戊糖發酵微生物的制作方法
【專利摘要】本發明提供能夠利用C5糖特別是木糖的微生物真核細胞。本發明的另一目的是提供使得真核細胞能夠降解C5糖的改進的蛋白序列。因此，本發明提供包含與SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.8具有至少75％同一性、優選80％同一性、最優選90％同一性、最高度優選95％同一性的氨基酸序列且在真核細胞中具有木糖異構酶活性的蛋白。
【專利說明】戊糖發酵微生物
【技術領域】
[0001] 木糖是植物生物質的主要基礎材料，并與現今生物精煉觀點聚焦的大量主要原 料緊密相關。這類富含木糖的材料的實例包括麥秸、玉米秸桿或木片或其它木材副產品 (Blake A Simmons 等人· Genome Biol. 2008 ;9 (12) : 242)。
[0002] 因此，通過酶促、化學或化學/酶促方法進行的起始材料的水解產生了其他有價 值的糖之外的富含木糖的中間產物（Deepak Kumar等人.Biotechnol Biofuels. 2011; 4:27)。在耦合發酵路線中對富含C5的糖溶液的高效利用對于應用的發酵菌株既是至關重 要的，也是必需的（Sara Fernandes and Patrick Murray, Bioeng Bugs. 2010 ; 1(6) :424)。 特別地，C6酵母（如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))由于較長歷史的培育（最終 以極端耐乙醇和葡萄糖轉化高產量為特點）而成為理想的工作平臺，使得木糖完全不受影 響，從而降低了潛在產量。已知的幾種策略可以避免這種缺陷。此處的關鍵步驟似乎為通 過將木糖異構化為木酮糖以及隨后的C5非還原部分分流到釀酒酵母的常規糖酵解途徑的 修飾級聯而成功地供料木糖。雖然對通過特定轉運蛋白的跨膜攝取木糖的強度和通過C5 旁路可達到的通量密度進行了可能的改進（David Runquist等人Microb Cell Fact. 2009; 8:49)，但是木糖到木酮糖的關鍵異構化步驟在整個過程中成為主要問題。為進行該步驟已 知有兩種主要途徑。第一，采用還原成木糖醇（通過木糖還原酶）和氧化（通過木糖醇脫 氫酶）成木酮糖的后續步驟，導致NADH和NADPH輔因子之間的極大不平衡，并導致木糖醇 在發酵條件下的形成增加 （Maurizio Bettiga 等人.Biotechnol Biofuels. 2008 ;1:16)。 應用木糖異構酶的備選的直接異構化途徑問題在于如下的木糖異構酶基因的可得性不足， 其兼具有在真核微生物（特別是酵母，例如釀酒酵母）中的活性表達、高催化效率、與發酵 溫度相適的溫度和最適pH以及副產物尤其是木糖醇的低抑制。本發明的一個方面是滿足 此需求的蛋白質序列及編碼其的核酸的公開內容。
[0003] 木糖異構酶途徑對于細菌物種和極少的酵母是原生的。相較于氧化還原酶途徑， 異構酶途徑不需要輔因子。異構酶途徑最少由單一的酶--異源木糖異構酶（XI)組成，其 直接將木糖轉化為木酮糖。就氧化還原酶途徑而言，通過共表達異源木酮糖激酶0?)可以 獲得廣率的進一步提1?。
[0004] 首次功能性表達的XI是來源于厭氧真菌Piromyces物種E2(Kuyper M.等人FEMS Yeast Res. 2003 ;4(1):69)的xylA基因。構建了在厭氧條件下能發酵作為唯一碳源的木糖 的單倍體酵母菌株。大部分木糖異構酶是細菌蛋白并且主要障礙是其在酵母中的表達。然 而近期的研究已經證實酵母中的功能性表達（表1)。由于木糖異構酶活性在C5發酵生物 體理念中的關鍵重要性，希望使用最佳的木糖異構酶。就這方面而言，從先前的報道我們得 知Clostridium phytofermentans木糖異構酶提供了較低但卻是可得的最高的技術標準。 因此非常期待在本發明范圍內改進木糖異構酶的有益特性。
[0005] 表1 :所主張的應用于酵母中的木糖異構酶實例
[0006]
【權利要求】
1. 一種蛋白，其包括與SEQ ID NO. 2具有至少75%同一性、優選80%同一性、最優選 90%同一性、最高度優選95%同一性的氨基酸序列且在真核細胞中具有木糖-異構酶活 性。
2. 根據權利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白由SEQ ID N0.2的序列組成，或由與SEQ ID NO. 2具有至少75%同一性、優選80%同一性、最優選90%同一性、最高度優選95%同一 性的氨基酸序列組成并且在真核細胞中具有木糖-異構酶活性。
3. 根據權利要求1或2所述的蛋白，其中所述蛋白由SEQ ID N0.8的序列組成，或由與 SEQ ID NO. 8具有至少75%同一性、優選80%同一性、最優選90%同一性、最高度優選95% 同一性的氨基酸序列組成并且在真核細胞中具有木糖-異構酶活性。
4. 根據權利要求1-3中的一項或多項所述的蛋白，其在7. 5-8. 5的pH范圍內顯示出最 佳的木糖-異構酶活性。
5. 根據權利要求1-4中的一項或多項所述的蛋白，其能通過從真核細胞表達而獲得。
6. -種DNA分子，其包括編碼根據權利要求1-5中的一項或多項所限定的蛋白的DNA 序列，其中所述DNA序列可操作地連接至真核調節序列。
7. 根據權利要求6所述的DNA分子，其中所述DNA分子由SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 7 的序列組成。
8. -種真核細胞，其表達根據權利要求1-5中的一項或多項所述的蛋白，和/或包含根 據權利要求6或7所述的DNA分子。
9. 根據權利要求8所述的真核細胞，其中所述真核細胞為酵母細胞，優選選 自畢赤酵母屬（Pichia)、管囊酵母屬（Pachysolen)、耶氏酵母屬（Yarrowia)、酵母 屬（Saccharomyces)、念珠菌屬（Candida)、Arxula 屬、Ashbya 屬、德巴利酵母屬 (Debaryomyces)、漢遜酵母屬（Hansenula)、Hartaea 屬、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、 許旺酵母屬（Schwanniomyces)、絲抱酵母屬（Trichosporon)、Xanthophylomyces 屬、裂殖 酵母屬（Schizosaccharomyces)、接合酵母屬（Zygosaccharomyces)，最優選為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)〇
10. -種基因改造的酵母細胞，其包括在所述酵母細胞中有功能的外源木糖異構酶基 因，其中所述外源木糖異構酶基因可操作地連接至在所述酵母細胞中有功能的啟動子和終 止子序列，引起根據權利要求1-5所述的蛋白的表達。
11. 根據權利要求10所述的基因改造的酵母細胞，其中所述外源木糖異構酶基因為根 據權利要求6或7所述的DNA分子。
12. 根據權利要求10或11所述的基因改造的酵母細胞，其中所述基因改造的酵母 細胞選自畢赤酵母屬、管囊酵母屬、耶氏酵母屬、酵母屬、念珠菌屬、Arxula屬、Ashbya 屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、Hartaea屬、克魯維酵母屬、許旺酵母屬、絲孢酵母屬、 Xanthophylomyces屬、裂殖酵母屬、接合酵母屬，優選為釀酒酵母。
13. -種真核細胞，其具有通過用根據權利要求6或7所述的DNA序列轉化野生型酵母 菌株而得到的增加水平的木糖異構酶活性。
14. 根據權利要求8-13中的一項或多項所述的真核細胞，其中所表達的蛋白由SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 8的序列組成。
15. 根據權利要求13或14所述的真核細胞，其中所述酵母菌株選自畢赤酵母屬、管囊 酵母屬、耶氏酵母屬、酵母屬、念珠菌屬、Arxula屬、Ashbya屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、 Hartaea屬、克魯維酵母屬、許旺酵母屬、絲孢酵母屬、Xanthophylomyces屬、裂殖酵母屬、 接合酵母屬，優選為釀酒酵母。
16. 根據權利要求1-5中的一項或多項所述的蛋白或根據權利要求8-15中的一項或多 項所述的細胞用于從含木糖-碳源的培養基發酵生物質的用途。
17. 根據權利要求1-5中的一項或多項所述的蛋白或根據權利要求8-15中的一項或多 項所述的細胞作為生物催化劑原位用于或以純化的形式用于生產異構化的糖產物或中間 體的用途，優選生產異構化的糖產物的用途。
18. 根據權利要求6或7所述的DNA分子用于真核細胞轉化的用途。
19. 根據權利要求18所述的用途，其中所述轉化產生根據權利要求8-15中任一項所述 的真核細胞。
20. 根據權利要求8-15中的一項或多項所述的真核細胞用于實現增加的木糖消耗率 的用途。
21. 使用酵母從木糖或葡萄糖-木糖混合物生產乙醇的方法，其中酵母表達根據權利 要求1-5中的一項或多項所述的蛋白，優選為釀酒酵母。
22. 生產選自乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-內酰胺抗生素、 頭孢菌素、生物燃料、丁醇、乙醇、乳酸、衣康酸的發酵產物的方法，所述發酵產物優選為丁 醇，最優選為乙醇，其中所述方法包括以下步驟： a) 以權利要求8-15中的任一項所限定的細胞發酵含有木糖來源的培養基，和任選地， b) 回收所述發酵產物。
【文檔編號】C12N9/90GK104204202SQ201380018485
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年2月7日 優先權日:2012年2月7日
【發明者】Z·德拉戈維奇, C·加默夫, C·賴辛格, U·克特林 申請人:科萊恩產品（德國）有限公司