氨基酸的制造方法

文檔序號：467184閱讀：1001來源：國知局

氨基酸的制造方法
【專利摘要】通過在培養基中培養如下棒狀細菌，使選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸在培養物中生成并累積，并從該培養物中收集該氨基酸，由此可以高效地制造該氨基酸，在所述棒狀細菌中，通過向親株的染色體DNA上存在的編碼具有L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-鳥氨酸攝取活性的蛋白質的1個以上基因中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，并且所述棒狀細菌能夠生產該氨基酸。
【專利說明】氨基酸的制造方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種使用具有生成并累積選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的能力的棒狀細菌（coryneformbacterium)進行的該氨基酸的制造方法。

【背景技術】
[0002] 已知在氨基酸的發酵生產中，使氨基酸向細胞內的攝取活性降低或喪失時，可以防止排出到微生物的細胞外的氨基酸再次攝取到細胞內并被代謝，因此其生產率提高。
[0003] 例如，關于L-谷氨酸，報道了一種使用使L-谷氨酸向細胞內的攝取活性降低或喪失的谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum)的L-谷氨酸的制造方法（專利文獻 1)。另外，關于芳香族氨基酸，報道了一種使用使芳香族氨基酸向細胞內的攝取活性降低或喪失的谷氨酸棒桿菌的芳香族氨基酸的制造方法（專利文獻2)。
[0004] 作為具有氨基酸向細胞內的攝取活性的蛋白質，在大腸桿菌中，鑒定有3種L-精氨酸向細胞內的周質結合蛋白依賴型攝取蛋白質（非專利文獻1)。
[0005]在棒狀細菌中，報道了具有L-甲硫氨酸及L-丙氨酸（非專利文獻2)、L-谷氨酸 (非專利文獻3及非專利文獻4)、L-異亮氨酸（非專利文獻5)、芳香族氨基酸（非專利文獻6)、L-賴氨酸（非專利文獻7)等氨基酸向細胞內的攝取活性的蛋白質。
[0006] 然而，關于谷氨酸棒桿菌的NCgll278、NCgll277及NCgll276,在非專利文獻8中僅描述了，其分別被命名為BAB98725、BAB98724、BAB98723,并基于已知的氨基酸序列的同源性被分類為ATP結合盒（ABC)超家族，而未報道這些蛋白質具有氨基酸的攝取活性。另夕卜，也沒有通過使這些蛋白質的活性降低或喪失而使氨基酸的生產率提高這樣的報道。
[0007] 現有技術文獻
[0008] 專利文獻
[0009] 專利文獻1 :日本特開2000-270872號公報
[0010] 專利文獻2 :日本專利第3036819號公報
[0011] 非專利文獻
[0012] 非專利文獻 1:THEJOURNALOFMOLECULARBIOLOGY，2007 年，第 373 卷，P251 ? P267
[0013] 非專利文獻 2 :BI0CHEMISTRY，2008 年，第 47 卷，第 48 期，pl2698 ?pl2709
[0014] 非專利文獻 3:APPLLIEDMICROBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY，2003 年，第 60 卷，第 6 期，p738 ?p742
[0015] 非專利文獻4:THEJOURNALOFBACTERIOLOGY，1995年，第177卷，第5期，pll52? P1158
[0016] 非專利文獻 5ARCHIVESOFMICROBIOLOGY，1998 年，第 169 卷，第 4 期，p303 ? p312
[0017] 非專利文獻 6:THEJOURNALOFBACTERIOLOGY，1995 年，第 177 卷，第 20 期， p5991 ?p5993
[0018] 非專利文獻 7 :M0LECULARMICROBIOLOGY，1991 年，第 5 卷，第 12 期，p2995 ?p3005
[0019] 非專利文獻 8 :HANDB00KOFCORYNEBACTERIUMGLUTAMICUM，2005 年，pl65,由 L.EGGELING和M.B0IT編輯，CRCPRESS

【發明內容】

[0020] 發明所要解決的課題
[0021] 本發明的課題在于，通過使棒狀細菌的選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失而使該氨基酸的生產效率提高。
[0022] 用于解決課題的手段
[0023] 本發明涉及以下的（1)?（4)。
[0024] (1) -種選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的制造方法，其特征在于，在培養基中培養如下棒狀細菌，使選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及 L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸在培養物中生成并累積，并從該培養物中收集該氨基酸，在所述棒狀細菌中，通過向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由以下[1]?[6]組成的組中的蛋白質的1個以上基因中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，并且所述棒狀細菌能夠生產該氨基酸，
[0025] [1]具有序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質
[0026] [2]具有序列號3所示的氨基酸序列的蛋白質
[0027] [3]具有序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質
[0028] [4]由與序列號2所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構成，且具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質
[0029] [5]由與序列號3所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構成，且具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質
[0030] [6]由與序列號4所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構成，且具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質。
[0031] (2)如上述（1)所述的制造方法，其特征在于，通過向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由上述（1)的[1]?[6]組成的組中的蛋白質的1個以上基因中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產該氨基酸的棒狀細菌為向親株的染色體DNA上存在的選自由以下[7]?[9]組成的組中的DNA中引入了 1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加的棒狀細菌，
[0032] [7]具有序列號1所示的核苷酸序列的DNA
[0033] [8]與由與序列號1所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列構成的DNA在嚴格條件下雜交，且編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質的DNA
[0034] [9]由與序列號1所示的核苷酸序列具有80%以上一致性的核苷酸序列構成，且編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質的DNA。
[0035] (3)如上述⑴或⑵所述的制造方法，其中，棒狀細菌為谷氨酸棒桿菌。
[0036] (4)如上述（1)?⑶中任一項所述的制造方法，其中，氨基酸為L-精氨酸或L-瓜氨酸。
[0037] 發明效果
[0038] 根據本發明，提供一種使用如下棒狀細菌進行的選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及 L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的制造方法，所述棒狀細菌與親株相比選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，由此使該氣基酸的生廣率提商。

【具體實施方式】
[0039] 1.本發明中所使用的棒狀細菌
[0040] 本發明中所使用的棒狀細菌為向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由以下 [1]?[6]組成的組中的蛋白質的1個以上基因中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添力口，由此與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產該氨基酸的棒狀細菌，
[0041] [1]具有序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質
[0042] [2]具有序列號3所示的氨基酸序列的蛋白質
[0043] [3]具有序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質
[0044] [4]由與序列號2所示的氨基酸序列具有80%以上、優選90%以上、更優選95% 以上、進一步優選98%以上、特別優選99%以上一致性的氨基酸序列構成，且具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質
[0045] [5]由與序列號3所示的氨基酸序列具有80%以上、優選90%以上、更優選95% 以上、進一步優選98%以上、特別優選99%以上一致性的氨基酸序列構成，且具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質
[0046] [6]由與序列號4所示的氨基酸序列具有80%以上、優選90%以上、更優選95% 以上、進一步優選98%以上、特別優選99%以上一致性的氨基酸序列構成，且具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質。
[0047] 另外，作為本發明中所使用的棒狀細菌，可以舉出向親株的染色體DNA上存在的選自由以下[7]?[9]組成的組中的DNA中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相比，該氨基酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產該氨基酸的棒狀細菌，
[0048] [7]具有序列號1所示的核苷酸序列的DNA
[0049] [8]與由與序列號1所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列構成的DNA在嚴格條件下雜交，且編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質的DNA
[0050] [9]由與序列號1所示的核苷酸序列具有80%以上、優選90%以上、更優選95% 以上、進一步優選98%以上、特別優選99%以上一致性的核苷酸序列構成，且編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質的DNA。
[0051] 由序列號2、3和4所示的氨基酸序列構成的蛋白質分別由由序列號1的301? 1164、1312?2157和2173?2925所示的核苷酸序列構成的DNA編碼。
[0052] 在本說明書中，基因是指除蛋白質的編碼區以外可以含有轉錄調控區及啟動子區等的DNA。
[0053] 作為轉錄調控區，可以舉出自染色體DNA上的編碼區的5'末端起由上游側100個核苷酸、優選50個核苷酸構成的DNA，作為啟動子區，可以舉出對應于-10及-35區的區域。
[0054] 與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產該氨基酸的棒狀細菌可以舉出：通過向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質的1個以上基因中或選自由上述[7]?[9]組成的組中的DNA中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加而得到的（a)與親株相比，由該基因或該DNA編碼的蛋白質的比活性降低到80%以下、優選50% 以下、更優選30%以下、進一步優選20%以下、特別優選10%以下、最優選0%的棒狀細菌，及（b)與親株相比，該基因或該DNA的轉錄量、或者由該基因或該DNA編碼的蛋白質的生產量降低到80 %以下、優選50 %以下、更優選30 %以下、進一步優選20 %以下、特別優選10 % 以下、最優選〇%的棒狀細菌。更優選可以舉出該基因或該DNA的一部分或全部缺失的棒狀細菌。
[0055] 向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質的 1個以上基因或選自由上述[7]?[9]組成的組中的DNA中引入的1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加，只要是與親株相比使由該基因或該DNA編碼的蛋白質的攝取活性降低或喪失的1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加，則核苷酸的種類及數量就沒有限制，但是作為核苷酸的缺失，可以舉出啟動子及轉錄調控區中1個以上核苷酸、優選10個以上核苷酸、更優選20個以上核苷酸、進一步優選全部區域的缺失，編碼區中1個以上核苷酸、優選10 個以上核苷酸、更優選20個以上核苷酸、進一步優選100個以上核苷酸、特別優選200個以上核苷酸、最優選編碼區全部的缺失。
[0056] 作為1個以上的核苷酸的取代，可以舉出取代自編碼區的5'末端起第150個以內的核苷酸、優選第100個以內的核苷酸、更優選第50個以內的核苷酸、特別優選第30個以內的核苷酸、最優選第20個以內的核苷酸從而引入無義密碼子的取代。
[0057] 作為1個以上的核苷酸的添加，可以舉出緊接在自編碼區的5'末端起第150個以內的核苷酸、優選第100個以內的核苷酸、更優選第50個以內的核苷酸、特別優選第30個以內的核苷酸、最優選第20個以內的核苷酸之后添加1個以上核苷酸、優選50個以上核苷酸、更優選100個以上核苷酸、進一步優選200個以上核苷酸、特別優選500個以上核苷酸、最優選lkb以上的DNA片段，最優選可以舉出氯霉素抗性基因及卡那霉素抗性基因等的插入。
[0058] 在本說明書中，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性是指將選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸、優選L-精氨酸或L-瓜氨酸、更優選L-精氨酸從棒狀細菌的細胞外攝取到細胞內的活性。
[0059] 與親株相比該氨基酸的攝取活性降低可以通過如下來確認：利用Northern印跡分析或者RT-PCR對編碼選自由上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質的1個以上基因或選自由上述[7]?[9]組成的組中的DNA的轉錄物量進行定量，并與親株進行比較，或者利用 SDS-PAGE或使用抗體的測定法對由該基因或該DNA編碼的蛋白質的生產量進行定量，并與親株進行比較，等等。
[0060] 另外，在以該氨基酸為單一碳源在瓊脂培養基上培養時，根據一定時間后的菌落的直徑與親株相比小、或沒有生長，可以確認與親株相比該氨基酸的攝取活性降低或喪失。
[0061] 氨基酸序列或核苷酸序列的一致性可以使用Karlin和Altschul的算法 BLAST[PROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES，1993 年，第 90 卷，第 12 期， p5873 ?p5877]或FASTA[METH0DSINENZYM0L0GY，1990 年，第 183 卷，p63 ?p98]確定。基于該算法BLAST，開發了稱為BLASTN和BLASTX的程序[JOURNALOFMOLECULARBIOLOGY， 1990年，第215卷，p403?p410]。在基于BLAST利用BLASTN分析核苷酸序列的情況下，參數設為例如Score= 100、wordlength= 12。另外，在基于BLAST利用BLASTX分析氨基酸序列的情況下，參數設為例如score= 50、wordlength= 3。在使用BLAST和GappedBLAST 程序的情況下，使用各程序的默認參數。這些分析方法的具體方法是眾所周知的。
[0062] 上述所謂的"雜交"是指在特定的條件下DNA與具有特定核苷酸序列的DNA或該 DNA的一部分雜交。因此，該具有特定核苷酸序列的DNA或該DNA的一部分的核苷酸序列作為Northern印跡分析或Southern印記分析的探針是有用的，或者可以為具有能夠用作 PCR分析的寡核苷酸引物的長度的DNA。作為用作探針的DNA，可以舉出至少100個以上核苷酸、優選200個以上核苷酸、更優選500個以上核苷酸的DNA，但是可以為至少10個以上核苷酸、優選15個以上核苷酸的DNA。
[0063] DNA的雜交實驗的方法是眾所周知的，可以按照例如分子克隆第2版、第3版 (2001 年），METHODSFORGENERALANDMOLECULARBACTERI0LGY，ASMPRESS(1994 年），或 IMMUNOLOGYMETHODSMANUAL，ACADEMICPRESS(MOLECULAR)中的記載，以及大量其它的標準教科書確定雜交的條件而進行實驗。
[0064] 另外，也可以通過按照市售的雜交試劑盒附帶的說明書獲得在嚴格條件下雜交的 DNA。作為市售的雜交試劑盒，可以舉出例如利用隨機引物法制作探針，并在嚴格條件下進行雜交的隨機引物DNA標記試劑盒（RocheDiagnostics公司制）等。
[0065] 上述的嚴格條件可以舉出例如將固定有DNA的過濾器和探針DNA在42°C下在含有 50%甲酰胺、5XSSC(750mM的氯化鈉、75mM的檸檬酸鈉）、50mM的磷酸鈉（pH7. 6)、5X鄧哈特（Denhardt)溶液、10%的硫酸右旋糖苷、及20iig/L的改性鮭魚精子DNA的溶液中培養一晚，然后在例如約65°C的0. 2XSSC溶液中清洗該過濾器的條件。
[0066] 上述的各種條件也可以通過添加或改變用于抑制雜交實驗的背景的阻斷試劑來設定。為了使條件適合，上述阻斷試劑的添加可以伴隨雜交條件的改變。
[0067] 作為能夠在上述嚴格條件下雜交的DNA，可以舉出例如在使用上述BLAST及FASTA 等程序基于上述參數計算時，由與序列號1所示的核苷酸序列具有至少80%以上、優選 90%以上、更優選95%以上、進一步優選98%以上、特別優選99%以上一致性的核苷酸序列構成的DNA。
[0068] 在本說明書中，親株是指作為基因改造及轉化等的對象的原株。作為通過基因引入進行轉化的對象的原株也稱為宿主株。
[0069] 能夠生產該氨基酸是指在培養基中培養本發明中所使用的棒狀細菌時，具有達到能夠從細胞或培養基中回收該氨基酸的程度的生產該氨基酸能力。
[0070] 作為能夠生產該氨基酸的棒狀細菌，在親株原本具有該性質的情況下，可以舉出強化了該性質的棒狀細菌；在親株不具有該性質的情況下，可以舉出人工賦予了該性質的棒狀細菌。
[0071] 作為本發明中所使用的棒狀細菌，可以舉出屬于棒桿菌（Corynebacterium)屬、短桿菌（Brevibacterium)屬或微桿菌（Microbacterium)屬的棒狀細菌。
[0072] 作為屬于棒桿菌屬的微生物，可以舉出：谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)、嗜乙醜乙酸棒桿菌（Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumacetoglutamicum)、帚石南棒桿菌（Corynebacteriumcallunae)、力士棒桿菌（Corynebacteriumherculis)、百合棒桿菌（Corynebacteriumlilium)、棲糖蜜棒桿菌（Corynebacteriummelassecola)、嗜熱產氨棒桿菌（Corynebacterium thermoaminogenes)等，具體而言，可以舉出：谷氨酸棒桿菌ATCC13032、谷氨酸棒桿菌 ATCC13060、谷氨酸棒桿菌ATCC13826(舊屬種黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum))、谷氨酸棒桿菌ATCC14020(舊屬種叉開短桿菌（Brevibacteriumdivaricatum))、谷氨酸棒桿菌ATCC13869(舊屬種乳糖發酵短桿菌（Brevibacteriumlactofermentum))、嗜乙醜乙酸棒桿菌ATCC13870、醋谷氨酸棒桿菌ATCC15806、帚石南棒桿菌ATCC15991、力士棒桿菌 ATCC13868、百合棒桿菌ATCC15990、棲糖蜜棒桿菌ATCC17965、嗜熱產氨棒桿菌ATCC9244 等。
[0073] 作為屬于短桿菌屬的微生物，可以舉出：解糖短桿菌（Brevibacterium saccharolyticum)、未成熟短桿菌（Brevibacteriumimmariophilum)、玫瑰色短桿菌 (Brevibacteriumroseum)、生硫短桿菌（Brevibacteriumthiogenitalis)等，具體而言，可以舉出：解糖短桿菌ATCC14066、未成熟短桿菌ATCC14068、玫瑰色短桿菌ATCC13825、生硫短桿菌ATCC19240等。
[0074] 作為屬于微桿菌屬的微生物，可以舉出嗜氨微桿菌（Microbacterium ammoniaphilum)等，具體而言，可以舉出嗜氨微桿菌ATCC15354等。
[0075] 2.本發明中所使用的棒狀細菌的制造方法
[0076] 本發明中所使用的棒狀細菌可以通過向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質的1個以上基因中或選自由上述[7]?[9]組成的組中的DNA中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加，并選擇出由此選自由L-精氨酸、 L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的生產量與親株相比提高了的棒狀細菌來制造。
[0077] 向親株的染色體DNA上存在的基因中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加只要是通常的突變處理法、利用重組DNA技術等的基因置換法、細胞融合法或者轉導法等可以向棒狀細菌的染色體DNA中引入突變的方法就沒有限定。
[0078] 親株只要是具有生產該氨基酸的能力、且具有該氨基酸的攝取活性的棒狀細菌，則可以是野生株，也可以是由該野生株通過人工育種而得到的育種株。
[0079] 作為人工賦予棒狀細菌生成該氨基酸的能力的方法，可以舉出：
[0080] (a)緩解或消除控制該氨基酸的生物合成的至少一種機制的方法、
[0081] (b)強化表達參與該氨基酸的生物合成的至少一種酶的方法、
[0082] (c)增加參與該氨基酸的生物合成的至少一種酶基因的拷貝數的方法、
[0083] (d)弱化或阻斷由該氨基酸的生物合成路徑分支到該目標物質以外的代謝產物的至少一個代謝路徑的方法、及
[0084](e)選擇與野生型株相比對該氨基酸的類似物的抗性度高的細胞株的方法，等；
[0085] 上述公知的方法可以單獨或組合使用。
[0086] 關于利用上述（a)?（e)中任一者或組合的方法制備具有生產該氨基酸的能力的棒狀細菌的方法，在Biotechnology第二版，第6卷，ProductsofPrimary Metabolism(VCHVerlagsgesellschaftmbH,ffeinheim, 1996)section14a, 14b 或AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,79, 1-35 (2003), Agric.Biol.Chem.，51，2089-2094(1987)、氨基酸發酵、學會出版中心、相田浩等（1986)中記載有大量的例子，另外，除上述以外，具體的制備具有生產氨基酸的能力的棒狀細菌的方法在日本特開2003-164297、Agric.Biol. Chem.，39, 153-160 (1975)、Agric.Biol.Chem.，39, 1149-1153 (1975)、日本特開昭 58-13599、J.Gen.Appl.Microbiol.，4, 272-283 (1958)、日本特開昭 63-94985、八81^。.81〇1. Chem.，37, 2013-2023 (1973)、W097/15673、日本特開昭 56-18596、日本特開昭 56-144092、日本特表2003-511086及W02006/001380等中也有大量的報道，可以通過參照上述文獻等制備具有生產該氨基酸的能力的棒狀細菌。
[0087] 作為可以通過上述方法制備的具有生產L-精氨酸的能力的棒狀細菌，可以舉出例如：賦予了D-精氨酸抗性及精氨酸氧肟酸抗性的谷氨酸棒桿菌[AGRICULTURALAND BIOLOGICALCHEMISTRY，1972 年，第 36 卷，第 10 期，pl675 ?pl684]、引入了使argR基因缺失的突變的谷氨酸棒桿菌[日本特開2002-51790號]。
[0088] 作為具有生產L-鳥氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸的能力的棒狀細菌，可以舉出例如通過賦予引起arg操縱子的去抑制這樣的使argR基因缺失的突變和引起乙酰谷氨酸激酶的脫敏這樣的argB基因突變，從而使L-鳥氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸的生產率提高的谷氨酸棒桿菌[W2006/035831 ;及APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，2009 年，第 75 卷，第 6 期，pl635 ?pl641]。
[0089] 作為可以用于制備上述具有生產氨基酸能力的棒狀細菌的棒狀細菌，只要是可以應用上述（a)?（e)的方法的棒狀細菌或具有上述遺傳性狀的棒狀細菌就可以為任一者，可以優選舉出上述的屬于棒桿菌（Corynebacterium)屬、短桿菌（Brevibacterium)屬或微桿菌（Microbacterium)屬的棒狀細菌。
[0090] 作為突變處理法，可以舉出例如：使用N-甲基-N' -硝基-N-亞硝基胍（NTG)的方法（微生物實驗手冊，1986年，131頁，講談社科技公司）、紫外線照射法等。
[0091] 作為利用重組DNA技術向編碼選自由上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質的1個以上基因或選自由上述[7]?[9]組成的組中的DNA中引入1個以上的核苷酸的取代、缺失或添加的基因置換法，可以舉出利用同源重組等將該基因整合到親株的染色體中，進而利用同源重組等置換染色體上本來存在的該基因的方法。
[0092] 作為向該基因中引入1個以上的核苷酸的取代、缺失或添加的方法，除此以夕卜，還可以舉出根據Molecularcloning:alaboratorymanual,第三版，Cold SpringHarborLaboratoryPress(2001)[以下簡稱為分子克隆第 3 版]，Current ProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons(1987_1997)(以下簡稱為當代分子生物學實驗指南），NucleicAcidsResearch, 10, 6487 (1982),Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 79, 6409 (1982),Gene, 34, 315 (1985),NucleicAcidsResearch, 13, 4431 (1985), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82, 488 (1985)等中記載的位點特異性誘變法的方法。
[0093]利用重組DNA技術的基因置換可以按照J.Bacteriol.，182, 6884(2000)等中記載的方法進行。
[0094] 通過將引入了突變的基因插入至適當的質粒載體等中來制作重組體質粒。作為質粒載體，可以使用例如在親株中無法自主復制，且具有對抗生素的抗性標記基因及枯草桿菌的果聚糖鹿糖酶基因sacB[Mol.Microbiol.，6, 1195 (1992)]的質粒。
[0095] 作為將該重組體質粒引入親株的方法，只要是可以將DNA引入棒狀細菌的方法就都可以使用，可以舉出例如：電穿孔法[Appl.Microbiol.Biotech.，52, 541 (1999)]、原生質體法[J.Bacteriol.，159, 306 (1984)]等。
[0096] 該重組體質粒由于在親株中無法自主復制，因此，可以通過獲得對與該重組體質粒具有的抗生素抗性標記對應的抗生素顯示抗性的菌株，來獲得該重組體質粒整合到染色體中而得到的轉化株。
[0097] 另外，可以通過利用與引入了突變的基因一同整合到染色體上的枯草桿菌果聚糖蔗糖酶生產自殺底物的選擇法[J.Bacteriol.，174, 5462 (1992)]，來獲得親株的染色體上的該基因被引入了突變的基因置換的菌株。
[0098] 可以通過以上的方法進行親株的染色體上的基因置換，但不限于上述的方法，只要是能夠置換棒狀細菌的染色體上的基因的方法就也可以使用其它的基因置換法。
[0099] 作為向親株的染色體上的基因中引入取代、缺失或添加的方法，除此以外還可以舉出細胞融合法、轉導法，可以舉出例如相田浩等人編"氨基酸發酵"，1986年，學會出版中心中記載的方法等。
[0100] 引入突變的核苷酸的數量及位點如上述1中所記載。
[0101] 通過向親株的染色體上的基因中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加可以以高概率使該基因編碼的蛋白質的活性降低或喪失[AnIntroductiontoGenetic Analysis，第 7 版，GriffithsAJF、MillerJH、SuzukiDT等人.NewYork:W.H.Freeman; 2000]。
[0102] 編碼上述[1]?[6]的蛋白質的基因可以通過例如將由屬于棒狀細菌的微生物按照齊藤等人的方法[BIOCHIMICAETBI0PHYSICAACTA，1963 年，第 72 卷，p619 ?p629]制備的染色體DNA用作模板，將基于序列號1的2173?2925、序列號1的1312?2157或序列號1的301?1164所示的核苷酸序列設計、合成的寡DNA用作引物并利用PCR而獲得。
[0103] 作為可獲得的具體的基因，可以舉出：具有序列號1的2173?2925所示的核苷酸序列的NCgll276、具有序列號1的1312?2157所示的核苷酸序列的NCgll277及具有序列號1的301?1164所示的核苷酸序列的NCgll278等。
[0104] 需要說明的是，在2個以上基因在染色體上相鄰或包含在操縱子DNA中的情況下，該2個以上基因也可以通過例如將基于序列號1所示的核苷酸序列設計、合成的寡DNA用作引物并利用PCR以1個DNA的形式獲得。
[0105] 另外，通過以上述的DNA的一部分或全部為探針的雜交法、或利用公知的方法化學合成具有該核苷酸序列的DNA的方法等也可以獲得。
[0106] 另外，對各種基因序列數據庫檢索與編碼序列號2、序列號3或序列號4所示的氨基酸序列的DNA的核苷酸序列具有85 %以上、優選90 %以上、更優選95 %以上、進一步優選 98%以上、特別優選99%以上同源性或一致性的序列，并基于通過該檢索所得到的核苷酸序列由具有該核苷酸序列的生物的染色體DNA、cDNA文庫等通過上述的方法也可以獲得。
[0107] DNA的核苷酸序列可以通過使用通常所使用的核苷酸序列的分析方法，例如雙脫氧法[PROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES，1977 年，第 74 卷，第 12 期， p5463?p5467]、373ADNA序列分析儀（Perkinelmer公司制）等核苷酸序列分析裝置進行分析來確定。
[0108] 在確定核苷酸序列的結果是所獲得的DNA為部分長度DNA的情況下，可以通過將該部分長度DNA用作探針的針對染色體DNA文庫的Southern雜交法等獲得全長DNA。
[0109] 氨基酸向細胞內的攝取活性的測定可以根據THEJOURNALOFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1971年，第246卷，第11期，p3653?p3662中所記載的方法進行。
[0110] 利用以上的方法可以制備本發明的制造方法中所使用的棒狀細菌。
[0111] 3.本發明的L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸的制造方法
[0112] 在培養基中培養可以通過上述的方法制備的棒狀細菌，使選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸在培養物中生成、累積，并從該培養物中收集該氨基酸，由此可以制造該氨基酸。
[0113] 本發明的制造方法中所使用的培養基只要含有碳源、氮源、無機鹽等本發明的微生物的增值、以及選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的氨基酸的生物合成所需要的營養物質，則可以為合成培養基、天然培養基中的任一者。
[0114] 作為碳源，只要是使用的微生物能夠同化的碳源就可以為任意一種，可以舉出例如：葡萄糖、糖蜜、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉水解物等糖類；乙醇、甘油等醇類；醋酸、乳酸、琥珀酸等有機酸類等。
[0115] 作為氮源，可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、醋酸銨等各種無機及有機銨鹽類；尿素、胺等氮化合物；以及肉提取物、酵母提取物、玉米漿、蛋白胨、大豆水解物等含氮有機物。
[0116] 作為無機鹽，可以使用磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、碳酸f丐等。
[0117] 此外，可以根據需要加入生物素、硫胺、煙酰胺、煙酸等微量營養源。這些微量營養源也可以用肉提取物、玉米漿、酪蛋白氨基酸等培養基添加物替代。另外，可以根據需要添加本發明的微生物生長所需要的物質（例如如果是氨基酸營養缺陷型微生物則為所需要的氨基酸）。
[0118]培養在震蕩培養、深部通氣攪拌培養等好氧條件下進行。培養溫度為20?50°C，優選為20?42°C，更優選為28?38°C。培養基的pH保持在5?11的范圍、優選6?9的中性附近的范圍進行培養。培養基的pH的調節使用無機或有機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨、pH緩沖液等進行。
[0119] 培養時間為5小時?6天，優選為16小時?3天。
[0120] 在培養物中累積的該氨基酸可以通過通常的純化方法來收集。例如L-精氨酸可以通過在培養后，利用離心分離等除去菌體及固體物質，然后組合使用活性炭處理、離子交換樹脂處理、濃縮、結晶分離等公知的方法來收集。
[0121] 下面示出本申請發明的實施例，但本發明并不限定于這些實施例。
[0122] 實施例1
[0123] (1)基因破壞用質粒的構建
[0124] 將具有賦予對卡那霉素的抗性的基因的質粒pHSG299[GENE，1987年，第61卷， p63?p74]用限制酶PstI消化，在切斷位點連接含有源自Bacillussubtilisl68株的果聚糖蔗糖酶基因sacB的2.6千堿基（以下簡稱為kb)的DNA片段[MOLE⑶LAR 100?081011?￥，1992 年，第6卷，第9期，？1195?口1202]，從而得到質粒？￡3830。
[0125] 將pESB30用限制酶BamHI消化，萃取純化后，將該DNA片段的兩末端使用DNA平端化試劑盒〇NA blunting kit、Takara Bio公司制）按照所附的方法進行平滑化。使平滑化的DNA片段在Taq聚合酶（Boehringer Mannheim公司制）及dTTP存在下在70°C反應2小時，在3'末端添加胸腺嘧啶1個堿基，從而制備可以用于PCR片段克隆的DAN片段 PESB30-T。
[0126] (2)argF基因破壞株生成用質粒的構建
[0127] 以谷氨酸棒桿菌ATCC13032株的染色體DNA為模板，以由序列號5所示的核苷酸序列構成的DNA和由序列號6所示的核苷酸序列構成的DNA為引物組，使用PfuturboDNA 聚合酶（Stratagene公司制）及所附的緩沖劑進行PCR。將通過PCR而得到的約1. 4kb的 DNA片段用BamHI消化，然后進行萃取純化。
[0128] 將該DNA片段和預先利用BamHI消化的pUCl19(TakaraBio公司制）混合，使用 DNA連接反應試劑盒（TakaraBio公司制），進行DNA連接酶反應。使用該反應產物根據分子克隆第3版中記載的方法轉化大腸桿菌DH5a株（東洋紡公司制）。
[0129] 由該轉化體根據堿SDS法（分子克隆第3版中記載的方法）制備質粒。將該質粒利用Ncol消化后，通過進行DNA連接酶反應使其自環化，然后轉化大腸桿菌DH5a株（東洋紡公司制），與上述同樣地制備質粒。
[0130] 對該質粒的結構通過多種限制酶消化模式進行研究，結果確認，該質粒在編碼 argF的DNA中含有缺失369堿基對的DNA片段。將該質粒用作模板，將由序列號5所示的核苷酸序列構成的DNA及由序列號6所示的核苷酸序列構成的DNA用作引物組，進行PCR，從而得到約l.Okb的DNA片段。使該DNA片段在TaqDNA聚合酶（BoehringerMannheim 公司制）及dATP存在下在72°C反應10分鐘，在3'末端添加腺嘌呤1個堿基。
[0131] 將該DNA片段和前面生成的pESB30-T混合，進行DNA連接酶反應。使用該反應產物轉化大腸桿菌DH5ci株（東洋紡公司制）從而由所得到的轉化體制備質粒。將該質粒命名為pEargF。
[0132] (3)argF基因破壞株的制備
[0133] 使用如上制備的質粒pEargF，根據Rest等人的方法[APPLLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，1999年，第52卷，第4期，p541?p545]利用電穿孔法轉化缺失轉座子的谷氨酸棒桿菌ATCC13032株（以下稱為D0I-3株），并選擇卡那霉素抗性株。
[0134] 制備該卡那霉素抗性株的染色體DNA，利用Southern雜交（分子克隆第3版）進行研究，結果確認，pEargF通過Campbell類型的同源重組而被整合。
[0135] 在這樣的菌株中，含有染色體上本來存在的argF基因的區域和具有其中pEargF 上缺失了argF基因的結構的區域相鄰存在，在其之間容易發生第2次的同源重組。
[0136] 由于_基因編碼的果聚糖蔗糖酶使蔗糖成為自殺底物，因此，具有_基因的微生物在含有蔗糖的培養基中無法生長。但是，在含有染色體上本來存在的argF基因的區域和具有其中pEargF上缺失了argF基因的結構的區域之間發生了第2次同源重組的菌株中，任一DNA區域均與一同脫落缺失，因此，該菌株在含有蔗糖的培養基中也可以生長。這樣可以得到具有缺失了染色體DNA上本來存在的argF基因的結構的微生物。
[0137] 利用這個將上述轉化株涂布在蔗糖瓊脂培養基[在水1L中含有100g蔗糖、7g肉提取物、l0g蛋白胨、3g氯化鈉、5g酵母提取物（Difco公司制）、及15g細菌培養用瓊脂 (Difco公司制）的調節為pH7. 2的培養基]上，在30°C下培養1天并選擇生長的菌落。將該菌株命名為D0I-3argF株。
[0138] ⑷argF基因破壞株的營養缺陷型的確認
[0139] D0I_3argF株在argF基因內具有缺失，因此為L-瓜氨酸及L-精氨酸營養缺陷型。這根據D0I-3argF株在基本培養基中不生長，但是在基本培養基中添加了 50mg/L的L-精氨酸或50mg/L的L-瓜氨酸的培養基中生長得到確認。
[0140] 實施例2
[0141] (l)NCgll278基因破壞株生成用質粒的構建
[0142] 以谷氨酸棒桿菌ATCC13032株的染色體DNA為模板，以由序列號7所示的核苷酸序列構成的DNA和由序列號8所示的核苷酸序列構成的DNA為反應1的引物組，以由序列號9所不的核苷酸序列構成的DNA和由序列號10所不的核苷酸序列構成的DNA為反應2 的引物組，獨立地進行反應1和反應2的PCR。
[0143] 將通過PCR所得到的約1. Okb的DNA片段萃取、純化。以由反應1所得到的DNA 片段和由反應2所得到的DNA片段為模板DNA，以由序列號7所示的核苷酸序列構成的DNA 和由序列號10所示的核苷酸序列構成的DNA為反應3的引物組，進行PCR。將通過PCR所得到的約1. 〇kb的DNA片段純化，用限制酶Fbal消化，并再次純化。
[0144] 將該DNA片段和預先利用限制酶BamHI消化并利用堿性磷酸酶（TakaraBio公司制）脫磷酸化的PESB30混合，進行DNA連接酶反應。用該反應產物轉化大腸桿菌DH5a株 (東洋紡公司制），并由該轉化株制備質粒。將該質粒命名為pdell278。
[0145] (2)argF及NCgl1278基因破壞株的制備
[0146] 使用制備的質粒pdell278,與實施例1同樣地利用電穿孔法轉化D0I_3argF株，從而得到卡那霉素抗性株。下面，使用與實施例1中所記載的方法同樣的方法制備其中 NCgll278的0RF缺失的菌株，將其命名為D0I-3argF_Dell278株。
[0147] (3)NCgll278基因產物的L-瓜氨酸及L-精氨酸攝取活性的確認
[0148] 如表1所示，D0I-3argF_Dell278株在含有50mg/L的L-精氨酸的基本培養基瓊脂板上或含有50mg/L的L-瓜氨酸的基本培養基瓊脂板上不生長，在含有50mg/L的丙氨酰精氨酸的基本培養基瓊脂板上生長，因此結論是NCgl1278為編碼參與L-精氨酸及L-瓜氨酸向細胞內的攝取的蛋白質的基因。
[0149] 在非專利文獻8中，描述了NCgll278與作為緊接在下游的2個基因的由序列號1 的1312?2157所示的核苷酸序列構成的NCgl1277、由序列號1的2173?2925所示的核苷酸序列構成的NCgll276 -同分類為ATP結合盒（ABC)超家族。
[0150] 由此啟示，NCgl1276、NCgl1277及NCgl1278的基因產物構成分類為ATP結合超家族的轉運蛋白，并參與L-精氨酸及L-瓜氨酸向細胞內的攝取活性。
[0151] [表 1]
[0152]

【權利要求】
1. 一種選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的制造方法，其特征在于，在培養基中培養如下棒狀細菌，使選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸在培養物中生成并累積，并從該培養物中收集該氨基酸，在所述棒狀細菌中，通過向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由以下[1]?[6]組成的組中的蛋白質的1個以上基因中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相 t匕，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，并且所述棒狀細菌能夠生產該氨基酸， [1] 具有序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質 [2] 具有序列號3所示的氨基酸序列的蛋白質 [3] 具有序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質 [4] 由與序列號2所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構成，且具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質 [5] 由與序列號3所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構成，且具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質 [6] 由與序列號4所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構成，且具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質。
2. 如權利要求1所述的制造方法，其特征在于，通過向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由權利要求1的[1]?[6]組成的組中的蛋白質的1個以上基因中引入1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產該氨基酸的棒狀細菌為向親株的染色體DNA上存在的選自由以下[7]?[9]組成的組中的DNA中引入了 1個以上的核苷酸的缺失、取代或添加的棒狀細菌， [7] 具有序列號1所示的核苷酸序列的DNA [8] 與由與序列號1所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列構成的DNA在嚴格條件下雜交，且編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質的DNA [9] 由與序列號1所示的核苷酸序列具有80%以上一致性的核苷酸序列構成，且編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質的DNA。
3. 如權利要求1或2所述的制造方法，其中，棒狀細菌為谷氨酸棒桿菌。
4. 如權利要求1?3中任一項所述的制造方法，其中，氨基酸為L-精氨酸或L-瓜氨酸。
【文檔編號】C12N15/09GK104271754SQ201380019752
【公開日】2015年1月7日申請日期:2013年4月12日優先權日:2012年4月13日
【發明者】三橋敏申請人:協和發酵生化株式會社

完整全部詳細技術資料下載