用于從衍生自多能干細胞的細胞培養物中分離神經元的細胞表面特征物的制作方法

用于從衍生自多能干細胞的細胞培養物中分離神經元的細胞表面特征物的制作方法
【專利摘要】諸位發明人披露了提供用于直接從異質細胞培養物分離并純化神經元的多種方法和系統。在多能干細胞中檢查了各種細胞粘附分子的表達。這些分子中的一個或多個的表達變化與從非定向到神經細胞的細胞進展相關聯。與針對CD200具有特異性的抗體相結合，使用針對這些分子的一種或多種抗體將使得能夠從細胞群體中識別并分離神經元。
【專利說明】用于從衍生自多能干細胞的細胞培養物中分離神經元的細 胞表面特征物
[0001] 相關申請的交叉引用 根據美國法典第35部分119(e)條，本申請要求在2012年5月16日提交的美國臨時專 利申請序列號為61/647, 951的申請日的優先權，將該申請的披露內容通過引用結合在此。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及用于分離神經元的多種方法和組合物。
[0003] 發明背景
[0004] 人類胚胎干細胞（hESC)和人類誘導性多能干細胞（hiPSC)兩者都具有分化成多 種體細胞的能力。因而hESC和hiPSC的分化給醫療發展、藥物篩選、疾病模型、以及組織置 換提供了契機。然而，開發完善的條件來產生特定細胞類型的單純群體對實現這些目標至 關重要。存在若干神經誘導方法，這些方法使用自發分化、化學誘導、或者小鼠基質飼養細 胞來誘導細胞培養物形成神經干細胞（NSC)。NSC可以通過人工分離與繁殖作為單層培養 延續很多代。原則上，這些細胞可以分化成神經元和神經膠質，為體內和體外試驗無限供給 細胞。令人遺憾的是這些方法的穩健性會受到分離的NSC的批次間變異性的妨礙。此外， NSC的分化經常導致變異的和異質的神經元、神經膠質以及未分化的細胞的培養物，其能夠 阻礙需要純化或者界定細胞群體的下游應用，例如體內試驗、移植、以及微型陣列。針對該 問題的一個可能的解決方案是識別在NSC、神經膠質、以及神經元上表達的細胞表面標志物 從而界定和純化不同的細胞類型。
[0005] 已描述了細胞表面標志物表達用于通過熒光激活細胞分選法（FACS)從來自多個 物種的胚胎和成人組織識別和分離許多神經細胞類型。糖蛋白CD133在很多組織中是一種 已知的干/祖細胞標志物，并且已經被用于從人腦中分離NSC。碳水化物部分CD15,也被稱 為階段特異性胚胎抗原-1或者LeX，已經被用于從小鼠腦室下區（SVZ)中分離NSC和放射 狀膠質細胞。⑶184, 一種G蛋白偶聯受體，通過結合⑶15被成功地用于從小鼠胚胎前腦和 成體SVZ中分離NSC。⑶24是一種細胞粘附分子，其已經被用于通過FACS從小鼠大腦中分 離NSC。另外，已經使用神經干細胞標志物的基因啟動子-報告子從人類大腦組織分離出神 經干細胞和神經祖細胞。
[0006] 同樣地，通過FACS識別和分離hESC來源的神經細胞也有了進展。普路扎克 (Pruszak)等人（干細胞（Stem Cells) 25 :2257-2268, 2007)報告稱可以利用細胞表面標志 物在不同發育階段測驗分化成為神經系的hESC培養物，并且可以使用CD56 (NCAM)的抗體 富集神經元細胞。⑶1847⑶326-標志物已經被用于從分化中的hESC純化能夠分化成神經 元的神經祖細胞。另外，佩赫（Peh)等人（干細胞與發育（Stem Cells Dev) 18:269-282， 2009)報告了基于⑶133,⑶15和GCTM-2的表達，自hESC神經誘導培養物富集形成神經球 的NSC。運用類似的策略，戈萊比瓦斯卡（Golebiewska)等人（干細胞27 :1298-1308, 2009) 曾使用⑶133+/⑶457⑶3407人分化中的hESC中分離NSC。普路扎克等人（2009)論證了 ⑶24,⑶15和⑶29作為表面標志物密碼的用途，用于從hESC神經誘導培養物分離不同細 胞群體，包括NSC，以及成神經細胞和神經元的混合群體。
[0007] 袁（Yuan)等人（公共科學圖書館?綜合（PLoS One. )2011. 03. 02 ;6 (3) :el7540) 描述了基于細胞表面特征物通過FACS分離多能干細胞的神經干細胞（NSC)、神經分化培養 物的方法，將其通過引用結合在此。這些方法被用于從hESC神經誘導培養物以及人類誘導 性多能干細胞（hiPSC)中分離一個為⑶1847⑶27Γ/⑶447⑶24+的NSC群體。基于細胞表 面特征物的方法還被用于富集來自多種常見神經誘導培養系統的NSC。袁等人還確定了細 胞表面特征物，用于從分離的NSC培養物的分離培養物中分離神經元和神經膠質。隨后，一 個為⑶1847⑶447⑶15低（LOW) /⑶24+的神經元群體和一個為⑶184 7⑶44+的神經膠質 群體從分化中的NSC分離培養物中被純化。BD Stemflow?神經細胞分離試劑盒（BD生物 科學公司（BD Biosciences)，圣何塞，加州）是一種被設計成允許從分化的NSC中分離衍 生自人類多能干細胞的神經干細胞（NSC)或者神經元和神經膠質細胞的試劑盒。該方法與 像人工分離這樣的傳統方法截然相反，其降低了 NSC分離群之間的變異量，但是需要在神 經元在培養物中分離和富集之前誘導和分離NSC。需要用于提供對衍生自異質細胞群體的 神經元的識別和分離，并且減少神經元識別、分離和富集所涉及步驟的方法。
[0008] 概述
[0009] 本發明提供了用于從異質群體細胞中分離或富集神經元的多種細胞表面特征物， 方法和系統。這些方法可以用于從一組新細胞表面蛋白（細胞表面特征物）的表達模式中 識別神經元。本方法使得能夠分離或富集來自不同類型的細胞培養物的神經元，包括分化 中的多能干細胞（hPSC)的細胞培養物，例如人類誘導性多能干細胞（iPSC)和人類胚胎干 細胞（EPSC)，或者hPSC衍生的神經干細胞，以及已經被基因轉導而轉分化成神經元（誘導 神經元）的成纖維細胞培養物。
[0010] 在一些實施例中，提供了一種在一個包含神經元和神經膠質的細胞培養物中區分 神經元的方法，該方法包括用特異性結合到CD200的一個第一抗體和特異性結合到一個第 二蛋白的至少一個第二抗體接觸該細胞培養物，其中該第二蛋白選自下組，該組由以下各 項組成：HLA-A、HLA-B、HLA-C、（HLA-A、B、C)CD49f、CD151 和 CD340 或其任意組合；并且檢 測是^200+細胞的并且還展示出!11^-4、!11^-8、!11^-(：、^49廠^151和^340中的一個或 多個的低至陰性表達的細胞。在一些實施例中，該細胞培養物包括人類誘導性多能干細胞 (hiPSC)、人類胚胎干細胞（hEPSC)、成纖維細胞培養物、神經干細胞、神經上皮、神經玫瑰 結、神經祖細胞、或神經嵴細胞。在一些實施例中，該細胞培養物衍生自一個細胞異質混合 物。⑶200+細胞可以是⑶200巾等以及⑶200?并且不是⑶200?。在一些實施例中，該細胞 培養物包括不經歷一個神經干細胞富集步驟的神經玫瑰結。檢測細胞的步驟可以通過一個 流式細胞儀來進行。在一些實施例中，該第一和第二抗體是通過與一個熒光團的直接接合 可檢測地和可辨別地標記的，該熒光團是例如異硫氰酸熒光素、別藻藍素、多甲藻素葉綠 素蛋白、藻紅素、菁藍5或BV421。神經元可以通過分離或富集是⑶200 +#或⑶200s并且還 是HLA-A、B、C_，⑶49Γ，⑶15Γ或⑶340 _的細胞的細胞群體被分離或富集。在一些實施例 中，該在一個細胞培養物中富集神經元含量的方法包括在一個細胞培養物中誘導神經分化 從而形成神經元和神經膠質，用特異性結合到CD200的一個第一抗體和特異性結合到一個 第二蛋白的至少一個第二抗體接觸該細胞培養物，其中該第二蛋白選自下組，該組由以下 各項組成：HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151和⑶340,及其任意組合；并且流式細胞計數 地選擇是⑶200+細胞的并且還是HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151以及⑶340中的一個 或多個的陰性或低的細胞。在一些實施例中，從該神經玫瑰結直接誘導神經元形成。在一 些實施例中，是CD200+的細胞不是CD200 。在一些實施例中，該細胞培養物不經歷一個神 經干細胞富集步驟。該第一和第二抗體可以是通過與一個熒光團的直接接合可檢測地和可 辨別地標記的，該熒光團是例如異硫氰酸熒光素、別藻藍素、多甲藻素葉綠素蛋白、藻紅素、 BV421或菁藍5。在一些實施例中，富集神經元的含量包括用對于下組中的至少一個具有選 擇性的抗體接觸來自一個細胞培養物的細胞，從而形成一個抗體-細胞復合物，該組由以 下各項組成：HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、和⑶340,其中這些抗體被附接到可以被 一個磁場吸引或排斥的一個表面上；并且通過向這些細胞施加一個磁場從該細胞培養物選 擇性地分離所述抗體-細胞復合物。該富集可以大于4倍。
[0011] 在一些實施例中，一個細胞培養物與結合到⑶200的一個第一抗體和結合到 HLA-A，HLA-B或HLA-C的一個第二抗體（即HLA-A、B、C抗體）接觸，并且方法進一步包括 將該細胞培養物與包括⑶49f、⑶151或⑶340的一個第三抗體接觸并且針對是⑶200+和 HLA-A、B、或C_，并且還是⑶49Γ、⑶15Γ或⑶340 _的細胞進行選擇。在一些實施例中，描述 了一種用于從衍生自多能干細胞中分離或富集神經元的系統，該系統包括：特異性結合到 CD200的一個第一抗體；特異性結合到一種蛋白的至少一個第二抗體，該蛋白選自下組，該 組由以下各項組成：111^4、!11^-8、!11^-(：、^49廠^151和^340，及其任意組合 ；一個包含 神經元的細胞培養物和一個流式細胞儀，該流式細胞儀被配置成用于分選是CD200+并且還 是HLA-A\HLA-B'HLA-(T、CD49r、CD15r和CD34(T中的一個或多個的細胞。該第一和第二 抗體可以是熒光標記的抗體。在一些實施例中，該第二抗體可以是一種磁標記的抗體。
[0012] 在一個實施例中，用于識別在神經分化培養物中的神經元的細胞表面標志特征物 是⑶200的高效表達，例如⑶200++或者⑶200 s，這兩者在本文中可互換地使用以表明細胞 是⑶200+細胞并且具有高于平均⑶200信號的表達。在另一些實施例中，細胞可以通過排 除低效表達的CD200(CD200 is )細胞進行選擇。在一些實施例中，用于識別神經元的該細胞 表面標志特征物是 HLA-A7HLA-B7HLA-C7CD15l7CD49f7CD3407CD200+。在一些實施例中， 描述了一種用于在一個細胞群體中識別神經元的系統，該系統包括：特異性結合到CD200 的一個第一抗體；特異性結合到包括HLA-A、HLA-B、和HLA-C的一組蛋白中的至少一種上 的一個第二抗體；特異性結合到包括⑶49f、⑶151和⑶340的一組蛋白中的至少一種上的 一個第三抗體；一個細胞樣本；以及一個流式細胞儀，該流式細胞儀被配置成用于識別是 CD200+和 HLA-A、Β、(Γ，并且還是 0)49Γ、ΟΗ5Γ或 CD34(T的細胞。
[0013] 附圖簡要說明
[0014] 圖1描述了現有技術中用于神經膠質和神經元富集的細胞分選法。
[0015] 圖2示出了描述該發明的一個實施例中的步驟的流程圖。
[0016] 圖3闡明了本發明的一個實施例，是一種用于神經元富集的細胞分選法，該方法 無需富集神經干細胞（NSC)的中間步驟。
[0017] 圖4描述了一個流程圖，示出了一種免疫表型篩選途徑，該途徑用于識別一個用 來分離衍生自分化中的多能干細胞培養物中神經元的細胞表面特征物。
[0018] 圖5A和B描述了在圖4的篩選途徑中識別出的細胞內標志物和候選細胞表面標 志物的熒光譜。
[0019] 圖6闡明了用于識別神經元的門控策略，用來進行細胞分選。
[0020] 圖7示出了分選之前的神經分化培養物的影像，闡明了細胞培養物的異質性。
[0021] 圖8示出了使用本發明的細胞表面標志特征物分選自異質細胞培養物的神經元 的影像。
[0022] 圖9A示出了被分選的神經元針對神經元的標志物β -III微管蛋白以及NSC標志 物巢蛋白被染色的影像，其示出了這些細胞純度高。圖9Β示出了分選之前和之后的被分選 的神經元的培養物的半定量流分析。
[0023] 圖10A-D示出了一系列在已分化的神經元的流式細胞術分析期間生成的2D圖和 直方圖。
[0024] 圖IlA-D示出了在熒光激活細胞分選之前和之后一系列在已分化的神經元的流 式細胞術分析期間生成的2D圖。
[0025] 圖12Α-Ε示出了在磁損耗之前和之后一系列在已分化的神經元的流式細胞術分 析期間生成的2D圖和影像。
[0026] 詳細說明
[0027] 諸位發明人披露了提供用于分離并純化直接衍生自任何異質細胞群體（例如包 含神經玫瑰結的培養物）的神經元的多種方法和系統。該神經玫瑰結可以衍生自多種干細 胞群體，諸如誘導性多能干細胞（hiPSC)、胚胎干細胞（hESC)、或者成纖維細胞培養物。
[0028] 所述方法和系統以在多能干細胞、神經玫瑰結、神經上皮以及神經元中檢查各種 細胞粘附分子的表達譜為基礎。所研宄的分子之中，已經證明結合CD200的陽性選擇可以 陰性選擇!11^4、!11^-8、!11^-(：、^49廠^340或者^151中的一個或多個以識別、分離或者 富集來自一個細胞培養物的一個神經元群體。這些分子中的一個或多個的某些表達變化可 能與從非定向細胞到神經定向細胞的進展相關聯。在一些實施例中，與針對CD200的抗體 相結合，針對這些分子111^4、!11^-8、!11^-(：、^49廠^340或者^151的一種或多種抗體提 供來自多能干細胞的神經分化培養物的神經元的識別，分離和/或富集。針對HLA-A、HLA-B 以及HLA-C的抗體可以是一個單一抗體，其選擇性結合全部三種蛋白質，統稱為HLA-A、B、 Co
[0029] 本領域已知的以及對理解和實踐本發明可能有所幫助的定義和其他信息，包括 科學試驗報告以及試劑，提供在貫穿始終所引用的對比文件中，尤其是袁等人，"用于分 離神經干細胞，神經膠質以及衍生自人類多能干細胞的神經元的細胞表面標志特征物 (Cell-Surface Marker Signatures For The Isolation of Neural Stem Cells， Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells) "（公共科學圖書館?綜合 2011.03.02 ;6 (3) :el7540)，其中FACS和基于圖像的免疫表型分析采用細胞表面標志物的 抗體對天然人類胚胎干細胞（hESC)識別所預期的細胞表面特征物以用于從分離的神經干 細胞中分離神經膠質和神經元。
[0030] 圖1描述出了袁等人描述的從干細胞中誘導和分離神經元的現有技術方法的示 意圖。天然人類胚胎干細胞（hESC)群體通過用SMD抑制劑（例如：SB431542,頭蛋白）進 行處理而被培養和處理從而誘導神經玫瑰結形成。然后，在一個生長培養基中，用一組用于 識別和分離神經干細胞（NSC)的標志物將神經干細胞要么人工地要么流式細胞計數地從 這些細胞中分離出來。經過包含腦源性神經生長因子（BDNF)和膠質細胞源性神經營養因 子（GNDF)的神經元分化培養基處理后，所分選的NSC繁殖很多代并分化成神經元和神經膠 質的混合培養物。隨后，一個CD184+/CD447CD15is/CD24+的神經元群體和一個CD184+/CD44+ 的神經膠質群體從衍生自分離的NSC的培養物中被純化。
[0031] 圖2示出了本發明的一個實施例中的步驟，其中使用流式細胞術方法可以識別和 分離定向形成神經元的神經祖細胞，并且無需純化和分離神經干細胞。本發明的諸多方面 包括培養能夠進行神經分化（例如：多能干細胞（hiPSC)、人類胚胎干細胞（hESC)、或者成 纖維細胞培養物）的細胞100。通過本領域任何已知的方式，例如一種或多種SMAD抑制劑 處理、基質源誘導活性、或者無血清類胚體體法，這些細胞可以被誘導形成神經上皮，包括 神經玫瑰結110。通過該方法或者其他方法形成的神經上皮可以進一步被處理以進一步誘 導分化為神經元、神經膠質、星形膠質細胞等。從該異質混合物中誘導神經元分化的處理 可以包括在一個包含BDNF、⑶NF以及單磷酸腺苷（AMP)、上皮細胞生長因子（EGF)、纖維母 細胞生長因子（FGF)的培養基中進行孵育120。諸如神經元的細胞可以通過與所選擇的標 志物，例如：⑶200, HLA-A，HLA-B，HLA-C，⑶49f，⑶151，⑶340或其任意組合，抗體接觸進行 識別和/或分離130。所述細胞可以通過流式細胞術測定進行選擇或者分離140。
[0032] 通常地，在本方法中有用的生物學標志物是那些能夠告知響應于神經分化誘導的 神經發育系統的狀態的，以及可以有利地用于衍生自一個細胞異質群體的細胞培養物的標 志物。能夠告知神經元發育途徑狀態的生物學標志物，以舉例但并非限制的方式，包括細胞 表面蛋白，例如⑶200, HLA-A，HLA-B，HLA-C，⑶49f，⑶151以及⑶340。生物學標志物還包 括編碼或者另外能夠指示前述的蛋白標志物的RNA和DNA分子。在一些實施例中，一個細 胞培養物中的神經元可以通過檢測樣本中CD200的存在來進行識別，例如通過與特異性結 合到CD200的熒光標記的抗體進行接觸。在某些實施例中，除一種或多種來自下組的標志 物的存在之外，對CD200的存在進行測量，該組包括HLA-A，HLA-B，HLA-C，CD49f，CD151和 ⑶340,及其組合，例如HLA-A，HLA-B和/或HLA-C。在一些實施例中，基于被歸類為⑶200+ 細胞的并且還是!1^^^、!11^-8^1^-(7、0)49廠、0)151 _或0)340沖的一個或多個的細胞對 神經元進行選擇。在一些實施例中，選擇是⑶200+的細胞并且還是HLA-A _、HLA-B_、HLA-C_、 ⑶49Γ、⑶15Γ或⑶340 -中的一個或多個的細胞，其中⑶200 +是可以被歸類為⑶200 +以及 ⑶200?的細胞，但不包括⑶200?的細胞。在一些實施例中，神經元可以通過用特異性結合 到CD200的一個第一抗體和特異性結合到一個蛋白（其中該蛋白選自下組，該組由以下各 項組成：HLA-A、HLA-B或者HLA-C)的至少一個第二抗體，以及特異性結合到一個蛋白（其 中該蛋白選自下組，該組由以下各項組成：⑶49f，⑶151或者⑶340)的至少一個第三抗體 接觸一個細胞培養物；以及通過檢測是CD200+，并且還是HLA-A_，HLA-B_，HLA-C_，以及還有 ⑶49Γ、⑶15Γ或⑶34(K中的一個或多個的細胞來進行識別。神經元還可以通過選擇是 CD200+細胞的并且具有可檢測出的但低效表達的HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151和 CD340中的一個或多個的細胞來進行檢測。
[0033] 在某些情況下，通過檢測用探針（例如，抗體）染色的細胞染色強度，一個樣本中 的細胞通過細胞表面（例如，在一些情況下，一個樣本中的⑶200+細胞被識別）上的一種或 多種蛋白質的表達水平來進行識別，該探針對一種感興趣的細胞表面蛋白（例如，CD200， HLA-A，HLA-B，HLA-C，⑶49f，⑶151，⑶340等）具有特異性。本領域普通技術人員將理解 所陳述的表達水平反映細胞表面上的標志蛋白的可檢測出量。一個對染色（例如，CD20(T) 陰性的細胞（標志物特異性試劑的結合水平不可檢測地不同于同型匹配對照）仍然可以表 達微量的該標志物和/或其中可以存在微量的染色強度，這并非是由于蛋白質的存在（例 如，"背景"染色）。并且，雖然稱細胞對某一特定標志物為"陽性"（+)或者"陰性"是 本領域的常用做法，但實際的表達水平是數量性狀。細胞表面上的分子數量可以隨著若干 對數處理（log)而變化，但仍然可以被稱為"陽性"。例如，此處使用的術語"CD200+"可以 包含術語⑶200 ?#和⑶200?，但是不包含術語⑶200?或者⑶200'
[0034] 可以通過流式細胞計數監控細胞的染色強度，其中激光器檢測熒光染料的量化水 平（其與由特異性試劑（例如，抗體）結合的細胞表面標志物量成比例）。流式細胞計數、 或FACS還可以用于基于結合到特異性試劑的強度、及其他參數如細胞大小和光散射來分 出細胞群體。盡管染色的絕對水平可以隨著具體熒光染料和試劑制品而不同，但是可以將 數據標準化為對照。
[0035] 為了將分布標準化為對照，將每個細胞記錄為具有具體染色強度的一個數據點。 可以根據對數標度顯示這些數據點，其中測量單元是任意染色強度。在一個實例中，在樣本 中最亮的染色細胞可以比未染色（即，"陰性"）細胞強度高多達4個對數。當以此方式顯 示時，明顯的是落入染色強度的最高對數內的細胞是"陽性""高"）的，而在最低強度中 的那些是"陰性"或"低"的。"低"陽性染色細胞具有比同型匹配對照更亮的染色水平，但 是其不像通常在群體中發現的較亮染色細胞那么強烈。從最低強度到最亮強度，細胞可以 是"陰性"、"低"、"中等"（即，中間）、或"高"的。"中等"或"高"的細胞被認為是"陽性" 的。在一些情況下，"++"用于指示"高"而" + "用于指示"中等"，但兩種強度水平都被認為 是"陽性"。
[0036] 一種替代對照可以在表面上使用底物或具有限定的密度和/或強度的標志物的 底物，例如構造珠 （fabricated bead)或細胞系，這為一個或多個強度水平提供陽性對照。
[0037] 可以通過任何常規技術進行生物標志物的測量。生物標志物分子的測量可以包括 例如指示存在、濃度、表達水平、或任何其他與標志物分子相關聯的值的測量。針對測量生 物標志物分子，各種光譜技術是可用的，包括UV、可見的、以及紅外光譜。焚光標記、放射性 標記、或其他可易于識別的和量化的標記可以用于幫助標志物分子的測量。結合細胞的標 志物的表達水平可以通過流式細胞計數技術測量。已描述了細胞表面標志物表達用于通過 成像技術（如熒光激活細胞分選法（FACS))從來自多個物種的胚胎和成人組織識別和分離 許多神經細胞類型。在優選實施例中，流式細胞計數可以用于使用本發明的方法對細胞進 行識別和分選。流式細胞計數是用于通過在液體流中對其進行懸浮和捕獲在每個細胞通過 激光束時從其發出的光來統計和檢查顯微粒子（如細胞）的技術。可以在流式細胞計數中 利用經常被稱為"分化群"(CD)分子的細胞表面分子來表征細胞群體。例如，在熒光激活細 胞分選中，使用了診斷抗體（用熒光團標記），該診斷抗體結合到呈現在所討論的細胞群體 上的表面分子（例如，CD分子）并且表示所討論的細胞群體的特性。此后，由激光束激活 熒光團（附接到抗體）并且由流式細胞儀檢測熒光信號。以此方式，熒光標記的抗體可以 用于檢測和分選顯示特異性CD分子（或CD分子集）的細胞。通過舉例而不是限制性方式 用于與此或任何其他檢測方法一起使用的熒光團包括異硫氰酸熒光素、別藻藍素、多甲藻 素葉綠素蛋白、藻紅素、以及菁藍5、BB421或任何其他可以共價接合到抗體上的熒光團。本 發明的系統可以包括一個流式細胞儀，一個針對CD200具有特異性的、可檢測地標記的抗 體，針對HLA-A、HLA-B或HLA-C、⑶49f、⑶340或⑶151中的一個或任何組合具有特異性 的、可檢測地標記的抗體或多個抗體，以及包括神經元的一個細胞培養物，從而使得可以檢 測這些蛋白中的一種或多種。在此所描述的多種方法和系統中所使用的流式細胞儀可以被 配置成用于檢測來自熒光標記的抗體的低的、中等的和高的信號。結合信號強度所使用的 的具體抗體可以提供用于識別神經元的特異性模式識別，該神經元衍生自可以包括異質細 胞群體的細胞培養物。
[0038] 本發明的細胞表面標志物與已知蛋白家族有關。糖蛋白CD200是由廣泛范圍的細 胞類型所表達的膜蛋白。HLA-A、HLA-B、HLA-C、（可互換地是HLA-A、B、C)是組成主要組織 相容性復合物（MHC)的HLA蛋白分子。在全部脊椎動物中，MHC是由大的基因家族所編碼 的細胞表面分子。針對HLA-A、B、C的抗體是結合到或者HLA-A、HLA-B或者HLA-C的抗體。 MHC分子介導是免疫細胞的白細胞（也稱作白血細胞（WBC))與其他白細胞或體細胞的相互 作用。針對⑶49f的抗體結合到是整聯蛋白α鏈α6的ITGA6蛋白產物上。整聯蛋白是 由一條α鏈和一條β鏈組成的完整的細胞表面蛋白。針對CD340的抗體結合到受體酪氨 酸激酶的表皮生長因子（EGF)受體家族的一個成員上。針對CD151的抗體結合到已知與整 聯蛋白和其他跨膜4超家族蛋白進行復合的細胞表面糖蛋白上。
[0039] 圖3圖解說明了本發明的一個實施例，其中將天然人類胚胎干細胞（hESC)群體以 與袁等人相似的方式由SFEB通過SMD抑制來誘導形成神經玫瑰結。在一些實施例中，可能 包括神經祖細胞或注定會形成神經元的細胞的任何細胞培養物可以用本發明的多種方法 和系統進行處理。可以用本發明的多種方法或系統組合的細胞類型包括人類誘導性多能干 細胞（hiPSC)、人類胚胎干細胞（hESC)、或成纖維細胞培養物、神經玫瑰結、神經元和神經 膠質。如在圖3中，當用于誘導的細胞是神經玫瑰結，這些細胞可以用將誘導神經分化（如 神經元和神經膠質的形成）的培養基（例如，BNDF、GNDF和/或dbcAMP)來處理。培養基 可以包括試劑如N2或B27或任何其他試劑或本領域已知用于誘導神經分化的方案。在本 發明的多種方法和系統中不需要神經干細胞的純化、分離或分開的中間步驟。在誘導分化 的處理之后，可以通過將細胞培養物與選擇性地結合到CD200的抗體接觸來識別和/或分 離神經元。在一些實施例中，可以通過將細胞與選擇性地結合⑶200的抗體和選擇性地結 合HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任意組合的一個或多個抗體接觸來針對 神經元進行選擇。在一些實施例中，這些抗體是通過與一個熒光團的直接接合可檢測地和 可辨別地標記的。識別可以是通過可以區分熒光信號（例如，流式細胞計數）的任何成像 技術。可以在神經分化誘導之后的任何時間（如在20、25、30或40天之后）用本發明的多 種系統處理細胞培養物來確保識別和/或分離了神經元。因為可以省略NSC分離的步驟， 該方法有益地降低了達到細胞培養物中已富集的神經元群體的時間。
[0040] 本發明的多種方法和系統可以與常規細胞分出技術結合使用來制備神經元富集 的細胞培養物。富集可以基于是⑶200+或⑶200 s的細胞或是⑶200+#和⑶200? (即，排 除是CD200?的細胞）的細胞的選擇。在一些實施例中，選擇標準可以基于選擇是CD200+或 CD200++并且還是 HLA-A、B、C 'CD49r、CD15r或 CD34(T的細胞群體，例如 CD200 ++/HLA-A、B、 Γ。選擇可以用任何手段如通過流式細胞計數細胞分選發生。在一些實施例中，是HLA-A、 B、C+、⑶49f+、⑶151+或⑶340 +的細胞可以從細胞樣本中磁性地分選出來。磁性選擇可以包 括將細胞培養物與針對HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任意組合具有選擇 性的抗體接觸，其中這些抗體被附接到可以被磁場（如磁珠）吸引或排斥的表面上。在一 些實施例中，本發明的針對標志物具有特異性的抗體進一步包括磁珠，如含鐵的金屬材料。 優選地，盡管可以使用任何類型的磁珠，但是磁珠是超順磁性微粒子。可以用任何手段將磁 珠附接到抗體上。可以在抗體結合到感興趣的標志物之前、或在細胞-抗體復合物的形成 之后附接磁珠。在一些實例中，在復合物的形成之前附接磁珠。在其中細胞-抗體復合物 具有磁珠并且抗體針對HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任意組合具有特異 性的實施例中，從包括神經元的細胞培養物分出這樣的復合物優選地包括將細胞培養物與 磁場接觸，這樣使得具有磁珠的細胞-抗體復合物基本上通過磁場保留并且神經元基本上 不通過磁場保留。磁場的實例可以是磁化的鋼絲絨或流式細胞儀中的磁場。然后可以通過 使用針對CD200具有選擇性的抗體針對剩余細胞進行選擇性地分選。本發明還包括其中 將細胞培養物分出為基本上不具有針對HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任 意組合是陽性的細胞的第一細胞群體和具有針對神經元的已富集的群體的第二細胞群體 的實施例。然后可以針對CD200+或CD200 ++細胞對第二細胞群體進行選擇以用于進一步富 集。本發明的多種方法可以產出近似2、4、6或10倍的富集值。
[0041] 本發明的系統可以包括細胞培養物（包括神經元或神經祖細胞）、特異性結合到 CD200的抗體和被配置成用于分選是CD200+的細胞的流式細胞儀。本發明的多種系統還 可以包括特異性結合到至少一種蛋白的第二抗體，該蛋白選自下組，該組由以下各項組成： HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151或⑶340,其中該系統可以包括針對2種或更多種、3種 或更多種、4種或更多種、5種或更多種、包括所有6種這些蛋白具有特異性的抗體（例如， 包括針對這6種不同蛋白中的每種具有特異性的抗體的系統），其中流式細胞儀被配置成 用于分選是⑶200+并且是HLA-A、B、C '⑶49Γ、⑶15Γ或⑶340 -中的一個或多個的細胞。 在一些實施例中，本發明的這些系統還可以包括特異性結合到至少一種蛋白的第三抗體， 該蛋白選自下組，該組由以下各項組成：⑶49f、⑶151或⑶340,其中流式細胞儀被配置成 用于分選是⑶200+和HLA-A、B、C -并且是⑶49f '⑶15Γ或⑶340 -中的一個或多個的細胞。 本發明的其他系統包括針對從hPSC的神經分化培養物和來自成纖維細胞的誘導性神經元 培養物的神經細胞類型分離或富集的試劑、試劑盒（kit)和測定。本發明的多種方法和系 統可以用于針對衍生自患者的細胞的神經細胞類型分析的診斷工具。用于篩選藥物（或 小分子）的神經細胞類型的富集作為用于衍生自異質細胞培養物組合物（如神經玫瑰結、 hPSC或患者的細胞）的神經細胞類型的候選。以下非限制性實例進一步展示了本發明。
[0042] 實例
[0043] 實例 1
[0044] 從維塞公司（WiCell)(麥迪遜（Madison)，威斯康辛州（WI))獲得的H9hESC的培 養物是擴增的細胞，然后對其進行如下分化：
[0045] 第1天：通過用分散酶處理制作類胚體（EB)并將其放置在包含 10 μ mY-27632 (Rock 抑制劑）、2· 5 μ m Dorsomorphin、10 μ m SB43152 的無血清替換物 (knock-out serum replacement) (KOSR)培養基（標準WiCelI hESC培養基 w/o bFGF)中。 使用了低粘附6孔板并且每孔加入4ml的培養基。
[0046] 第2天：移除了 Rock抑制劑并且將細胞轉移至包含2. 5 μ m Dorsomorphiru 10 μ m SB43152的KOSR培養基中。
[0047] 第 4/5 天：在 ITS 培養基（+2. 5 μ m Dorsomorphin+10 μ m SB43152)中將 EB 涂板 在基質膠涂覆的板上。將4ml的EB涂板在孔中并且將IOml的ITS培養基加入到IOcm涂 覆的板中。每2-3天喂養EB。
[0048] 第10/11天：細胞培養基變化為ITS。
[0049] 第15/18+天：培養基變化為ITS培養基+20ng/ml FGF，持續24-48小時。觀察到 細胞死亡和神經元分化。
[0050] 第 18/20 天：使用生命技術公司（Life Technologies) StemPro? EZPassage? 傳代工具將正方形切割成培養物。刮掉并將正方形壓成丸。一個IOcm的培養物被涂板到兩 個在D-MEM/F-12w/GlutamaxTM培養基中涂覆有聚鳥氨酸和層粘連蛋白的T150燒瓶中。培 養基還包含 Iym dbcAMP+10ng/ml BDNF+10ng/ml ⑶NF。
[0051] 第40天：對培養物進行分選分析并分析。圖4描述了此處使用的神經元分離免疫 表型發現工作流程。神經誘導培養物用BD Lyoplate?人類細胞表面標志物篩板進行染色來 針對表面標志物進行篩選，并且然后用S0X1、S0X2、PAX6和DCX后續染色來使用細胞內標志 物針對神經元進行篩選。最終，分析細胞表面標志物表達群體來確定針對來自細胞異質群 體的神經元的新的細胞表面標志物。2D圖（圖5A)示出了被識別為神經元的DCX +Soxr和 DCX+Soxl+群體。將分化培養物分析為能夠分離/富集神經元。圖5B中示出的四個直方圖示 出了在屏幕中識別的在神經元上差異性表達的各種標志物的采樣，如與其他群體相比較。
[0052] 在近似于20psi處用100 μ m噴嘴分選神經元。在基礎培養基中染色并在基礎培養 基中收集細胞。圖6示出了門控策略用于從神經誘導培養物分選神經元。以從左上側順時 針方向將神經門識別為以下：基于光散射的ΡΓ細胞、基于光散射的P2 +P3_單個細胞，并且 基于⑶200和HLA-A、B、C表達，P4被識別為神經元。還具有示出了在神經元門P4 (⑶200+7 HLA-A' HLA-B' HLA-(T)中細胞的CD340和CD184表達的2個附加圖。
[0053] 圖7和圖8示出了分選前和分選后兩天的培養物的光學顯微鏡圖像。基于外觀， 在分選后圖像中成像的神經元性質非常純凈。在圖7中觀察到的圓環樣結構是包含NSC的 神經上皮。從神經集開始，識別神經元投影。
[0054] 圖9A示出了分選后7天的、已分選的CD200++/HLA-A' HLA-B' HLA-Γ的熒光顯微 鏡圖像。在96孔成像板中以約50, 000細胞/孔分選和涂板這些細胞并且在包含IX N2和 IX B27的D-MEM/F-12w/Glutamax?培養基中培養7天。通過β微管蛋白染色來識別神經 元，污染的"非神經元"通過巢蛋白染色來識別并且所有細胞核通過DAPI染色來識別。
[0055] 在圖9Β中示出的2D圖說明了緊接在細胞分選之前和緊接在細胞分選之后的神經 細胞培養物的分析。左上門由"非神經元"組成，如通過巢蛋白++/DCF染色所看到。在右上 方的門由神經元組成，如通過巢蛋白+/DCX +染色所看到。這些圖指示已分選的神經元培養 物為大約60 %純凈。
[0056] 實例 2
[0057] 圖10A示出了細胞培養和分化過程的概述。從由維塞公司（麥迪遜，威斯康辛州） 獲得的細胞培養和擴增H9hESC。然后將它們進行如下分化：
[0058] 第7天：通過用分散酶制作類胚體（EB)并將其放置在包含10 μ mY-27632 (Rock抑 制劑）、2·5μπι Dorsomorphin、以及 ΙΟμπι SB43152 的 KOSR 培養基（標準 WiCell hESC 培 養基w/o bFGF)中。使用了低粘附6孔板并且每孔加入4ml的培養基。
[0059] 第8天：移除了 Rock抑制劑并且培養基變化為包含2· 5 μ m Dorsomorphin、10 μ m SB43152的KOSR培養基。
[0060] 第 10/11 天：在 ITS 培養基（+2. 5 μπι Dorsomorphin+10 μπι SB43152)中將 EB 涂 板在基質膠涂覆的板上。將4ml的EB涂板在孔中并且將IOml的ITS培養基加入到IOcm 涂覆的板中。每2-3天喂養EB。
[0061] 第15/11天：細胞培養基變化為ITS。
[0062] 第20/23天：培養基變化為ITS培養基+20ng/ml FGF，持續24-48小時。觀察到 細胞死亡和神經元分化。
[0063] 第 23/25 天：使用生命技術公司（Life Technologies) StemPro? EZPassage? 傳代工具將正方形切割成培養物。一個10cm的培養物被涂板到兩個在D-MEM/F-12w/ Glutamax?培養基中涂覆有聚鳥氨酸和層粘連蛋白的T150燒瓶中，該培養基包含IX N2和 IX B27 連同 Ιμπι dbcAMP+10ng/ml BDNF+10ng/ml ⑶NF。
[0064] 第45天：對培養物進行分選分析并分析。
[0065] 用DCX和Soxl對神經誘導培養物進行染色從而提供針對神經元分化的細胞內對 照。圖10B示出了說明門控策略的2D圖。將DCX +Soxr和DCX +Soxl+群體定義為神經元。 在屏幕中被識別的標志物的重疊直方圖在圖10C中示出。CD200被識別為針對神經元的陽 性標志物。^^4、!11^-8、!11^-(：、^151、^340和^49€被識別為培養物中污染的細胞的陰 性標志物。這些標志物的差異性表達可以允許神經元分離。識別用于分選的標志物的組合 的⑶200與HLA-A、HLA-B、HLA-C或⑶340或⑶49f的共染色結果在圖10D中的2D圖上示 出。
[0066] 圖IlA-D示出了用于從神經誘導培養物分選神經元的門控分析的結果。圖IlA 所描繪的圖示出了用于基于光散射分選細胞的散射辨別來解釋雙重辨別確保分析了基于 光散射的單個細胞。CD200++/HLA-A7HLA-B7HLA-r圖用于基于CD200和HLA-A、HLA-B或 HLA-C表達識別神經元并且確認使用DCX/S0X2/Ki67分析。圖IlB描繪了分選之前的神經 培養物的流式分析。通過DCX的表達和Sox2和Ki-67的缺乏表達（DCX+Sox2_ki67_)來識 別神經元。圖IlC描繪了神經培養物的細胞分選之后的CD200 ++/HLA-A7HLA-B7HLA-C^ 胞的流式分析。通過DCX的表達、Sox2和ΚΓ67的缺乏表達（DCX+Sox2_ki67)來識別神經 元。圖IlD描繪了神經培養物的細胞分選之后的⑶200+/HLA-A、B、C +細胞的流式分析。通 過DCX的表達和Sox2和Ki67的缺乏表達（DCX+/Sox27ki67〇來識別神經元。
[0067] 實例 3
[0068] 如以上所描述誘導神經元形成。用以下抗體：PE CD340、PE HLA-A、B、C和PE CD49f 接觸細胞培養物。然后使這些細胞經受磁性損耗。接合到結合PE的抗體的磁性納米粒子用 于結合在細胞培養物上使用的PE接合的抗體。然后通過將其緊挨磁場放置從細胞溶液分 出磁性納米粒子。然后通過流式細胞計數和圖像分析來分析已富集的和已損耗的部分。在 圖12A和12B中示出在磁性損耗之前（12A)和之后（12B)的神經培養物圖像分析。對神經 培養物進行解離、用接合的抗體染色并且將其涂板在96孔成像板上并培養7天。通過Tujl 的表達和巢蛋白和Ki67的缺乏表達（Tujl+/巢蛋白7ki67〇來識別神經元。將核用DAPI 進行染色。損耗的部分的流式分析（圖12C)示出了通過DCX的表達和Sox2和Ki-67的缺 乏表達識別的神經元群體。示出了損耗之前（12D)和損耗之后（12E)的樣本的2個圖。通 過DCX的表達和Sox2和Ki67的缺乏表達（DCX+/S〇x27ki67_)來識別神經元。數據分析指 示在包括神經元與磁性標記的針對PE⑶340、PEHLA-A、B、C和PE⑶49f具有特異性的抗 體的細胞培養物中的細胞損耗將導致細胞培養物中神經元的富集。
[0069] 在此提出的所有專利、專利出版物、和其他已出版的參考通過引用以其全文特此 結合，如同每個已在此通過引用單獨地和特別地結合。盡管描述了本發明的優選說明性 實施例，但是將對本領域技術人員明顯的是可以在其中進行各種變化和修改而不偏離本發 明，并且在所附權利要求書中旨在覆蓋所有落入本發明的真實精神和范圍內的這樣的變化 和修改。
【權利要求】
1. 一種在一個細胞培養物中區分神經元的方法，該方法包括： 用特異性結合到CD200的一個第一抗體和特異性結合到一種蛋白的至少一個第二抗 體接觸該細胞培養物，該蛋白選自下組，該組由W下各項組成出LA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、 CD151 和 CD：MO ;并且 檢測是CD200+細胞的并且還展示出HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151和CD340中的 一個或多個的低至陰性表達的細胞。
2. 如權利要求1所述的方法，其中該細胞培養物包括人類誘導性多能干細胞化iPSC)、 人類胚胎干細胞化EPSC)、神經崎細胞、成纖維細胞、神經干細胞或其任意組合。
3. 如權利要求1所述的方法，其中該細胞培養物衍生自一個細胞異質群體。
4. 如權利要求1所述的方法，其中該細胞培養物包括神經玫瑰結。
5. 如權利要求1所述的方法，其中該細胞培養物包括神經上皮。 ^
6. 如權利要求1所述的方法，其中該些CD200 +細胞是CD200 *等（CD20〇med)和CD200? (CD20〇hish)。
7. 如權利要求1所述的方法，其中該細胞培養物不經歷一個神經干細胞富集步驟。
8. 如權利要求1所述的方法，其中該檢測細胞的步驟通過一個流式細胞儀來進行。
9. 如權利要求1所述的方法，其中該第一和第二抗體是通過與一個巧光團的直接接合 可檢測地和可辨別地標記的。
10. 如權利要求9所述的方法，其中該巧光團選自下組，該組由W下各項組成；異硫氯 酸巧光素、別藻藍素、多甲藻素葉綠素蛋白、藻紅素、菁藍5和BV421。
11. 如權利要求1所述的方法進一步包括富集是CD200 ++細胞的并且還是HLA-A \ HLA-B-、HLA-C-、CD49f-、CD15廠或CD340 -中的一個或多個的細胞群體。
12. -種在一個細胞培養物中富集神經元的含量的方法，該方法包括： 在包括神經上皮的一個細胞培養物中誘導神經分化從而形成神經元和神經膠質； 用特異性結合到CD200的一個第一抗體和特異性結合到一種蛋白的至少一個第二抗 體接觸該細胞培養物，該蛋白選自下組，該組由W下各項組成出LA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、 CD151 和 CD：M0 ;并且 流式細胞計數地選擇是CD200+細胞的并且還是HLA-A -、HLA-日-、HLA-C-、CD49f-、 CD15廠或CD340 -中的一個或多個的細胞。
13. 如權利要求12所述的方法，其中從神經上皮直接誘導神經元形成。
14. 如權利要求12所述的方法，其中是CD200 +的細胞不是CD200 ? (CD20〇i?)。
15. 如權利要求12所述的方法，其中該細胞培養物不經歷一個神經干細胞富集步驟。
16. 如權利要求12所述的方法，其中該第一和第二抗體是通過與一個巧光團的直接接 合可檢測地和可辨別地標記的。
17. 如權利要求16所述的方法，其中該巧光團選自下組，該組由W下各項組成；異硫氯 酸巧光素、別藻藍素、多甲藻素葉綠素蛋白、藻紅素、BV421和菁藍5。
18. 如權利要求12所述的方法，其中富集神經元的含量包括 用對于下組中的至少一個具有選擇性的抗體接觸來自一個細胞培養物的細胞，從而形 成一個抗體-細胞復合物，該組由W下各項組成出LA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151、和 CD340,其中該些抗體被附接到可W被一個磁場吸引或排斥的一個表面上；并且 通過向該些細胞施加一個磁場從該細胞培養物選擇性地分出所述抗體-細胞復合物。
19. 如權利要求12所述的方法，其中該第一和第二抗體是巧光標記的單克隆抗體。
20. 如權利要求12所述的方法，其中該富集大于4倍。
21. 如權利要求12所述的方法，其中該第二抗體結合到HLA-A、HLA-B或HLA-(T并且進 一步包括將該第二細胞培養物與包括CD49f、CD151或CD340的一個第=抗體接觸；W及 針對是 CD200+和 HLA-A -、HLA-B-、或 HLA-C-，并且還是 CD49f-、CD151-或 CD340 -的細胞 進行選擇。
22. -種用于從一個細胞培養物分離或富集神經元的系統，該系統包括： 特異性結合到CD200的一個第一抗體； 特異性結合到一種蛋白的一個第二抗體，該蛋白選自下組，該組由W下各項組成： HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151 和 CD：M0 ; 包括神經元的一個細胞培養物；W及 一個流式細胞儀，被配置成用于分選是CD200+和HLA-A -、HLA-B-、HLA-C-、CD49f-、 CD15廠或CD340 -中的一個或多個的細胞。
23. 如權利要求22所述的系統，其中該第一和第二抗體是巧光標記的抗體。
24. 如權利要求22所述的系統，其中該第二抗體是用一種含鐵的金屬材料標記的。
25. -種用于在一個細胞群體中識別神經元的系統，該系統包括： 特異性結合到CD200的一個第一抗體； 特異性結合到一種蛋白的一個第二抗體，該蛋白選自下組，該組由W下各項組成： HLA-A、HLA-B 和 HLA-C ; 特異性結合到一種蛋白的一個第=抗體，該蛋白選自下組，該組由W下各項組成： CD49f、CD151 和 CD：M0 ; 一個細胞樣本；W及 一個流式細胞儀，被配置成用于識別是CD200+和HLA-A-、HLA-擴或HLA-C-中的一個或 多個、并且還是CD49f、CD15廠或CD340 -中的一個或多個的細胞。
【文檔編號】C12Q1/04GK104471073SQ201380019615
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年4月23日 優先權日:2012年5月16日
【發明者】克里斯汀·T·卡森, 喬迪·馬丁, 杰森·G·維達爾 申請人:貝克頓·迪金森公司