用于檢測單核苷酸多態性的isfet陣列的制作方法

用于檢測單核苷酸多態性的isfet陣列的制作方法
【專利摘要】設備，所述設備包括用于檢測基因組內單核苷酸多態性SNP的模塊并且包括：四個反應室，所述反應室用于接收流體樣品，每個反應室含有不同的堿基A、C、G、T中的一種，和引物；參比電極，其在使用時浸沒在所述流體樣品中；一對離子敏感場效應晶體管(Ion?Sensitive?Field?Effect?Transistors)，ISFETs，其與各個反應室相關聯，每對的ISFETs包括各自的傳感膜或共同的傳感膜，所述傳感膜暴露在關聯反應室內；和多個差分檢波器(difference?detector)，每個差分檢波器具有一對輸入端，所述輸入端分別和與不同反應室相關聯的ISFETs的輸出端耦合。
【專利說明】用于檢測單核苷酸多態性的ISFET陣列

【技術領域】
[0001]本發明涉及使用ISFET陣列的高效多核苷酸測序和SNP檢測。

【背景技術】
[0002]脫氧核糖核酸(DNA)是細胞核中的長分子，并且其含有用于活的有機體的發育和功能行使的遺傳“指令”。圖1顯示具有雙螺旋結構的DNA部分，其具有外部的糖和磷酸酯骨架和內部堿基部分。信息以堿基序列編碼，所述堿基有四種類型；腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶，分別以其首字母A、C、G和T表示。在雙鏈上，堿基通過形成氫鍵以互補的方式就位，如圖2中顯示的，結果腺嘌呤僅與胸腺嘧啶成對且胞嘧啶僅與鳥嘌呤成對。DNA片段被稱為基因，其編碼特定蛋白的投影。在人群體中99.9%的密碼是相似的并且產生差異的是剩余的0.1%。單核苷酸多態性是基因的單一突變，其可以在大于群體的1%中發現。發現SNPs在識別與群體中大多數相比個體的遺傳差異方面，和還對于其后續的診斷都提供有價值的信息。
[0003]隨著遺傳科學的進展，對人類基因組進行測序已經通過發現基因的特定多態性和疾病之間的關系，幫助鑒定了很多缺陷和遺傳病的根源。在個體基因組中檢測單核苷酸多態性(SNPs)并且以SNP對代謝的影響方面的信息對其作圖可以改善和促進診斷學。
[0004]可以通過增加溫度或通過使用酶將如圖1中所示的DNA雙螺旋結構變性。由于DNA鏈的互補性質，可能通過設計合適的探針/引物和提供所述核苷酸，通過互補復制模板/靶來復制所述分子。這樣，為了發現人基因組中是有或沒有特定序列，可以設計引物與靶DNA的變性單鏈相互作用。如果其匹配，則其可在靶上延伸[2]。該引物在靶上的延伸釋放焦磷酸鹽和H+離子[3]。因此，通過檢測分析物中酸性增加與否，可以確定延伸是否發生；并從而確定設計的序列是否匹配。
[0005]近年來,提供定點護理(point-of-care)解決方案是感興趣的領域,其可以以不需要建立實驗室和專家的方式快速進行必要的測試。該領域中的一種該方法[I]依賴于使用離子敏感場效應晶體管(ISFETs)，其與CMOS (互補金屬氧化物半導體)技術兼容并且從其相關優勢獲益。ISFET用作傳感器，用于測量pH和用于檢測pH下降，以表明延伸發生與否。然而，目前使用的ISFETs平臺使它們對功率(power)和內存(memory)敏感。需要目前使用的平臺處理大量的數據以提供是/否的答案，說明在靶DNA中檢測到特定多態性與否。這些強烈的需求主要由于需要在測量中刪除的錯誤源的存在。
[0006]ISFET是浮動門(floating gate) FET家族成員并且其門電壓(gate voltage)從參比電極(“遠端門(remote gate)”)通過電解質和其浮動門頂部的敏感膜提供。圖3顯示ISFET的圖示。在早期發展階段，ISFETs使用不同材料用于提供對于電解質中的離子濃度的此種靈敏度，需要特別處理，而目前將其以市售CMOS (互補金屬氧化物半導體)技術實施[5]，例如如圖4中所示的，使用鈍化層(Si3N4在Si02上方)作為傳感膜，從而不需要ISFET特異處理步驟。傳感膜材料可以與電解質中的H+離子結合，在其上部形成電荷表面并將該電荷與傳感膜下的金屬層耦合。已經顯示，相對于參比電極的敏感膜上的電壓依賴于離子濃度[4]。帶有其它傳感膜的ISFETs也是已知的，例如替代Si3N4，其可以由Ta205形成。
[0007]可以在數學上表達pH(H+)和電壓之間的關系，以顯示從參比電極(遠端門G)至IJ傳感膜(G’ )的電壓下降線性依賴于pH(參見以下方程式(I))。方程式⑵中Y表示非PH相關化學電壓，Ut為熱電壓且α表示由于實際上非理想條件導致的靈敏度降低。
[0008]VG, = Vc-Vchem (I)
[0009]Vchem = Y +2.3 a UTpH (2)
[0010]晶體管的特性是其門和電源電壓的差異的函數(方程式(3)為(a)弱反型(WeekInvers1n), (b)強反型(Strong Invers1n)和(c)速度飽和[6])，即
I, f __ pr、
[0011]1D =4?) expexPiT^^ exPTT1
t Vut j (3a)
「 ψ 2
? _ I _ ,, f rr I (xr tr \tr r DS
[001 2] 1D — Μ,.(- ?X y Vcs-1, TO F DS ----γ--
HZ 」(3b)
[0013]4=^τ(--^^ο)2(? + ^)
2 L(3c)
[0014]因此，設計一些接口以提供所需的反饋，使所有參數不變，這樣以致該電壓差異也依然不變，而其絕對值遵循由PH改變導致的化學電壓下降的變化(浮動門和固有MOSFET (金屬氧化物半導體場效應晶體管)的來源根據pH改變)。用于此目的的常見接口顯示于圖5中。
[0015]然而，ISFETs可以遭受非理想狀態。例如，這可以包括化學和熱噪聲，和漂移，其是由于捕獲電荷(trapped charge)導致的傳感膜的降解(這已經被報道為其閾值電壓變化的主要原因[8，9])。漂移以DC偏移出現，以每小時數毫伏的改變速率隨時間變化[10]
[5]。當進行測量時必須小心，并且無論何時都測量相對另一個pH的pH改變，必須以微分的方式使用參考FET(REFET)計算測量結果。[注意:不應該將REFET與圖3的參比電極-或遠端門-混淆]。
[0016]ISFETs 用于 SNP 檢測
[0017]測序和SNP檢測中使用ISFET依賴于以下事實:當它們匹配(即其序列互補)時，作為焦磷酸鹽水解的結果，引物/探針鏈在靶DNA鏈上的延伸的副產物，氫離子被釋放[3]，并且傳感膜上和周圍這些離子增加的濃度允許反應的發生在反應發生后某時被檢測。在此情況下，檢測其改變足以能夠確定具有已知序列的設計探針是否與靶相匹配，而不是進行PH的絕對測量。因此，在差異配置中具有用于檢測所有非理想信號并隨后將它們從工作ISFET刪去的REFET，可以提供pH改變的可靠監視[11，12]。從而，將REFET暴露于非可延伸(即非匹配)引物與核苷酸、酶和靶DNA鏈的混合物，以提供如對于工作ISFET的除pH改變外的相同條件[13]。圖6顯示典型在用于SNP檢測的基于ISFET的測序使用的配置。
[0018]現有技術
[0019]目前的技術使用上文討論的配置以實施陣列用于平行檢測不同SNPs，如參考文獻[I] (D.M.Garner, Hua Bai, P.Georg1u, T.G.Constandinou, S.Reed, L.M.Shepherd,W.Wong, K.T.Lim 和 C.Toumazou, 〃A multichannel DNA SoC for rapid point-of-caregene detect1n, 〃 于 Solid-State Circuits Conference Digest of Technical Papers(ISSCC) ,2010 IEEE Internat1nal，2010，第 492_493 頁)的圖 27.4.1 中表示的。為了檢測序列和隨后堿基位點n+1處的突變的存在，設計長度為η的引物并與靶DNA和酶混合。將其插入四個室，每個室具有ISFET以傳感pH。每個室僅含有一種類型的核苷酸(即第一室僅含有核苷酸類型A，第二室僅含C，第三室僅含G和第四室僅含T)。pH(作為設計的引物在靶DNA鏈上延伸的結果)僅在含有互補于位置n+1處核苷酸的核苷酸的室中下降，因為其是唯一可以延伸所述引物的一個。將四個室中的所有ISFETs與之前討論的REFET相比較。[注意:在雜合子情況下，與純合子的情況相反，兩種不同核苷酸類型將互補，其導致在兩個不同室中PH下降。這在下文進一步討論。]
[0020]可以設計并構建ISFET陣列以提供多組(四個)ISFET SNP檢測器。此陣列可以提供對相同SNP的多重測試，例如提供對給定SNP增加的檢測，和/或提供對不同SNP的測試。在后一情況下，ISFETs的各個組的孔(對于各個不同SNP測試)將含有不同引物。在一些情況下，這些陣列可以非常大。
[0021]該當前的平臺具有缺點。高功率和內存需要是主要問題，其產生于用于克服非理想ISFET狀態的接口和信息必須被處理以刪去噪聲和寄生效應的方式。
[0022][I]的圖27.4.2顯示一種最前沿芯片上系統的系統總覽。如在那幅圖中顯示的，對于陣列中四十個ISFETs (其中一個是REFET)加上十個溫度傳感器讀出器，使用五十個Σ -Δ調節器以及ISFET偏移消除電路。該系統的復雜性增加陣列中ISFETs的數量，并且可以通過設置的ADCs和控制單元的數量容易看出對加強的功率和內存的需要。諸如參考文獻[I]中的圖中描述的系統中的一些缺點在下文中解釋。
[0023]小的pH改變和靈敏度
[0024]室內核苷酸的延伸在緩沖液中發生并且pH下降依賴于其組成成分的混合物(例如其量和密度限定反應中將產生多少離子并且其密度將是多少)。實際上，PH典型地降低一個單位或更少。在延伸過程中PH改變的實例顯示于圖7的圖表中。考慮到對于最佳傳感膜室溫的理想靈敏度為59mV/pH，可以預期電容耦合之后浮動門上的電壓改變至多為大約10-60mV，并且實際上它小于59mV ;例如在參考文獻[14] (P.Georg1u和C.Toumazou,〃ISFET characteristics in CMOS and their applicat1n to weak invers1noperat1n")中報道為 44mV/pH。
[0025]單一REFET
[0026]在大陣列中，整個芯片依賴于一個REFET，因為對于所有ISFETs的條件必需相同。如果REFET運行錯誤，則所有測量將以誤差產生偏差。此外，REFET將不且實際上不能就其分析物而言與所有其它ISFETs —致，因為不同SNPs需要不同引物。
[0027]參比電極
[0028]為了提供共同條件，單獨參比電極或遠端門用于整個芯片和用于REFET。因此，使ISFETs的遠端門偏離等電位是困難的并且要求挑戰性的同等傳導電位的電解質微流體設計(例如鹽橋)，或在陣列結構上的不同點布線和設計穩定的參比電極。
[0029]監視/追蹤反應
[0030]已知技術需要監視反應以將行為解釋為pH改變和SNPs檢測。這是如此，盡管最終應答(或輸出值)是表明PH降低與否，和從而是否發現SNP(—或零)的單一比特信息。必須從開始監視反應以能夠獲得結果。
[0031]ISFET 接口
[0032]在陣列中使用用于所有ISFETs的單個通信接口是不理想的，因為其需要在ISFETs的漏極(drain)和源級處添加開關以將它們各個與接口(依次)連接從而監視反應。這影響ISFETs的性能并且需要通過芯片快速掃描所有ISFETs以橫跨陣列對pH進行基本上連續的測量。從而，需要相當大的努力以多路傳輸(multiplex)和反多路傳輸(de-multiplex)從單個接口讀取的測量值。此外，這導致對于模擬差分對(analoguedifferential pair)的變動負荷(varying load),其另一種輸入是REFET。因此，以差分測量平行有效監視橫跨陣列的所有ISFETs的僅有途徑是對每個ISFET提供單個接口并隨時間記錄其數據，從而在之后從對于REFET記錄的數據減去它。在該情況下，必須同時對所有ISFETs的任一個讀值或必須高速掃描陣列從而以小于化學反應發生所花費的時間長度的時間間隔對各個ISFET取樣[16]。
[0033]數字轉換器模擬(ADCs)
[0034]已知的配置需要模擬數據向數字數據的高精確度轉變，和對記錄的數據進行讀值和從工作ISFET數據減去REFET數據的處理單元。高精確度是重要的，因為至多僅數十毫伏的一點PH改變(當pH以一個單位改變時理想地為59mV)必須被檢測到，并且對于該pH改變，尤其當信號伴有來自ISFET自身的偏移時，量化噪聲不應該是可比的。對于陣列中每個單獨ISFET，一個建議的設計需要10-比特ADCs [I]。該結構要求高容量的內存以及處理單元，不僅導致所述設計是尤其功率和內存加強的，而且還極大地增加芯片設計的復雜性。以該結構，必須收集大量數據以監視和解釋pH降低的檢測-即除了對于REFET的10比特夕卜，來自四個ISFETs的40比特的信息(每個監視以四種堿基類型(八，(:，6和1')中每種的引物延伸的可能性)，對于每個SNP的取樣時間產生50比特的信息。這當然隨著要平行分析的SNPs數量而按比例增加。
[0035]上文已經討論了對于基于ISFET的SNP檢測的目前設置的主要缺點和問題。已經描述了比如對單個REFET的性能的依賴性，參比電極的設計和對高精確度ADCs的要求，從開始監視反應，和收集大量導致高功率和內存消耗的冗余數據的問題。上文提及的問題的根源在于已知平臺的模擬性質，以及測量后消除異常信號所需的算法和ISFET的不理想行為。
[0036]類似的考慮適用于在RNA中SNP檢測的情況中。
[0037]發明概沭
[0038]根據本發明的第一個方面，提供一種設備，所述設備包括用于檢測基因組中單核苷酸多態性SNP的模塊，并且包括:
[0039]四個反應室，所述反應室用于接收流體樣品，所述反應室每個含有堿基A，C，G，T中的不同一種，和引物；
[0040]參比電極，所述參比電極在使用時浸沒入所述流體樣品；
[0041]一對離子敏感場效應晶體管，ISFETs，所述離子敏感場效應晶體管與各個反應室關聯，每對的ISFETs包括各自的傳感膜或共同的傳感膜，所述傳感膜暴露在關聯的反應室內；和
[0042]多個差分檢波器，每個差分檢波器具有一對輸入端，所述輸入端分別和與不同反應室關聯的ISFET的輸出端耦合。
[0043]所述多個差分檢波器可以具有輸入端對，所述輸入端對與反應室的不同輸出端對耦合。
[0044]所述設備可以包括四個差分檢波器X，Y，Z和W，這些差分檢波器具有輸入端，所述輸入端以如下方式與反應室ISFETs耦合:
[0045]X:A 和 T
[0046]Y:T 和 C
[0047]Z:C 和 G
[0048]W:A 和 G。
[0049]所述設備可以包括輸出檢測器，所述輸出檢測器用于監視由差分檢波器提供的輸出值，從而檢測指示核苷酸添加不可能的輸出狀態。
[0050]所述設備可以包括處理器，將所述處理器與所述輸出檢測器耦合并且配置所述處理器以通過對設備進行調整，對檢測不可能狀態進行反應，從而消除所述不可能狀態。
[0051]對所述多個差分檢波器的偏移進行所述調整。
[0052]配置所述處理器以通過以下中的一個或組合進行所述調整:改變施加于所述參比電極的偏置電壓，改變差分檢波器偏置電流，改變偏置參考電流，和改變通過緩沖級(buffer stage)的電流。
[0053]所述差分檢波器可以是差分放大器，可以是跨導放大器，和可以是比較器。
[0054]所述設備可以包括被配置成檢測不同SNPs的多個所述模塊。
[0055]根據本發明的第二個方面，提供一種檢測基因組內單核苷酸多態性SNP的方法，所述方法包括:
[0056]在四個反應室中接收流體樣品，每個反應室含有不同的堿基A、C、G、T中的一種，和引物；
[0057]使用一對離子敏感場效應晶體管ISFETs檢測反應室內任何pH改變，所述離子敏感場效應晶體管與每個反應室關聯，每對的ISFETs包括各自的傳感膜或共同的傳感膜，所述傳感膜暴露在關聯反應室內；和
[0058]設置多個差分檢波器的輸出端，每個差分檢波器具有一對輸入端，所述輸入端分別和與不同反應室關聯的ISFETs的輸出端耦合。
[0059]所述方法可以進一步包括監視由差分檢波器提供的輸出以檢測指示核苷酸添加不可能的輸出狀態。
[0060]監視由差分檢波器提供的輸出可以包括在真值表中查找輸出。
[0061]所述方法可以進一步包括通過對所述設備進行調整，對檢測不可能狀態進行反應，從而消除所述不可能狀態。
[0062]可以對所述多個差分檢波器的偏移進行所述調整。
[0063]對所述設備進行調整包括以下中的一種或組合:改變施加于參比電極的偏置電壓，改變差分檢波器偏置電流，改變偏置參考電流，和改變通過緩沖級的電流。
[0064]所述差分檢波器可以是差分放大器，可以是跨導放大器，和可以是比較器。
[0065]根據本發明的第三個方面，提供一種設備，所述設備包括用于檢測基因組內單核苷酸多態性SNP的模塊并且包括:
[0066]四個反應室，其用于接收流體樣品，每個反應室含有不同的堿基A、C、G、T中的一種，和引物；
[0067]參比電極，其在使用時浸沒在所述流體樣品中；和
[0068]與每個反應室關聯的
[0069]一對離子敏感場效應晶體管ISFETs，每對的ISFETs包括各自的傳感膜，或共同的傳感膜，所述傳感膜暴露在關聯反應室內，并且所述ISFETs對以推拉構型耦合；
[0070]MOSFET反相器級(inverter stage),其具有與所述推拉構型的輸出端稱合的輸入端；和
[0071]輸出級，其提供依賴于所述傳感膜上存在的電壓的可切換的數字輸出。
[0072]所述MOSFET反相器級可以包括一個MOSFET反相器，或多個層疊的MOSFET反相器。
[0073]所述設備可以包括參考室，所述參考室含有非匹配引物。
[0074]所述設備可以包括參考輸出檢測器，所述參考輸出檢測器用于監視參考室的輸出，以檢測設備內的錯誤偏差。
[0075]所述設備可以進一步包括處理器，所述處理器與所述參考輸出檢測器耦合，并且配置所述處理器以通過對設備進行調整，對檢測錯誤偏差進行反應，從而消除所述偏差。
[0076]所述設備可以進一步包括輸出檢測器，所述輸出檢測器用于監視輸出級的數字輸出，以檢測指示核苷酸添加不可能的輸出狀態。
[0077]所述設備可以包括處理器，所述處理器與所述輸出檢測器耦合并且配置所述處理器以通過對所述設備進行調整，對檢測不可能狀態進行反應，從而消除所述不可能狀態。
[0078]可以配置所述處理器以通過改變施加于所述參比電極的偏置電壓進行所述調整。
[0079]可以配置所述處理器以通過改變可編程反相器以調整開關閾來進行所述調整。
[0080]所述設備可以包括被配置成檢測不同SNPs的多個所述模塊。
[0081]根據本發明的第四個方面，提供一種檢測基因組內單核苷酸多態性SNP的方法，所述方法包括:
[0082]在四個反應室中接收流體樣品，每個反應室含有不同的堿基A、C、G、T中的一種，和引物；
[0083]使用一對離子敏感場效應晶體管ISFETs檢測反應室內任何pH改變，所述離子敏感場效應晶體管與每個反應室關聯，每對的ISFETs包括各自的傳感膜，或共同的傳感膜，所述傳感膜暴露于關聯的反應室內，并且ISFETs對以推拉構型耦合；
[0084]將推拉ISFETs的輸出端MOSFET反相器級的輸入端耦合；和
[0085]提供來自輸出級的數字輸出，所述數字輸出是依賴存在于所述傳感膜上的電壓可切換的。
[0086]所述方法還可以包括在參考室上進行所述方法的步驟，所述參考室含有非匹配引物。
[0087]所述方法可以包括監視所述參考室的輸出以檢測設備內的錯誤偏差。
[0088]所述方法可以包括通過對所述設備進行調整，對檢測錯誤偏差進行反應，從而消除所述偏差。
[0089]所述方法可以包括監視輸出級的數字輸出以檢測指示核苷酸添加不可能的輸出狀態。
[0090]監視由輸出級提供的數字輸出可以包括在真值表中查找輸出。
[0091]所述方法可以包括通過對所述設備進行調整，對檢測不可能狀態進行反應，從而消除所述不可能狀態。
[0092]進行所述調整可以包括改變施加于參比電極的偏置電壓。
[0093]進行所述調整可以包括改變可編程反相器以調整開關閾。
[0094]附圖簡沭
[0095]圖1顯示DNA片段，和互補堿基對；
[0096]圖2顯示堿基對的化學結構；
[0097]圖3 是 ISFET ；
[0098]圖4是未改進CMOS技術中的ISFET ；
[0099]圖5 是共同 ISFET 接口，漏極輸出器(drain-source follower)。
[0100]圖6是用于對于SNP檢測的應用的ISFET的配置；
[0101]圖7是顯示作為引物延伸的結果的pH降低的圖表；
[0102]圖8顯示從DNA構建到染色體的次序；
[0103]圖9是無REFET差分測量配置；
[0104]圖10顯示陣列中內存編址法；
[0105]圖11是ISFET操作電容模型；
[0106]圖12是ISFET電容模型；
[0107]圖13是基于ISFET的反相器；
[0108]圖14是化學開關；
[0109]圖15是當門電壓經3.3s從O掃至電源(3.3V)時，比較化學開關和MOSFET反相器中的行為的圖表；
[0110]圖16是顯不對于不同pH的基于ISFET的反相器特性的圖表；
[0111]圖17是單個DNAGA像素配置；
[0112]圖18是顯示當pH隨時間改變時，像素操作的模擬的圖表；
[0113]圖19是DNAGA配置實例；
[0114]圖20是DNAGA數據通路總覽；
[0115]圖21是DNAGA校準和控制算法；
[0116]圖22 是用于 DNAGA 的狀態機器實例(Sample State Machine)；
[0117]圖23是無REFET的DNAGA校準和讀值算法；
[0118]圖24是無REFET的DNAGA結構實例；
[0119]圖25是用于在無REFET的DNAGA中檢測無效狀態的組合邏輯的實施實例；
[0120]圖26是誤差檢測邏輯的Carnot-圖實例；
[0121]圖27是對于雜合子情況調整和檢測SNPs的方案實例；
[0122]圖28是具有對于切換點的調整是可編程的第二反相器的反相器層疊配置；
[0123]圖29是當使用可編程門反相器時無REFET DNAGA校準和讀值算法；和
[0124]圖30顯示描述來自兩個不同ISFET的輸入之間進行的差分測量的框圖。
[0125]發明詳沭
[0126]如之前討論的，對于基于ISFET的SNP檢測，以當前的設置存在許多缺點和問題。現在將描述可以極大地簡化此種裝置的操作的新方法和設備。例如，現在將建議的差分測量的新方法不僅增加PH改變測量的可信度，而且降低記錄所需的數據量。還將描述進一步的在克服ISFET/化學測量的固有問題的同時提供直接的數字結果的新方法。然而，在繼續所建議的配置之前，解釋誤差指示的思想以澄清所建議的設計的性能。
[0127]如在圖8中顯示的,DNA分子位于染色體對內。編碼某個蛋白的投影(project1n)的基因(作為DNA的片段)，位于特定染色體對的特定部分。該染色體對的兩條染色體上的基因序列可以相同(純合)或可以不同(雜合)。當搜索個體種基因的特定堿基位置處的特定突變時，可能在兩條染色體臂上找到相似的突變(即該個體是純合子)或兩個不同堿基(該個體是雜合子)位于研究的點。
[0128]例如，對于具有23對染色體的人類，基因序列的位置η上的堿基可以不同并且作為結果導致基因的投影不同。如果位置η之前的堿基序列由α表示并且其之后的序列以β表示，如果在他/她的基因組僅αΑβ序列存在，以致染色體對的兩條臂都具有αΑβ，則靶基因多態性屬于的人是具有類型A的純合子。如果發現兩個等位基因(即基因的不同形式)，例如αΑβ和a CP，以致染色體對的一個臂含有αΑβ的序列并且另一個含有αΟβ，則他/她是雜合子。
[0129]因此，對于基因的單突變，對于個體，可能存在4個核苷酸的空間和從而10個可能等位基因:四種純合子情況，其中僅四個堿基中的一個填充染色體對的兩條臂中的位置(αΑβ , αΟβ , α6β和αΤβ);和六種雜合子情況，其中染色體對在兩條臂中的位置發現兩個不同等位基因(α Αβ和α(:β,αΑβ和αΟβ,αΑβ和αΤβ,α(:β和α6β,α(:β和αΤβ，α6β和αΤβ)。因此，在人基因組中不可能發現3或4個等位基因并且其也不能具有缺口。從數學上看個體中的該問題，

f 4、( 4、
[0130]有效條件:純合的U+雜合_U = 10 (3)

⑷[4') (4']
[0131]無效條件:U+[3J+l4J =6 (4)
[0132]回顧SNP測試，為了發現人靶DNA中特定基因的多態性，設計長度為η的具有與靶基因互補序列的引物以發現靶DNA鏈中位置n+1處的堿基(所述靶取自個體DNA的樣品，例如取自唾液，并且染色體的兩個臂上具有DNA的兩種類型)。將引物和靶DNA分子以及所需的酶插入四個室。每個室僅具有四種核苷酸(A，C，G*T)中的一種。在每個室中，存在測量H+離子濃度的ISFET。位于含有與靶匹配并成功延伸引物的核苷酸的室中的ISFET，將檢測PH降低。因此，僅從各個ISFET/室尋找一個比特的信息(即如果pH降低，則為1，或如果不降低則為0)。從所述四個ISFETs，我們可能能夠得到24= 16種情形。但從前一段，我們知道僅10種情形是有效的并且我們預期找到這十種情形中的一種:
[0133]有效結果
[0134]純合子{1000，0100，0010，0001}(5)
[0135]雜合子{1100,1010,1001,0110,0101,0011}
[0136]無效結果:{0000，1110，1101，1011,0111，1111}(6)
[0137]然而，由于之前描述的非理想信號(例如化學和熱噪音，以及ISFET的閾電壓隨時間的漂移)的存在，所述測量值可能以誤差偏差。這些不需要的信號將具有DC或非常低頻率的性質并且以偏移出現。該誤差可以影響ISFET輸出并導致其以可能發出錯誤的pH降低的信號的方式作用或導致其不顯示已經發生的PH降低。這些噪音常見并且出現可以造成6種無效情形中的一個；例如當ISFETs中沒有一個報告pH降低，或它們所有，或它們中的三個報告PH降低。
[0138]新差分方案(無REFET)
[0139]現在將描述新結構，所述新結構中不再需要REFET。替代測量每個ISFET信號，在信號在測量點也被放大的同時，計算差分測量。這可以減少ADC的工作，而且更有利的是可以甚至不需要ADC。圖9顯示“無REFET”差分測量所需的配置(因為ISFETs以使其信號電容耦合的浮動門晶體管工作，以電容器表示室)。在該配置中，每個室(A，T，C，G)具有兩個ISFETs (或實際上是共享相同傳感膜的兩個固有的浮動柵MOSFETs)。每個ISFET提供差分放大器中的輸入端成對晶體管中的一個。使用四個差分放大器(X，Y，Z，W)。ISFETs以室的兩個ISFETs中的一個成為放大器的非反轉輸入端并且另一個形成另一個放大器的反轉輸入端的方式布線。在該配置中，之前已知的具有數個緩沖和偏移取消回路的接口設計已經以單個簡單的差分放大器替代。
[0140]圖30顯示描述兩個不同ISFETs (A，T，C和G)的輸入(a和b)之間進行的差分測量的框圖。差分測量輸入，并且提供輸出C。如在圖30顯示的，可以存在確定差分輸出c滿足多個閾值帶中的哪個的邏輯步驟。例如在圖30中，存在上閾值和下閾值。如果c大于上閾值，則相應的輸出X，Y，Z或W將是+1，如果c低于下閾值，則相應輸出X，Y，Z或W將為-1，或如果c落在上和下閾值之間，則相應輸出X，Y，Z或W將是O。
[0141]差分放大器X，Y，Z和W的輸出可以被分為三個區域。一個由-1表不，為反轉輸入端ISFET上的pH降低的結果；另一個以I表示非反轉輸入端中的pH降低的結果；并且O對于在兩個的任一個中都未檢測到PH降低時，或它們兩個中都檢測到但已經刪去時的情況。考慮到在四個室中的每個中可能發生的16種情況(10個有效，和6個無效)，建立真值表，所述真值表陳述哪個結果有效并且每個有效結果表示什么，并且另外哪個無效(即差分放大器的輸出狀態指示核苷酸添加不可能)和要求設備的偏移被調節。表1是對應于圖9的配置的真值表的實例，其中“AR”代表“需要調整”。
[0142]

【權利要求】
1.設備，所述設備包括用于檢測基因組內單核苷酸多態性SNP的模塊，并且包括: 四個反應室，所述反應室用于接收流體樣品，每個所述反應室含有不同的堿基A、C、G、T中的一種，和引物； 參比電極，所述參比電極在使用時浸沒入所述流體樣品中； 一對離子敏感場效應晶體管ISFETs，其與各個反應室關聯，每對的ISFETs包括各自的傳感膜或共同的傳感膜，所述傳感膜暴露于關聯的反應室內；和 多個差分檢波器，每個差分檢波器具有一對輸入端，所述輸入端分別和與不同反應室關聯的ISFETs的輸出端耦合。
2.根據權利要求1所述的設備，所述多個差分檢波器具有多對輸入端，所述多對輸入端與不同對的反應室的輸出端耦合。
3.根據權利要求2所述的設備，所述設備包括四個差分檢波器X，Y，Z和W，這些差分檢波器具有以如下方式與反應室ISFETs耦合的輸入端:
X:A 和 T
Y:T 和 C
Z:C 和 G
W:A 和 G。
4.根據在前權利要求中任一項所述的設備，所述設備包括輸出檢測器，所述輸出檢測器用于監視由所述差分檢波器提供的輸出，以便檢測以下輸出狀態，所述輸出狀態指示核苷酸添加是不可能的。
5.根據權利要求4所述的設備，所述設備包括處理器，所述處理器與所述輸出檢測器耦合并且被配置成通過對所述設備進行調整對檢測到不可能狀態進行反應，從而消除所述不可能狀態。
6.根據權利要求5所述的設備，對所述多個差分檢波器的偏移進行所述調整。
7.根據權利要求6所述的設備，所述處理器被配置成通過以下中的一個或組合進行所述調整:改變施加于所述參比電極的偏置電壓，改變差分檢波器偏置電流，改變偏置參考電流，和改變通過緩沖級的電流。
8.根據在前權利要求中任一項所述的設備，其中所述差分檢波器是差分放大器。
9.根據權利要求1至7任一項所述的設備，其中所述差分檢波器是跨導放大器。
10.根據權利要求1至7任一項所述的設備，其中所述差分檢波器是比較器。
11.根據在前權利要求中任一項所述的設備，所述設備包括被配置成檢測不同SNPs的多個所述模塊。
12.—種檢測基因組內單核苷酸多態性SNP的方法，所述方法包括: 在四個反應室中接收流體樣品，每個所述反應室含有不同的堿基A、C、G、T中的一種，和引物； 使用一對離子敏感場效應晶體管ISFETs檢測所述反應室內的任何pH改變，所述離子敏感場效應晶體管與每個反應室關聯，每對的ISFETs包括各自的傳感膜或共同的傳感膜，所述傳感膜暴露在關聯的反應室內；和 設置來自多個差分檢波器的輸出端，每個差分檢波器具有一對輸入端，所述輸入端分別和與不同反應室關聯的ISFETs的輸出端耦合。
13.根據權利要求12所述的方法，所述方法還包括監視由所述差分檢波器提供的輸出，以便檢測以下輸出狀態，所述輸出狀態指示核苷酸添加是不可能的。
14.根據權利要求13所述的方法，其中對由所述差分檢波器提供的輸出的監視包括在真值表中查找輸出。
15.根據權利要求13或14之一所述的方法，還包括通過對所述設備進行調整對檢測到不可能狀態進行反應，從而消除所述不可能狀態。
16.根據權利要求15所述的方法，其中對所述多個差分檢波器的偏移進行所述調整。
17.根據權利要求16所述的方法，其中對所述設備進行調整包括以下中的一種或組合:改變施加于所述參比電極的偏置電壓，改變差分檢波器偏置電流，改變偏置參考電流，和改變通過緩沖級的電流。
18.根據權利要求12至17任一項所述的方法，其中所述差分檢波器是差分放大器。
19.根據權利要求12至17任一項所述的方法，其中所述差分檢波器是跨導放大器。
20.根據權利要求12至17任一項所述的方法，其中所述差分檢波器是比較器。
21.設備，所述設備包括用于檢測基因組內單核苷酸多態性SNP的模塊并且包括: 四個反應室，其用于接收流體樣品，每個反應室含有不同的堿基A、C、G、T中的一種，和引物； 參比電極，其在使用時浸沒在所述流體樣品中；和 與每個反應室關聯的 一對離子敏感場效應晶體管ISFETs，每對的ISFETs包括各自的傳感膜或共同的傳感膜，所述傳感膜暴露在關聯反應室內，并且所述ISFETs對以推拉構型耦合； MOSFET反相器級，其具有與所述推拉構型的輸出端耦合的輸入端；和 輸出級，其提供依賴于所述傳感膜上存在的電壓的可切換的數字輸出。
22.根據權利要求21所述的設備，所述MOSFET反相器級包括一個MOSFET反相器，或多個層疊的MOSFET反相器。
23.根據權利要求21或22之一所述的設備，所述設備包括參考室，所述參考室含有非匹配引物。
24.根據權利要求23所述的設備，所述設備包括參考輸出檢測器，所述參考輸出檢測器用于監視所述參考室的輸出，以檢測所述設備內的錯誤偏差。
25.根據權利要求24所述的設備，所述設備包括處理器，所述處理器與所述參考輸出檢測器耦合，并且被配置成通過對所述設備進行調整以對檢測的錯誤偏差進行反應，從而消除所述偏差。
26.根據權利要求21或22任一項所述的設備，所述設備包括輸出檢測器，所述輸出檢測器用于監視所述輸出級的數字輸出，以便檢測以下輸出狀態，所述輸出狀態指示核苷酸添加是不可能的。
27.根據權利要求26所述的設備，所述設備包括處理器，所述處理器與所述輸出檢測器耦合并且被配置成通過對所述設備進行調整對檢測到不可能狀態進行反應，從而消除所述不可能狀態。
28.根據權利要求25或27任一項所述的設備，所述處理器被配置成通過改變施加于所述參比電極的偏置電壓進行所述調整。
29.根據權利要求25或27任一項所述的設備，所述處理器被配置成通過改變可編程反相器以調整開關閾來進行所述調整。
30.根據權利要求21至29任一項所述的設備，所述設備包括被配置成檢測不同SNPs的多個所述模塊。
31.一種檢測基因組內單核苷酸多態性SNP的方法，所述方法包括: 在四個反應室中接收流體樣品，每個所述反應室含有不同的堿基A、C、G、T中的一種，和引物； 使用一對離子敏感場效應晶體管ISFETs檢測所述反應室內任何pH改變，所述離子敏感場效應晶體管與每個反應室關聯，每對的所述ISFETs包括各自的傳感膜或共同的傳感膜，所述傳感膜暴露于關聯的反應室內，并且ISFETs對以推拉構型耦合； 將所述推拉ISFETs的輸出端與MOSFET反相器級的輸入端耦合；和 提供來自輸出級的數字輸出，所述數字輸出是依賴于存在于所述傳感膜上的電壓可切換的。
32.根據權利要求31所述的方法，所述方法還包括在參考室上進行所述方法的步驟，所述參考室含有非匹配引物。
33.根據權利要求32所述的方法，所述方法包括監視所述參考室的輸出以檢測所述設備內的錯誤偏差。
34.根據權利要求33所述的方法，所述方法包括通過對所述設備進行調整對檢測到錯誤偏差進行反應，從而消除所述偏差。
35.根據權利要求31所述的方法，所述方法包括監視所述輸出級的數字輸出，以便檢測以下輸出狀態，所述輸出狀態指示核苷酸添加是不可能的。
36.根據權利要求35所述的方法，其中監視由所述輸出級提供的數字輸出包括在真值表中查找所述輸出。
37.根據權利要求35或36任一項所述的方法，所述方法包括通過對所述設備進行調整對檢測到不可能狀態進行反應，從而消除所述不可能狀態。
38.根據權利要求34或37任一項所述的方法，其中進行所述調整包括改變施加于參比電極的偏置電壓。
39.根據權利要求34或37任一項所述的方法，其中進行所述調整包括改變可編程反相器以調整開關閾。
【文檔編號】C12Q1/68GK104204790SQ201380018533
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月19日 優先權日:2012年3月30日
【發明者】穆罕默德列扎·蘇哈巴提, 卡爾文·西姆 申請人:基因奧尼克斯有限公司