 堿基和/或核巧酸，
[0054] 或者選自化合物組a)、b)、C)、d)和e)的化合物的組合，
[00巧]作為生長促進和/或者生產改進成分，
[0056] 使得每種單獨組分在培養基中的最終濃度是至少0. OOlmg/1，優選至少0. Olmg/ 1，更優選至少0. lmg/1，最優選至少lmg/1，并且下面進一步詳細說明。優選地是，如上限定 的每種單獨的細胞培養基組分在培養基中的最終濃度是最多50g/l，優選最多lg/1，更優 選最多lOOmg/1。該組分可W如此，例如作為純化的和/或者合成的產物加入。優選地，該類 純化的和/或者合成的組分具有至少80%，更優選至少90%，最優選至少95%的純度。可 替換地，可W將化合物作為濃縮物添加，即通過濃縮或富集根據本發明的細胞培養基組分 的溶液至按重量計至少0. Ol %，優選地至少0. 1 %，更優選地至少1 %，最優選地至少10%， 或者甚至至少25 %，和優選地按重量計至多80 %，更優選地至多70 %的水平，或者具有優 選地至少0. Img,更優選地至少Img,甚至更優選地至少IOmg,甚至更優選地至少Ig,還更優 選地至少lOg，最優選地至少IOOg每kg的干物質的濃度可獲得的產品。
[0057] 在本發明范圍內，術語"培養基的另外的組分"和"另外的常規培養基組分"是 指本領域通常已知的作為細胞培養基的組分的化合物，如植物或動物細胞因子和/或 生長因子（條件是該些不是動物來源的）、維生素、礦物質、氨基酸、緩沖鹽、微量元素、 核巧、核巧酸、植物激素、包括葡萄糖的糖，抗生素等。植物激素包括生長激素、赤霉 素、脫落酸W及它們的組合。合適的成分和成分組合的指導可W在，例如"Basic Cell Culture Protocols'，，Methods in Molecular Biology Series 的第 75 卷，Ed. Jeffrey W.化Hard,化hn M. Wa化er, Humana Press, 1997中找到。取決于設想的細胞系和細胞方面， 技術人員能夠選擇期望的或需要的另外的培養基組分的類型和數量。
[0058] 本發明進一步涉及通過該方法可獲得的細胞培養基。更具體地，本發明涉及用于 培養真核細胞的培養基，該培養基包含至少0. OOlmg^和最多50g/l，或者最少0. 02mg每 kg的干物質的W下每種單獨組分：
[005引 a) -種或多種Cs-CeU -輕基酸，該些酸的鹽，該些酸的醋和它們的組合；W及
[0060] (ii) -種或多種選自W下化合物的組的化合物：
[0061] a)由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二膚、 氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組； [00的]b)酷酸衍生物；
[006引 C)直鏈Cs-Ce或者環狀Ce糖醇；
[0064] d)化巧酸衍生物；W及
[006引 e)選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧（3' -AMP)和5'-單磯酸腺巧（AMP)的核 堿基和/或核巧酸，
[0066] 或者選自化合物組a)、b)、C)、d)和e)的化合物的組合。
[0067] 優選地是，每種所述單獨的組分在培養基中的最終濃度是至少0. OOlmg每1，優選 地至少0. Olmg每1，更優選地至少0. Img每1，甚至更優選地至少Img每1，最優選地至少 Smg每1的最終液體培養基，并且最多lg/1，優選地最多lOOmg/1。就本發明的細胞培養基 的干重而言，它包含至少0. 02mg每kg,優選地至少0. 2mg每kg,更優選地至少2mg每kg,甚 至更優選地至少20mg每kg,最優選地至少250mg每kg的干物質，W及至多lOOOg，優選地 至多20g，更優選地至多2g每kg的干物質的如上限定的細胞培養基，其中，濃度是每種單獨 的組分。
[0068] 在本發明的優選的實施方式中，細胞培養基包含5mg/l至30g/l每種單獨的組分， 或者IOOmg至600g，優選地250mg至150g每kg干物質的濃度的一種或多種上述組分。更 優選的水平是IOmg^至Ig^或者200mg至IOOg,優選地500mg至50g每kg的干物質，甚 至更優選地20mg^至SOOmg^或者Ig至25g每kg干物質。
[0069] 在本發明的一個實施方式中，使用如本文限定的組分作為一種或多種植物蛋白質 水解產物的部分。
[0070] 在本發明特別優選的實施方式中，本文限定的一種組分與一種或多種植物蛋白質 水解產物組合使用或加入至一種或多種植物蛋白質水解產物。
[0071] 在液體培養基中（基本上水可溶性的）水解產物的量可W由技術人員確定，但是 包含優選地 0. 001-10. Owt/vol %，更優選地 0. 01-10. Owt/vol %，更優選地 0. 01-4. Owt/ vol %，甚至更優選地 0. 05-2. Owt/vol %，或 0. 05-1. Owt/vol %，甚至更優選地 0. 1-1. Owt/ vol %，并且最優選地 0. 2-0. 6wt/vol %。
[0072] 通過本領域已知的方法，例如通過壓制、磨制、剝殼和/或粉碎，通過處理豆、豆 芙、種子等，若需要緊接著脫脂，例如使用如己焼的有機溶劑，可W產生蛋白質水解產物。優 選地，脫脂的種子材料包含至少20wt%的蛋白質。脫脂的種子材料優選地具有不到lOwt% 的脂肪含量。
[0073] 通常，通過酶促蛋白水解作用獲得蛋白質水解產物，也可W將其稱為蛋白質水解 產物（proteolysate)。（脫脂的）植物種子材料（可選地粉碎的）經受使用來自于細菌、真 菌、植物或動物來源的內切和/或外切蛋白酶或它們的混合物的水解作用；然而，優選地， 酶不來自于動物來源。使用重組DNA技術可W生產酶。優選的酶是內切蛋白酶。更優選地， 酶包含堿性蛋白酶。適合的蛋白酶包含枯草桿菌蛋白酶（Alcalase),絲氨酸內切蛋白酶。 特別適合的酶包含來自Novozymes的枯草桿菌蛋白酶，和/或來自于Merck的木瓜蛋白酶。 其它適合的酶包含，例如中性蛋白酶（Neutrase)。
[0074] 水解作用的條件包括30分鐘至30小時；優選地1-6小時，最優選地2-4小時的反 應時間；溫度是20至65C，優選地4(TC至6(TC，全部取決于特定的蛋白質來源和期望的水 解程度。抑值可W調整為6.0至8. 5,優選地6. 6至8.0,最優選地為7.0-8. 0。在溶液中 待水解的蛋白質的濃度是1至10 %，優選地2-8，最優選地3-6wt %的蛋白質。基于底物，使 用的酶的量為0. 5-lOwt%，優選地l-5wt%，最優選地1. 5-3. 5wt%。
[00巧]優選地，進行水解作用直至獲得5至50%，優選地10至40%，最優選地10至 30 %的水解程度。使用熱處理停止水解反應。優選地，熱處理包括80至IOOC 15至90 分鐘的加熱時間（批量熱處理），或在100-120°C 1-5分鐘的加熱時間。采用常規的甲酵 滴定可W確定水解的程度，如在實施例中所確定的。在水解反應終止之后，可W可選地精 煉（polish)反應混合物W去除不可溶的部分，例如使用離也作用或者諸如娃藻± (例如 Cdite'K，Dicalit打"，Hyflo'" )的在本領域中已知的過濾助劑。優選地，基于干物質，水 解產物包含不到IOwt%的不可溶于水的材料，更優選地不到5wt%，最優選地不到2wt%。 例如，通過噴霧干燥或冷凍干燥可W干燥水解產物。可W像該樣使用或者可W進一步分觸 水解產物。
[0076] 基于總蛋白質，優選地，水解產物包含20至SOwt %，特別地20至60wt %的具有 100-500化的分子量的膚和/或10至30wt %的500至1000化的分子量的膚。就膚長度而 言，基于總蛋白質，水解產物優選地包含至少15wt %，更優選地至少25wt %，最優選地至少 35wt %，至多達例如85wt %，更優選地至多達65wt %，最優選地至多達55wt %的二膚至五 膚，8至30wt%的六膚至九膚，至少8wt%，特別地，15至60wt%的高級膚（hi曲er P巧tide) 和0. 1至30wt %，優選地0. 5至IOwt %的游離氨基酸。在優選的實施方式中，可W超濾水 解產物，優選地，使用5或IOkDa分子量的截留（cut-off)。水解產物可W包含另外的組分， 如碳水化合物、可溶纖維、多價金屬鹽等。優選地，蛋白質的含量（所有蛋白質類材料，包括 游離氨基酸）是30至90wt %，更優選地45至85wt %。該些量是基于干重的。
[0077] 水解產物可W與培養基的其它常規組分組合，如植物或動物細胞因子和/或生長 因子（條件是該些不是動物來源的）、維生素、礦物質、氨基酸、緩沖鹽、微量元素、核巧、核 巧酸、植物激素、包括葡萄糖的糖、抗生素等等。植物激素包含生長激素、赤霉素、脫落酸W 及它們的組合。
[0078] 商購的基礎培養基也可W與本發明的細胞培養組分和可選的蛋白質水解產物組 合使用。可W使用的動物細胞系如來自于Lonza的CHO-I、CD-CH0、PowerCH0,來自于Irvine Scientific的ISC冊-CD，或者來自于SAFC的Excell 325 PF C冊。對于植物細胞，可W使用 從SAFC可獲得的Murashige和Skoog基礎培養基。水解產物也可W是來自于不同的蛋白 質來源的水解產物，如來自小麥和大豆、大豆和魏豆、稻谷和棉巧的水解產物。優選地，細胞 培養基不包含諸如胎牛血清的血清或血清來源的組分，W使得是完全可復制的和/或避免 污染。優選地，細胞培養基不含動物組分，如動物來源的蛋白質和/或動物（例如牛來源） 的蛋白質水解產物。因此，在優選的實施方式中，本發明涉及在本文中所定義的用于培養真 核細胞的無血清的培養基，和制備該樣的無血清培養基的方法。
[0079] 根據本發明的細胞培養基和培養方法能夠支持真核、具體地動物細胞的培養，其 中能力指的是在體外通過細胞能夠至少生存、增殖和/或分化，并且優選地進行產物的表 達。在分批、補料、連續或灌注的反應器中培養均是設想到的。
[0080] 在細胞倍增和生長的實際生長階段和生產階段中，細胞生長曲線可W是分離的， 在生產階段中，細胞或多或少處于一種穩定的狀態，只是開始產生感興趣的代謝物，例如抗 體。本發明的細胞培養基組分能夠支持動物或其它真核細胞的生長階段和生產階段。
[0081] 可W W液體或W粉末的、干燥的形式提供細胞培養基。在液體培養基中（基本上 水可溶性的）粉末的或干燥的細胞培養組分的量可W通過技術人員確定，但是包含優選 地 0. 01-10. Owt/vol %，更優選地 0. 01-4. Owt/vol %，甚至更優選地 0. 05-2. Owt/vol %，或 0. 05-1. Owt/vol %，甚至更優選地 0. 1-1. Owt/vol %，并且最優選地 0. 2-0. 6wt/vol %。
[0082] 在可W用水重建的干燥細胞培養基中水解產物的量取決于培養基組分，但是典型 地在2-80% w/w，優選地5-50% w/w的范圍之內。優選地，細胞培養基也包含糖、具體地葡 萄糖，優選地10至0. 1、更優選地2. 5至0. 4的葡萄糖和水解產物的干重比率，W及上述的 另外的成分。
[0083] 而且，本發明涉及用于培養真核細胞的細胞培養基的用途。真核生物包括真菌 (包括酵母）、原生生物、色藻界、植物界W及后生動物（動物）。本發明特別涉及用于培養 植物細胞（例如稻谷、煙草和玉米），并且尤其是動物細胞，優選地，體外培養的用途。所要 培養的細胞可W是自然來源的或者可W是遺傳改變的。動物細胞特別包含脊椎動物和無脊 椎動物細胞，包含諸如人類細胞（例如，P邸cseells'i")的哺乳動物細胞，曬齒類動物細胞， 具體地，中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、鳥、魚、爬行動物、兩棲動物或昆蟲細胞。
[0084] 通過本發明的方法培養的細胞特別適用于在生物制藥業中可W進一步純化的蛋 白質產品的表達。在非限制的實施例中，在本發明的培養基中，可W有利地生產包含促紅細 胞生成素（用于治療血液障礙），依那西普（用于治療風濕病和痛風的TNF-Q抑制劑），a 鏈球菌（用于治療囊腫性纖維化的脫氧核糖核酸酶）、目-干擾素（對于治療多發性硬化） W及大范圍的治療性單克隆抗體的蛋白質產品。可W通過本領域已知的方法回收蛋白質產 品，如通過分觸、親和色譜法（吸附-脫附）等，或者它們的組合從培養基中分離細胞和從 無細胞液體（上清液）中分離蛋白質產品。
[0085] 而且，本發明涉及一種試劑盒，包括含有如本文所限定的細胞培養基組分的部分， W及選自植物水解產物、植物或動物細胞因子和/或生長因子、維生素、礦物質、氨基酸、緩 沖鹽、微量元素、核巧、植物激素、核巧酸、糖W及抗生素的一種或多種培養基的組分。在試 劑盒中的組分可W作為一種或多種組合存在。例如，本發明的細胞培養基組分可W單獨地 W干燥的或溶解的形式存在，并且部分或全部的培養基的另外的組分，如植物水解產物、植 物或動物細胞因子和/或生長因子、維生素、礦物質、氨基酸、緩沖鹽、微量元素、核巧、核巧 酸、植物激素、糖W及抗生素，可W作為單獨的組合存在。或者，細胞培養基組分可W與例如 氨基酸和/或膚和/或糖預先混合，并且任何剩余的組分可W單獨地或W-種或多種組合 存在。優選地，至少一種組合物是液體，液體可W有利地是滅菌的。在使用培養基之前混合 試劑盒的組分。
[0086] 因而發現，根據本發明的細胞培養基組分，W及它們的用途具有幾個重要的優勢。 它們具有生長促進的效果，其超過由常見蛋白質組分提供的生長。它們導致提高的生產，生 產和/或生長較低的差異，并且是成本有效的。
[0087] 在體外培養的動物細胞不是成團或成簇生長的，而是作為單個細胞存在。其次，女口 通過完好的圓形和明亮的透明細胞內含物所判斷的，細胞的活力極好。第H，在沒有損害期 望的細胞產物的表達水平的情況下，相比于如那些基于無血清蛋白質、具體地大豆蛋白質 的現有技術細胞培養基，可W獲得高得多的細胞密度。第四，如本文所限定的細胞培養基組 分可W與任何用于動物細胞體外培養的基礎培養基組合，使得能夠生產具有上面提及的優 勢的多種細胞培養基。此外，培養可W延伸延長的時間段，致使更高的產品收率。
[008引本文W上已經闡述的所有特征、數量和量度準用于如本文中詳細限定的細胞培養 基組分的其它組合。
[0089] 因此，在另一方面，本發明涉及生產用于培養真核細胞的培養基的方法，包括向另 外的常規培養基成分加入W下各項的步驟：
[0090] a) -種或多種酷酸衍生物；W及
[00川 扣）一種或多種選自W下的化合物；Ca-Ce a-輕基酸、該些酸的鹽、該些酸的醋 和它們的組合；由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二 膚、氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物 的組；直鏈Cs-Ce或環狀Ce糖醇；化巧酸衍生物；W及選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧 (3'-AM巧和5'-單磯酸腺巧（AM巧的核堿基和/或核巧酸，或來自該些化合物組的化合物 的組合，作為生長促進和/或生產改進的成分，
[009引使得列于（i)和m)下的每種單獨的化合物在培養基中的最終濃度是至少 0. OOlmg/l，優選至少0. Olmg/l，更優選至少0. Img/l，最優選至少Img/l，其中所述化合物 作為純物質或者作為濃縮物加入。
[0093] 在另一方面，本發明涉及生產用于培養真核細胞的培養基的方法，包括向另外的 常規培養基成分添加W下各項的步驟：
[0094] a) -種或多種化巧酸衍生物；W及
[009引 扣）一種或多種選自W下各項的化合物；酷酸衍生物；Cs-Ce a輕基酸、該些酸的 鹽、該些酸的醋和它們的組合；由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基酸、包含谷氨酸或 包含脯氨酸的二膚、氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜基-甘氨酸組成 的氨基酸衍生物的組；直鏈Cs-Ce或環狀Ce糖醇；和選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧 (3'-AM巧和5'-單磯酸腺巧（AM巧的核堿基和/或核巧酸，或來自該些化合物組的化合物 的組合，作為生長促進和/或生產改進的成分，
[009引使得列于（i)和m)下的每種單獨的化合物在培養基中的最終濃度是至少 0. OOlmg/1，優選至少0. Olmg/1，更優選至少0. lmg/1，最優選至少lmg/1，其中所述化合物 作為純物質或者作為濃縮物加入。
[0097] 在另一方面，本發明涉及生產用于培養真核細胞的培養基的方法，包括向另外的 常規培養基成分添加W下各項的步驟：
[009引 a) -種或多種直鏈Cs-Ce或環狀Ce糖醇；W及
[009引 扣）一種或多種選自W下各項的化合物：化巧酸衍生物；酷酸衍生物；Cs-Ce a -輕 基酸、該些酸的鹽、該些酸的醋和它們的組合；由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基 酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二膚、氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜 基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組；W及選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧（3'-AMP) 和5'-單磯酸腺巧（AM巧的核堿基和/或核巧酸，或來自該些化合物組的化合物的組合，作 為生長促進和/或生產改進的成分，
[0100] 使得列于（i)和（ii)下的每種單獨的化合物在培養基中的最終濃度是至少 0. OOlmg/1，優選至少0. Olmg/1，更優選至少0. lmg/1，最優選至少lmg/1，其中所述化合物 作為純物質或者作為濃縮物加入。
[0101] 在另一方面，本發明涉及生產用于培養真核細胞的培養基的方法，包括向另外的 常規培養基成分添加W下各項的步驟：
[0102] (i) 一種或多種選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧（3' -AM巧和5'-單磯酸腺 巧（AMP)的核堿基和/或核巧酸；W及
[010引 扣）一種或多種選自W下各項的化合物追鏈Cs-Ce或環狀Cs-Ce糖醇；化巧酸 衍生物；酷酸衍生物；Cs-Q a輕基酸、該些酸的鹽、該些酸的醋和它們的組合；由Y-谷氨 醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二膚、氧代氨基酸、高氨基酸、 N-己醜基氨基酸W及甘氨醜基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組；或來自該些化合物組的 化合物的組合，作為生長促進和/或生產改進的成分，
[0104] 使得列于（i)和（ii)下的每種單獨的化合物在培養基中的最終濃度是至少 0. OOlmg/1，優選至少0. Olmg/1，更優選至少0. lmg/1，最優選至少lmg/1，其中所述化合物 作為純物質或者作為濃縮物加入。
[0105] 在又一方面，本發明涉及通過上述方法可獲得的細胞培養基。
[0106] 本發明進一步涉及用于培養真核細胞的培養基，包含至少O.OOlmg/1，優選至少 0. 0 lmg/1，更優選至少0. lmg/1，甚至更優選至少lmg/1，最優選至少5mg/l，或至少0. 02mg/ kg,優選至少0. 2mg/kg，更優選至少2mg/kg，甚至更優選至少20mg/kg，最優選至少250mg/ kg,和最多50g/l，優選最多lg/1，更優選最多IOOmg^每份所述單獨的組分，或者最多 lOOOg，優選最多20g，更優選最多2g每kg的干物質的W下每種單獨的組分：
[0107] (i) 一種或多種酷酸衍生物；W及
[010引 扣）一種或多種選自W下各項的化合物；Cs-Ce a -輕基酸、該些酸的鹽、該些酸的 醋和它們的組合；由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的 二膚、氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物 的組；直鏈Cs-Ce或環狀Ce糖醇；化巧酸衍生物；W及選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧 (3'-AM巧和5'-單磯酸腺巧（AM巧的核堿基和/或核巧酸，或來自該些化合物組的化合物 的組合。
[0109] 本發明進一步涉及用于培養真核細胞的培養基，包含至少O.OOlmg/1，優選至 少0. Olmg/1，更優選至少0. lmg/1,甚至更優選至少lmg/1,最優選至少5mg/l，或者至少 0. 02mg/kg，優選至少0. 2mg/kg，更優選至少2mg/kg，甚至更優選至少20mg/kg，最優選至少 250mg/kg，和最多50g/l，優選最多Ig^，更優選最多IOOmg^每種所述單獨的組分，或者最 多lOOOg，優選最多20g，更優選最多2g每kg的干物質的W下每種單獨的組分：
[0110] a) -種或多種化巧酸衍生物；W及
[01川 扣）一種或多種選自W下各項的化合物；酷酸衍生物；Cs-Ce a-輕基酸、該些酸的 鹽、該些酸的醋和它們的組合；由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基酸、包含谷氨酸或 包含脯氨酸的二膚、氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜基-甘氨酸組成的 氨基酸衍生物的組；直鏈Cs-Ce或環狀Ce糖醇；W及選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧 (3'-AM巧和5'-單磯酸腺巧（AMP)的核堿基和/或核巧酸，或來自該些化合物組的化合物 的組合。
[0112] 本發明進一步涉及用于培養真核細胞的培養基，包含至少O.OOlmg/1，優選至 少0. Olmg/1，更優選至少0. lmg/1,甚至更優選至少lmg/1,最優選至少5mg/l，或者至少 0. 02mg/kg，優選至少0. 2mg/kg，更優選至少2mg/kg，甚至更優選至少20mg/kg，最優選至少 250mg/kg，和最多50g/l，優選最多Ig^，更優選最多IOOmg^每種所述單獨的組分，或者最 多lOOOg，優選最多20g，更優選最多2g每kg的干物質的W下每種單獨的組分：
[om] a) -種或多種直鏈Cs-Ce或環狀Ce糖醇；W及
[0114] (ii) 一種或多種選自W下各項的化合物：化巧酸衍生物；酷酸衍生物；Cs-Ce a -輕 基酸、該些酸的鹽、該些酸的醋和它們的組合；由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基 酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二膚、氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜 基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組；W及選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧（3' -AMP) 和5'-單磯酸腺巧（AMP)的核堿基和/或核巧酸，或來自該些化合物組的化合物的組合。
[0115] 本發明進一步涉及用于培養真核細胞的培養基，包含至少O.OOlmg/1，優選至 少0. Olmg/1，更優選至少0. lmg/1,甚至更優選至少lmg/1,最優選至少5mg/l，或者至少 0. 02mg/kg，優選至少0. 2mg/kg，更優選至少2mg/kg，甚至更優選至少20mg/kg，最優選至少 250mg/kg，和最多50g/l，優選最多Ig^，更優選最多IOOmg^每種所述單獨的組分，或者最 多lOOOg，優選最多20g，更優選最多2g每kg的干物質的W下每種單獨的組分：
[0116] (i) 一種或多種選自尿嚼巧、腺嘿嶺、3'-單磯酸腺巧（3' -AM巧和5'-單磯酸腺 巧（AMP)的核堿基和/或核巧酸；W及
[0117] (ii) 一種或多種選自W下各項的化合物：化巧酸衍生物；酷酸衍生物；Cs-Ce a -輕 基酸、該些酸的鹽、該些酸的醋和它們的組合；由Y-谷氨醜基氨基酸、焦谷氨醜基氨基 酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二膚、氧代氨基酸、高氨基酸、N-己醜基氨基酸W及甘氨醜 基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組；直鏈C2-Ce或環狀Ce糖醇，或來自該些化合物組的化 合物的組合。
[om] 連施例 。。引 連施例1 :巧含要求保護的細胸培養某紐分的帝白質水解產物的分析，W巧牛長 刺激的證據
[0120] 通過使用Waters Acquity UPLC和由電噴射離子化巧SI)來源和線性離子阱 (LIT)質譜儀組成的化ermo-Finnigan LTQ質譜儀，通過液相色譜/質譜法（LC/MS，LC/MS2) 分析從化ieslandCampina Domo, USA 獲得的如 SE50MAF-UF、WGE80M-UF、C肥80M-UF、PCE80B 的商用植物蛋白質水解產物。把樣品提取物分成兩個等分部分，干燥，然后在酸性或堿性 LC-相容性溶劑中重建。使用分離專用柱在兩次單獨注射中，使用酸性陽離子優化的條件分 析一個等分部分，并且使用堿性負離子優化的條件分析另一等分部分。使用均含有0. 1 % 甲酸的水和甲醇梯度洗脫在酸性條件中重建的提取物，而也使用水/甲醇的堿性提取物包 含6. SmM碳酸氨饋。MS分析在MS和使用動態排除的數據依賴MS2掃描之間交替。通過比 較純化標準品的代謝物組學庫登記項（庫體，library entry)或重現的未知實體確定生物 化學品。對于特定化合物或同重元素的實體，色譜的特性和質譜的組合給出了匹配的指示。 因此，產生了存在于植物蛋白質水解產物中的生物化學組分和它們的相對濃度的概述。而 且，在細胞培養試驗中測試的所有水解產物用于細胞生長和抗體生產。在細胞生長和化合 物分析數據中進行線性回歸分析，W確定顯著影響細胞生長和抗體生產的生物化學組分。 使用Microsoft Excel 2003的化0陽功能，計算抗體生產和組分相對濃度之間的關系，其 結果示出于下表1中。正斜率越高，在細胞培養中生物化學組分的重要性越高。也使用MS Excel的關聯回歸函數計算P-值，其代表值的顯著性，越低的P-值（全部在0到1之間）， 測定值越顯著。
[0121] 表1 ;抗體生產和細胞培養基組分的相對濃度的關系
[0122]

【權利要求】
1. 一種生產用于培養真核細胞的培養基的方法，包括向另外的常規培養基成分加入作 為生長促進和/或生產改進的成分的以下各項的步驟： (i) 一種或多種c2-c6 α -羥基酸、這些酸的鹽、這些酸的酯和它們的組合；以及 (ii) 一種或多種選自以下化合物的組的化合物： a) 由谷氨酰基氨基酸、焦谷氨酰基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二肽、氧代 氨基酸、高氨基酸、N-乙酰基氨基酸和甘氨酰基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組； b) 酚酸衍生物； c) 直鏈C2-C6或環狀C6糖醇； d) 吡啶酸衍生物；和 e) 選自尿嘧陡、腺嘌呤、3'-單磷酸腺苷（3'-AMP)和5'-單磷酸腺苷（AMP)的核堿基 和/或核苷酸， 或選自化合物組a)、b)、c)、d)和e)的化合物的組合， 使得列于（i)和（ii)下的每種單獨的化合物在所述培養基中的最終濃度是至少 0. 001mg/l，其中，所述化合物作為純物質或作為濃縮物添加。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，每種單獨的化合物在所述培養基中的最終濃度 是至少0· 01mg/l，優選至少0· lmg/1，最優選至少lmg/1。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述C2_C6 α -羥基酸選自乳酸、L-3-苯基 乳酸、檸檬酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、α -羥基異戊酸、 α -羥基異己酸和三羥基丁酸，優先選自乳酸、L-3-苯基乳酸和粘酸。
4. 根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中，所述氨基酸衍生物選自谷氨酰 基-酪氨酸、Υ -谷氨酰基-苯丙氨酸、環甘氨酰基-谷氨酸、纈氨酰基谷氨酸、5-氧代脯氨 酸和β -丙氨酸。
5. 根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述酚酸選自阿魏酸（(E)-3-(4-羥 基-3-甲氧基-苯基）丙-2-烯酸）、丁香酸（4-羥基-3, 5-二甲氧基苯甲酸）、香草酸 (4-羥基-3-甲氧基苯甲酸）、芥子酸（3-(4-羥基-3, 5-二甲氧基苯基）丙-2-烯酸），這 些酸的酯或這些酸的鹽，優選阿魏酸、丁香酸，這些酸的酯或這些酸的鹽，這些酸的鹽和這 些酸的酯。
6. 根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中，進一步將植物蛋白質水解產物加入 至所述培養基。
7. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述植物蛋白質水解產物是小麥、大豆、棉花或 豌豆蛋白質水解產物，或者兩種或更多種這些水解產物的混合物。
8. -種通過根據權利要求1-7中任一項所述的方法可獲得的細胞培養基。
9. 一種用于培養真核細胞的培養基，包含至少O.OOlmg且至多50g/l，或者至少 0. 02mg/kg的干物質的以下每種單獨的組分： (i) 一種或多種C2_C6 α -羥基酸、這些酸的鹽、這些酸的酯和它們的組合；以及 (ii) 一種或多種選自以下化合物的組的化合物： f) 由谷氨酰基氨基酸、焦谷氨酰基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二肽、氧代 氨基酸、高氨基酸、N-乙酰基氨基酸以及甘氨酰基-甘氨酸組成的氨基酸衍生物的組； g) 酚酸衍生物； h) 直鏈C2-C6或環狀C6糖醇； i) 吡啶酸衍生物；和 j) 選自尿嘧陡、腺嘌呤、3'-單磷酸腺苷（3'-AMP)和5'-單磷酸腺苷（AMP)的核堿基 和/或核苷酸， 或選自化合物組a)、b)、c)、d)和e)的化合物的組合。
10. 根據權利要求8或9所述的細胞培養基，包含的所列出的組分為0.01mg/l，優選至 少0· lmg/1，更優選至少lmg/1，最優選至少5mg/l，或至少0· 02mg/kg，優選至少0· 2mg/kg, 更優選至少2mg/kg,甚至更優選至少20mg/kg,最優選至少250mg/kg的干物質的濃度的列 于i)和ii)下的每種單獨的組分。
11. 根據權利要求8-10中任一項所述的細胞培養基，包含的所列出的組分為至多lg/ 1，更優選至多l〇〇mg/l的每種所述單獨的組分,或至多20g,更優選至多2g/kg的干物質的 濃度的每種列于i)和ii)下的單獨的組分。
12. 根據權利要求8-11中任一項所述的細胞培養基，包含的所列出的組分為5mg/l至 30g/l，或 100mg/kg 至 600g/kg 干物質，優選 5mg/l 至 3g/l，或 100mg 至 150g，更優選 250mg 至60g/kg干物質的濃度的每種單獨的組分。
13. 根據權利要求8-12中任一項所述的培養基，所述培養基進一步包含一種或多種 選自以下各項的培養基的常規組分：維生素、礦物質、氨基酸、緩沖鹽、微量元素、核苷、核苷 酸、植物激素、糖、抗生素和蛋白質水解產物。
14. 根據權利要求8-13中任一項所述的培養基，所述培養基進一步包含一種或多種來 自小麥、大豆、棉花或豌豆蛋白的水解產物。
15. 根據權利要求8-14中任一項所述的培養基，其中，所述C2_C6 α -羥基酸選自乳酸、 L-3-苯基乳酸、檸檬酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、α-羥 基異戊酸、羥基異己酸和三羥基丁酸。
16. 根據權利要求8-15中任一項所述的培養基，其中，所述氨基酸衍生物選自谷氨 酰基-酪氨酸、Υ -谷氨酰基-苯丙氨酸、環甘氨酰基-谷氨酸、纈氨酰基谷氨酸、5-氧代脯 氨酸和β-丙氨酸。
17. 根據權利要求8-16中任一項所述的培養基，其中，所述酚酸選自阿魏酸 ((Ε)-3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基）丙-2-烯酸）、丁香酸（4-羥基-3, 5-二甲氧基苯 甲酸）、香草酸（4-羥基-3-甲氧基苯甲酸）、芥子酸（3-(4-羥基-3, 5-二甲氧基苯基） 丙-2-烯酸），這些酸的酯或這些酸的鹽，優選阿魏酸、丁香酸，這些酸的酯或這些酸的鹽， 這些酸的鹽和這些酸的酯。
18. 根據權利要求8-17中任一項所述的培養基，所述培養基包含一種或多種選自以下 各項的化合物：手性-肌醇、赤蘚醇、蘇糖醇、山梨醇和葫蘆巴堿。
【文檔編號】C12N5/00GK104302759SQ201380024340
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年3月8日 優先權日:2012年3月8日
【發明者】阿希謝卡·古普塔, 米雷列·瑪麗亞·加德利亞, 多米尼克·伊夫·威利·馬埃斯 申請人:菲仕蘭產品有限公司