肽和抗體文庫及其應用的制作方法

文檔序號：467148閱讀：339來源：國知局

肽和抗體文庫及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明一般性涉及抗體文庫、多肽文庫及其應用，包括產生抗體文庫的方法、鑒別靶的抗體的方法，以及鑒別與病癥相關的靶的方法。在具體的實施方案中，本發明涉及包含至少10000個不同成員的抗體文庫，其可用于篩選對感興趣的蛋白質具有高親和性的抗體。
【專利說明】化和抗體文庫及其應用
[0001] 相關申請的交叉參考
[000引本申請要求2012年3月31日申請的PCT申請號PCT/CN2012/000430的優先權，其全文引入本文。發明領域
[0003] 本發明一般性涉及抗體、抗體文庫、多膚、多膚文庫及其應用，包括產生抗體文庫的方法、鑒別祀的抗體的方法及鑒別與病癥相關的祀的方法。在具體的實施方案中，本發明涉及包含至少10000個不同成員的抗體文庫，其可用于篩選對于祀如感興趣的蛋白質具有高親和性的抗體。
[0004] 發明背景
[0005] 在醫學、生物學、藥學等領域中，不同抗體及抗體文庫的需求快速增加。目前，獲得抗體的常用方法包括雜交瘤技術、重組抗體技術、多種分子展示技術，W及組合上述技術與高通量方法的那些技術等等。
[0006] 在常規的抗體制備技術中，通常必需使用天然或重組蛋白質或其片段免疫動物， W使得該動物產生可W特異性識別并結合所述蛋白質的抗體。所述抗體然后可根據不同的要求通過不同的技術方式得自所述動物的細胞。
[0007] 抗體的獲得可包括雜交瘤技術。在該種方法中，在免疫動物之后，需要獲取動物細胞及隨后進行細胞融合，W獲得產生抗體的雜交瘤；然后將雜交瘤克隆并建立株系W產生抗體，隨后純化并鑒別抗體。根據需要，也可W確定抗原的表位。該種雜交瘤技術的詳細步驟可見于各種教科書和手冊（例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies!principles andpractice,3"edition,AcademicPress,1996；ShepherdandDeanMonoclonal antibodies,OxfordUniversityPress, 2000等）。目前該些方法仍廣泛用于抗體制備，但是它們有許多缺點，如較長的制備周期、非常復雜的制備技術及高成本。此外，該些方法不能用于所有蛋白質，例如對于具有不佳溶解性、低免疫原性或毒性的一些抗原，該些方法是不適用的（SinclairNRetal. , 2004Bcell/antibodytolerancetoourownantigens. RrontBiosci9:3019 - 3028)。
[0008]此外，為了獲得具有特異性的單克隆抗體，常用的方式是將化學合成的膚片段與載體蛋白質偶聯，然后使用其免疫小鼠。該種方法可產生針對相同蛋白質的單一表位的抗體。然而，由于不同膚片段的免疫原性的不同，該種方案的整體成功率不夠好，特別是對于示出與宿主具有高同源性的蛋白質，其膚具有非常差的免疫原性，且在小鼠中難W刺激有效的免疫反應。另一常規策略是使用全長蛋白質或其片段作為免疫原，該個策略部分解決了上述問題，但是仍存在一些其它缺陷，如在蛋白質表達中低整體成功率（對于正常表達和純化系統為 30-70%)(ThorstenKohLQiristianSchmi化，StefanWiemann,Annemarie PoustkaandUlrikeKorf.化ew，2003)。對于使用的與宿主動物具有高同源性的蛋白質片段，其在動物中的免疫應答通常較弱，且制備單克隆抗體的成功率相對較低（SinclairNR et吐 2004,Automatedproductionofrecombinanthumanproteinsasresourcefor proteomeresearch,ProteomeScience2008,6:4;SinclairN民（2004)6cell/antibody tolerancetoourownantigens.FrontBiosci9:3019 - 3028)。
[0009] 重組抗體技術可W與各種分子展示技術組合，W產生多個抗原的抗體（與靴具有高親和性），抗原的表位可W同時確定，因此這個策略常用于藥物開發（化ristine Rothe,StefanieUrlinger,MakikoYamashitaetal.TheHumanCombinatorialAntibody LibraryHuCALGOLDCombinesDiversificationofAllSixCDRsAccordingtothe NaturalImmuneSystemwithaNovelDisplayMethodforEfficientSelectionof Hi組-AffinityAntibodies.J.Mol.Biol. (2008) 376, 1182 - 1200, 2007)。但是重組抗體技術的操作是復雜的、高成本的，且其產率相對較低，經常存在非特異性結合，由此該些技術不會長廣泛使用(Levitan,B.Stochasticmodelingandoptimizationofphagedisplay. J.Mol.Biol. 277, 893 - 916 (1998).Bradburyetal, 2004)。
[0010] 如此，現有【技術領域】中所有常規的抗體制備方法均典型包括復雜的操作方法，女口免疫動物、制備雜交瘤細胞等。因此，它們均具有較長的制備周期、復雜的制備技術及高成本等缺點。
[0011] 基于瞻菌體抗體的抗體文庫技術是近年來開發的一種新的抗體制備技術。將在體外克隆的抗體基因片段插入瞻菌體載體中，然后表達；隨后，使用抗原針對表達的抗體文庫進行篩選，從而獲得具有特異性的單克隆瞻菌體抗體。然而，瞻菌體抗體文庫技術需要文庫中極大量抗體W獲得具有高親和性的抗體，該種抗體產生方法仍相對復雜。
[0012] 為了解決上述問題，需要一種制備或篩選抗體的新方法，W省略復雜的、耗時的及高成本的步驟，因此可W快速及有效地制備或篩選具有高親和性的抗體。本發明解決了上述及本領域涉及的其它相關問題。
[001引發明概述
[0014] 一方面，本發明涉及鑒別祀的抗體的方法，所述方法包括；a)提供得自對象如哺乳動物的抗體文庫，其中所述抗體文庫包含少于1〇7個不同種類的抗體；b)將所述祀與所述抗體文庫在適于所述祀與所述抗體文庫中的抗體結合的條件下接觸，如果該種抗體存在與所述抗體文庫中；及C)評估所述祀與所述抗體之間的結合W鑒別所述抗體是所述祀的抗體。在一些實施方案中，所述抗體文庫得自免疫系統尚未受外來祀刺激的對象或哺乳動物。另一方面，本發明涉及特異性結合祀的抗體，其中所述抗體是通過上述方法鑒別的。
[0015] 再一方面，本發明涉及鑒別祀的抗體的抗體文庫，所述抗體文庫得自對象或哺乳動物，所述抗體文庫包含少于1〇7個不同種類的抗體。在一些實施方案中，所述抗體文庫得自免疫系統尚未被外來祀刺激的對象或哺乳動物。
[0016]另一方面，本發明涉及多膚文庫，該多膚文庫包含多個分離的包含不同的隨機氨基酸序列的多膚，其中所述多膚包含大約5-100個氨基酸，優選10-20、10-30、10-40、 10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100個氨基酸，所述多膚不包含切S，不包含3個或更多個相同的連續氨基酸，和/或不包含5個或更多個相同氨基酸。再一方面，本發明涉及產生抗體文庫的方法，該方法包括；a)用上述多膚文庫免疫對象；及b)從所述對象中回收抗體。再一方面，本發明涉及通過上述方法產生的抗體文庫。
[0017] 再一方面，本發明涉及在序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的分離的多膚。在一些實施方案中，本發明涉及序列表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8 或9個分離的多膚。
[0018] 再一方面，本發明涉及多膚文庫，該多膚文庫包含序列表（SEQIDNO: 1-55471) 中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 個或者所有分離的多膚。再一方面，本發明涉及產生抗體文庫的方法，所述方法包括：a)用上述多膚文庫免疫對象；及b)從所述對象中回收抗體。再一方面，本發明涉及通過上述方法產生的抗體文庫。
[0019] 再一方面，本發明涉及特異性結合序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的多膚的分離的抗體。在一些實施方案中，本發明涉及特異性結合序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9個分離的多膚的分離的抗體。
[0020] 再一方面，本發明涉及抗體文庫，該抗體文庫包含特異性結合序列表（SEQID N0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000個或者所有多膚的抗體。
[0021] 再一方面，本發明涉及鑒別祀抗體的膚抗原性序列的方法，所述方法包括；a)將祀抗體與包含序列表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000個或者所有分離多膚的多膚文庫在適于所述祀抗體與所述多膚文庫中的多膚結合的條件下接觸，如果該種膚存在于所述多膚文庫中；及C)評估所述祀抗體與所述多膚之間的結合W鑒別所述祀抗體的膚抗原性序列。
[0022] 再一方面，本發明涉及特異性結合Akt的分離的抗體，該分離的抗體特異性結合包含于氨基酸序列孤GGQKAVKD中的表位。
[0023] 再一方面，本發明涉及特異性結合ERK2的分離的抗體，該分離的抗體特異性結合包含于氨基酸序列HPLGSPGSAS中的表位。
[0024] 再一方面，本發明涉及特異性結合Desmin的分離的抗體，該分離的抗體特異性結合包含于氨基酸序列REIRRYQKST中的表位。
[0025] 再一方面，本發明涉及特異性結合CBL4的分離的抗體，該分離的抗體特異性結合包含于氨基酸序列RSRA服QAYT中的表位。
[0026] 再一方面，本發明涉及特異性結合霍亂毒素的分離的抗體，該分離的抗體特異性結合包含于氨基酸序列陽EREQANTA、EYQQAQLEAE或DSSMSMADSE中的表位。
[0027] 再一方面，本發明涉及特異性結合VEGF的分離的抗體，該分離的抗體特異性結合包含于氨基酸序列VLDFILSMGL、AKRKAGTSPR或RNSDFSAGSP中的表位。
[0028] 再一方面，本發明涉及鑒別與某種病癥相關的祀的方法，所述方法包括；a)將得自患有某種病癥的來源的樣品與抗體文庫接觸，并評估所述樣品中的物質與所述抗體文庫中抗體之間的結合或者缺乏結合，其中所述抗體文庫得自免疫系統尚未被外來祀刺激的對象或哺乳動物及所述抗體文庫包含少于1〇7個不同種類的抗體，或者所述抗體文庫是通過用多膚文庫免疫對象或哺乳動物而獲得的，所述多膚文庫包含具有不同的隨機氨基酸序列的多個分離的多膚，其中所述多膚包含大約5-100個氨基酸，優選10-20U0-30、 10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100個氨基酸，所述多膚不包含切S，不包含3個或更多個相同的連續氨基酸，和/或不包含5個或更多個相同氨基酸，或者所述抗體文庫是通過用多膚文庫免疫對象或哺乳動物而獲得的，所述多膚文庫包含序列表（SEQ IDN0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000個或者所有分離的多膚；b)將得自不具有所述病癥的來源的樣品與上述抗體文庫接觸，并評估所述樣品中的物質與所述抗體文庫中抗體之間的結合或缺乏結合；及C)當在步驟a)和b)中所述物質與所述抗體之間的結合或缺乏結合存在差別時，貝U 鑒別該物質為與所述病癥相關的祀。
[0029] 再一方面，本發明涉及鑒別與病癥相關的祀的方法，所述方法包括；a)將得自患有病癥的來源的樣品與多膚文庫接觸，所述多膚文庫包含具有不同的隨機氨基酸序列的多個分離的多膚，其中所述多膚包含大約5-100個氨基酸，優選10-20、10-30、10-40、10-50、 10-60、10-70、10-80、10-90、或10-100個氨基酸，所述多膚不包含切S，不包含3個或更多個相同的連續的氨基酸，和/或不包含5個或更多個相同的氨基酸，或者多膚文庫包含序列表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、 35000、40000、45000、50000個或者所有分離的多膚，并評估所述樣品中的物質與所述多膚文庫中的多膚之間的結合或缺乏結合；b)將得自不具有所述病癥的來源的樣品與上述多膚文庫接觸，并評估所述樣品中的物質與所述多膚文庫中多膚之間的結合或缺乏結合；及 C)當步驟a)和b)中所述物質與所述多膚之間的結合或缺乏結合存在差別時，則鑒別該物質為與所述病癥相關的祀。
[0030] 再一方面，本發明提供了抗體文庫，其包含；（1)針對具有10-20個氨基酸的隨機膚的抗體，（2)IgG抗體，由從初次用于實驗的（naYve)哺乳動物的脾細胞產生的雜交瘤細胞分泌，（3)IgG抗體，由從用總蛋白質提取物免疫的哺乳動物的脾細胞產生的雜交瘤分泌，所述蛋白質提取物來自完整生物體、一或多種其組織、和/或一或多種其細胞，（4)IgG抗體，由針對一或多種抗原建立的穩定雜交瘤品系分泌；或者（1)-(4)的任意組合。
[0031] 在一個實施方案中，所述抗體文庫包含至少10000個不同成員，當所述抗體文庫用于篩選針對祀或感興趣的蛋白質的抗體時，其成功率為至少85%。
[0032] 在一個實施方案中，本發明的抗體文庫是雜交瘤細胞文庫的形式。
[0033] 在一個實施方案中，本發明的隨機膚；1)不含有半脫氨酸，2)不含有3個或更多個連續的相同氨基酸，3)不含有5個或更多個相同氨基酸。
[0034] 在一個實施方案中，每個隨機膚的初始分值設定為任何值，通過如下步驟選擇隨機膚；1)對于具有潛在糖基化位點的氨基酸，每個潛在的糖基化位點從所述分值中減去1 點，2)每個氨基酸K或R殘基從所述分值中減去4點；基于上述分值，從上至下選擇具有最高分值的希望數量的膚。
[00巧]在一個實施方案中，例如從上至下選擇具有最高分值的10000個膚。在另一實施方案中，例如從上至下選擇具有最高分值的15000、20000、25000、30000、35000、40000、 45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000 個膚。在一個實施方案中，選擇的隨機膚是化學合成的。
[0036] 在一個實施方案中，初次用于實驗的哺乳動物選自小鼠、大鼠和兔。
[0037] 在一個實施方案中，所述完整生物體選自擬南芥、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、果蟲電、斑馬魚、燒蟲、水稻或者玉米等。
[0038] 在一個實施方案中，所述組織選自血液組織、擬南芥花彎、不同發育階段的燒蟲組織，或者小鼠腦組織。
[0039] 在一個實施方案中，所述一或多種細胞選自脾細胞、腫瘤細胞或細胞系，如人腫瘤細胞系。
[0040] 在一個實施方案中，對抗體文庫中的抗體進行親和性成熟。在特定實施方案中，本發明的抗體文庫可用于基于相對少量文庫成員獲得具有高親和性的抗體。
[0041] 再一方面，本發明提供了包含本發明的抗體文庫的組合。
[0042] 另一方面，本發明提供了生物芯片，其包含本發明的抗體文庫。
[0043] 另一方面，本發明提供了篩選針對感興趣的蛋白質的抗體的方法，包括使用本發明的抗體文庫、本發明的組合或者本發明的生物芯片篩選針對所述感興趣的蛋白質的一或多種抗體。
[0044] 在一個實施方案中，本發明的方法包括；(a)將所述感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合，化）選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體或抗體組。
[0045] 在一個實施方案中，本發明的方法包括；(a)將所述感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合，化）選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體或抗體組，（C)將所述感興趣的蛋白質與在步驟化）中選擇的抗體或抗體組的抗體亞組混合，（d)選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體或抗體亞組。在另一實施方案中，本發明的方法進一步包括使用在步驟（d)中選擇的抗體亞組重復步驟（C)和（d)，直至選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體。
[0046] 在另一實施方案中，本發明的方法包括針對幾個感興趣的蛋白質同時篩選，包括 (a)將所述幾個感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合，化）選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組，（C)將所述幾個感興趣的蛋白質的每個蛋白質單獨與在步驟化）中選擇的能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組混合，然后分別選擇能結合各個感興趣的蛋白質每一個的抗體或抗體組。
[0047] 在另一實施方案中，本發明的方法包括針對幾個感興趣的蛋白質同時篩選，包括： (a)將所述幾個感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合，化）選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組，（C)將所述幾個感興趣的蛋白質的每個蛋白質單獨與在步驟化）中選擇的能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組混合，然后分別選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的每一個的抗體或抗體組，（d)將所述幾個感興趣的蛋白質的每一個單獨與在步驟（C)中選擇的能結合各個所述感興趣的蛋白質的抗體或抗體組的抗體亞組混合，（e)分別選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的每一個的抗體或抗體亞組。在另一實施方案中，本發明的方法進一步包括使用在步驟（e)中選擇的抗體亞組重復步驟（d)和（e)，直至分別選擇了能結合所述幾個感興趣蛋白質的每一個的抗體。
[0048] 在一個實施方案中，本發明的方法可W使用高通量篩選裝置進行。
[0049] 在一個實施方案中，本發明方法中使用的高通量篩選裝置是生物芯片，如蛋白質芯片，或者 1 油-〇n-a-chip(LOC)。
[0050] 另一方面，本發明還涉及本發明的抗體文庫在制備篩選感興趣的蛋白質的抗體的裝置或試劑盒中的應用。在一個實施方案中，所述裝置是高通量篩選裝置。在另一實施方案中，所述高通量篩選裝置是生物芯片，如蛋白質芯片，或者1油-on-a-chip(LOC)。
[0051] 在一個實施方案中，所述感興趣的蛋白質是翻譯后修飾的蛋白質或多膚，或者毒性蛋白質或多膚。
[0052] 附圖簡述
[0053] 圖1示出AKT蛋白質SER473磯酸化的測定。
[0054] 圖2示出E服2蛋白質Western印跡核實。
[00巧]圖3示出VEGF蛋白質Western印跡核實。
[0056] 圖4不出CBL4蛋白質Western印跡核實。
[0057] 圖5示出質粒pHG。
[0058]圖6示出質粒pHLDis-VL。
[00則發明詳述
[0060] 為了清晰說明本發明而無限制之意，本發明的詳細描述分成如下部分。
[006。A.定義
[0062]除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語均具有本發明所屬領域技術人員通常理解的相同含義。本文提及的所有專利、申請、公開的申請及其它出版物均W其全部內容并入本文作參考。如果該個章節中的定義與并入本文作參考的專利、申請、公開的申請及其它出版物中的定義相反或者不一致，則W該個章節中的定義而非并入本文作參考的文獻中的定義為主。
[0063] 如本文所用，"一個"是指"至少一個"或者"一或多個"。
[0064] 術語"多膚"、"寡膚"、"膚"和"蛋白質"在本文可互換使用，是指任何長度的氨基酸例如至少 5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000 或更多個氨基酸的聚合物。所述聚合物可W是線性或分支的，其可包含修飾的氨基酸，及其可W被非氨基酸中斷。該術語還涵蓋已經天然或通過干預修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、月旨質化、己醜化、磯酸化，或者任何其它操縱或修飾，如與標記成分綴合。該定義還包含例如含有一或多個氨基酸類似物（包括例如非天然氨基酸等）W及本領域已知的其它修飾的多膚。
[0065]"抗體"是通過位于免疫球蛋白分子的可變區內的至少一個抗原識別位點而能特異性結合祀如碳水化合物、多核巧酸、脂質、多膚等的免疫球蛋白分子，且可W是任何類別的免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、I曲和I班。！巧，是在禽類物種如雞中的主要抗體類型，也包含在該定義中。如本文所用，該術語涵蓋了不僅完整的多克隆或單克隆抗體，而且還包括其片段（如F油、F油'、F(油'）2、Fv)、單鏈（ScFv)、其突變體、天然發生的變體、包含具有需要的特異性的抗原識別位點的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體，及包含需要的特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其它修飾的構型。
[0066] 如本文所用，術語"特異性結合"是指抗體的特異性，由此其優先結合祀抗原，如多膚抗原。在存在其它潛在干擾物質條件下抗體對特定祀的識別是該種結合的一個特性。優選地，特異于或特異性結合祀抗原的抗體或抗體片段與祀抗原的結合親和性高于結合其它非祀物質的親和性。也優選地，特異于或特異性結合祀抗原的抗體或抗體片段避免結合較高百分比的非祀物質如檢測樣品中存在的非祀物質。在一些實施方案中，本發明的抗體或抗體片段避免結合高于大約90%的非祀物質，盡管顯然考慮并優選更高的百分比。例如，本發明的抗體或抗體片段避免結合大約91 %、大約92 %、大約93 %、大約94%、大約95 %、大約96%、大約97%、大約98%、大約99%及大約99%或更多的非祀物質。在其它實施方案中，本發明的抗體或抗體片段避免結合高于大約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %或 70%、或者高于大約75%、或者高于大約80%、或者高于大約85%的非祀物質。
[0067] 如本文所用，術語"特異性結合"也是指多膚的特異性，由此其優先結合祀抗體，女口檢測樣品中的祀抗體。在存在其它抗體或物質的條件下多膚對特定祀抗體的識別是該種結合的一個特性。優選地，特異于或特異性結合抗體的多膚與祀抗體的結合親和性高于與其它非祀抗體或物質的結合親和性。也優選地，特異于或特異性結合祀抗體的多膚避免結合較高百分比的非祀抗體或物質，例如檢測樣品中存在的非祀抗體。在一些實施方案中，本發明的多膚避免結合高于大約90%的非祀抗體或物質，盡管顯然考慮并優選就更高百分比。例如，本發明的多膚避免結合大約91 %、大約92%、大約93%、大約94%、大約95%、大約 96%、大約97%、大約98%、大約99%及大約99%或更多的非祀抗體或物質。在其它實施方案中，本發明的多膚避免結合高于大約10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%、或者高于大約75%、或者高于大約80%、或者高于大約85%的非祀抗體或物質。
[006引如本文所用，術語"抗原"是指由抗體通過其抗原識別位點特異性結合的祀分子。所述抗原可W是單價或多價的，即其可W具有由一或多個抗體識別的一或多個表位。可W 由抗體識別的抗原的種類例如包括多膚、寡糖、糖蛋白、多核巧酸、脂質等。
[006引術語"多核巧酸"、"寡核巧酸"、"核酸"及"核酸分子"在本文可互換使化是指任何長度的核巧酸例如至少8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000或更多個核巧酸的聚合形式，及可包含核糖核巧酸、脫氧核糖核巧酸、其類似物、或者其混合物。該術語僅是指分子的一級結構。因此，該術語包括H鏈、雙鏈及單鏈脫氧核糖核酸值NA),W及H鏈、雙鏈和單鏈核糖核酸（RNA)。其還包括所述多核巧酸的修飾的及未修飾的形式，所述修飾如通過焼化和/或通過加帽修飾。更特別地，術語"多核巧酸"、"寡核巧酸"、"核酸"和"核酸分子"包括聚脫氧核糖核巧酸（含有2-脫氧-D-核糖）、聚核糖核巧酸（含有D-核糖），包括tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，無論是剪接或是非剪接的，是嘿嶺或嚼巧堿基的N-或C-糖巧的任何其它類型的多核巧酸，及含有normucleotidic主鏈的其它聚合物，例如聚醜胺（如膚核酸（PNA))及polymo巧holino(可商購自Anti-Virals,Inc. ,Corvallis,OR.,Neugen e)聚合物，及其它合成的序列特異性核酸聚合物，條件是所述聚合物在構型中含有核堿基，使得可W堿基配對和堿基堆積，如在DNA和RNA中發現的。因此，該些術語包括例如3' -脫氧-2'，5' -DNA，寡脫氧核糖核巧酸N3' -P5'氨基磯酸醋，2' -0-焼基-取代的RNA，DNA與 RNA之間或者PNA與DNA或RNA之間的雜交體，也包括已知類型的修飾，例如標記、焼化、"加帽"、用類似物取代一或多個核巧酸，核巧酸間修飾如具有無電荷鍵（例如甲基麟酸醋、磯酸 H醋、氨基磯酸醋、氨基甲酸醋等）、具有負電荷鍵（例如硫代磯酸醋、二硫代磯酸醋等）及具有正電荷鍵（氨基焼基氨基磯酸醋、氨基焼基磯酸H醋）的那些，含有息垂（pendant)部分的那些，例如蛋白質（包括酶（例如核酸酶）、毒素、抗體、信號膚、聚-k賴氨酸等），具有嵌合劑的那些（例如嚇巧、補骨脂素等），含有馨合物的那些（例如金屬、放射性金屬、測、氧化金屬等的馨合物），含有焼化劑的那些，具有修飾的鍵的那些（例如a異頭核酸等）， W及多核巧酸或寡核巧酸的未修飾形式。
[0070] 如本文所用，意識到術語"核巧"和"核巧酸"包括不僅含有已知嘿嶺和嚼巧堿基的那些部分，而且還含有已經修飾的其它雜環堿基。該種修飾包括甲基化嘿嶺或嚼巧，醜化的嘿嶺或嚼巧，或者其它雜環。修飾的核巧或核巧酸也可W包含在糖部分的修飾，例如其中一或多個輕基極端用團素、脂肪族基團置換，或者功能化為離、胺等等。術語"核巧酸單位" 是指涵蓋核巧與核巧酸。
[0071] 如本文所用，"生物學樣品"是指得自活體或病毒來源或者其它大分子和生物分子來源的任何樣品，包括對象的任何細胞類型或組織，從中可獲得核酸或蛋白質或其它大分子。所述生物學樣品可W是直接得自生物學來源的樣品或被加工的樣品。例如，擴增的分離核酸構成生物學樣品。生物學樣品包括但不限于動物和植物的體液，如血液、血漿、血清、腦脊液、滑液、尿液和汗液、組織和器官樣品及從中衍生的加工的樣品。生物學樣品還包括 ±壤和水樣品及其它環境樣品，病毒，細菌，真菌，藻類，原生動物及其成分。
[0072] 如本文所用，術語"評估"是指包括在獲得關于樣品中存在的分析物的量或濃度的絕對值的意義上及在獲得指數、比率、百分比、目測值或表示樣品中分析物水平的其它值的意義上的定量和定性確定。評估可W是直接或間接評估，實際檢測的化學物質不必當然是分析物自身，可例如是其衍生物或者一些進一步的物質。
[0073] 如本文所用，"血清"是指在除去纖維蛋白凝塊和血液細胞之后獲得的血液的液體部分，與循環血中血漿區別。
[0074] 如本文所用，"血漿"是指血液的液體的無細胞部分，與凝血后獲得的血清區別。
[00巧]如本文所用，"通過重組方式產生"是指使用重組核酸方法的產生方法，所述方法依賴于熟知的表達由克隆的核酸編碼的蛋白質的分子生物學方法。
[0076] 如本文所用，"液體"是指可W流動的任何組合物。因此，液體涵蓋了半固體、糊狀、溶液、水性混合物、凝膠、乳液、乳霜等形式的組合物及其它該類組合物。
[0077]如本文所用，"樣品"是指可含有分析物的任何東西，對其希望進行分析物測定。樣品可W是生物學樣品，如生物學體液或生物學組織。生物學液體例如包括尿液、血液、血漿、血清、唾液、精液、大便、姨液、腦脊液、巧液、粘液、羊水等。生物學組織是細胞聚集體，通常是特定種類與其細胞間物質一起形成人、動物、植物、細菌、真菌或病毒結構的結構材料之一，包括結締組織、上皮組織、肌肉組織和神經組織。生物學組織的實例還包括器官、腫瘤、淋己結、動脈和個體細胞。
[0078] 如本文所用，"疾病或失調"是指生物體中得自例如感染或遺傳缺陷的病理學狀況，特征在于可鑒別的癥狀。
[0079] 如本文所用，"芯片"是指固體基材，具有多個一維、二維或H維顯微結構（micro structure)或者小尺度結構（micro-scalestruc1:ure)，在其上可W進行某些過程，如物理、化學、生物學、生物物理學或生物化學過程等。顯微結構或小尺度結構如通道和孔、電極元件、電磁元件慘入于、建造于或者另外附著于所述基材上，W促進在該芯片上的物理學、生物物理學、生物學、生物化學、化學反應或過程。所述芯片在一維可W是薄的，在其它維度可具有不同形狀，例如矩形、圓形、楠圓形或者其它不規則形狀。本發明的芯片的主要表面的大小可W大幅度變化，例如從大約Imm2至大約0. 25m2。優選地，芯片的大小是大約4mm2 至大約25cm2,特征性尺寸為大約Imm至大約5cm。芯片表面可W是平或不平的。具有不平表面的芯片在其表面上可包含構造的通道或孔。
[0080] 應理解本文描述的本發明的方面和實施方案包括由方面和實施方案"組成"和/ 或"基本上組成"。
[0081] 在該個發明公開中，本發明的各個方面均W范圍形式呈現。應理解范圍形式的描述只是為了方便和簡潔，不應理解為對本發明范圍的不可改變的限制。因此，范圍的描述應被認為是具有特別掲示的所有可能的子范圍W及該范圍內的各個數值。例如，1-6范圍的描述應理解為具有特別掲示的子范圍，如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，W及該范圍內的各個數字，例如1、2、3、4、5和6。無論范圍的寬度如何均如此適用。
[0082] 本發明的其它目的、優勢和特征通過如下說明書結合附圖將顯而易見。
[0083] B.鑒別祀的抗體的方法
[0084] -方面，本發明涉及鑒別祀的抗體的方法，所述方法包括；a)提供得自對象如哺乳動物的抗體文庫，其中所述抗體文庫包含少于1〇7個不同種類抗體；b)將所述祀與所述抗體文庫在適于所述祀與所述抗體文庫中的抗體之間結合的條件下接觸，如果該種抗體存在于所述抗體文庫中；及C)評估所述祀與所述抗體之間的結合，W鑒別所述抗體為所述祀的抗體。
[0085] 任何合適的抗體文庫均可用于本發明方法中。在一些實施方案中，抗體文庫得自免疫系統尚未被外來祀刺激的對象或哺乳動物。典型地，所述對象或哺乳動物尚未用分離及純化形式的祀免疫，或者至少未主動免疫。在一些實例中，所述對象或哺乳動物尚未用含有所述祀的組合物免疫，或者至少未主動免疫。在其它實例中，所述對象或哺乳動物尚未用其中所述祀組成其主要部分或百分比的組合物免疫，或者至少未主動免疫。例如，如果所述祀是特定的多膚，則所述對象或哺乳動物可W用含有所述祀多膚的細胞、組織或生物體免疫。然而，由于所述細胞、組織或生物體不含有有意義量的祀多膚，或者祀多膚不組成所述細胞、組織或生物體的主要部分或百分比，則所述對象或哺乳動物仍被認為是未受外來祀多膚刺激。
[0086] 在一些實施方案中，所述抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。例如，抗體文庫中的抗體可通過適當的免疫得自宿主，抗體的氨基酸序列仍未知。在其它實例中，抗體文庫中的抗體通過適當的免疫而可W最初得自宿主。一旦獲得抗體，則抗體的氨基酸序列可W通過任何合適的方法確定，例如蛋白質測序方法。在該種情況中，抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的，因為所述抗體不是從頭合成的，而是用祀文庫免疫產生的。相反， Maoetal.，化Uire,28 (11): 1195-1178 (2010)描述了抗體文庫的重新合成，其抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前已知。
[0087] 在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。例如，如果抗體文庫中的抗體得自哺乳動物，則抗體文庫中的抗體可包含完整（或完全）結構的IgG、 IgM、IgA、I曲和/或I班分子。如果抗體文庫中的抗體得自禽類物種如雞，則抗體文庫中的抗體可包含完整（或完全）結構的I巧分子。
[0088] 抗體文庫可W使用任何合適的免疫原通過任何合適的方法產生。在一些實施方案中，抗體文庫是通過用多個多膚免疫哺乳動物產生的，所述多膚包含不同的隨機的氨基酸序列。所述多膚可包含任何合適數目的氨基酸。在一些實施方案中，所述多膚包含大約 5-100 個氨基酸，優選 10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90 或 10-100 個氨基酸。所述多膚可包含任何合適類型氨基酸和/或氨基酸序列。在一些實施方案中，所述多膚不包含切S，不包含3個或更多個相同的連續氨基酸，和/或不包含5個或更多個相同的氨基酸。
[0089] 用于產生抗體文庫的多膚可W通過任何合適的標準或方法選擇。在一些實施方案中，所述多膚通過如下標準選擇；a)為所有候選多膚指定初始的相同分值；b)候選多膚中每個潛在的糖基化位點則從初始分值中減去I點；C)候選多膚中每個Lys或Arg殘基則從初始分值中減去4點；及d)根據免疫哺乳動物希望的多膚數目選擇具有最高可能分值的候選多膚。
[0090] 任何合適數目的多膚均可用于免疫哺乳動物W產生抗體文庫。在一些實施方案中，至少10000個多膚用于免疫哺乳動物W產生抗體文庫。在一些實施方案中，至少10000、 15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、 75000、80000、85000、90000、95000或100000個不同多膚用于免疫哺乳動物W產生抗體文庫。典型地，一個哺乳動物用較少數目的多膚免疫，多個哺乳動物的免疫覆蓋指定數目的免疫。在一些實施方案中，一個哺乳動物可W用大約1、2、3、4、5、10、15、20或25個不同多膚免疫。例如，如果一個哺乳動物用10個不同多膚免疫，及100000個不同多膚指定使用，貝U 可W免疫10000個哺乳動物覆蓋指定使用的100000個不同多膚。
[0091] 所述多膚可包含任何合適數目的氨基酸。在一些實施方案中，所述多膚可包含 5-100 個氨基酸，優選 10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90 或 10-100 個氨基酸。在一些實施方案中，所述多膚可包含大約1〇、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 個氨基酸。所述多膚可包含任何合適類型的氨基酸。在一些實施方案中，所述多膚可包含天然和/或非天然氨基酸。所述多膚可W通過任何合適方法產生。在一些實施方案中，所述多膚是通過化學合成和/或重組產生方法產生的。
[0092] 在一些實施方案中，所述多膚通過如下標準從候選多膚中選擇；a)每個候選多膚包含大約10個氨基酸，不包括切S;b)每個候選多膚不包含3個或更多個相同的連續氨基酸；C)每個候選多膚不包含5個或更多個相同氨基酸油每個候選多膚指定初始分值為 10 ;e)候選多膚中每個潛在的糖基化位點則從初始分值中減去1點；f)候選多膚中每個 Lys或Arg殘基則從初始分值中減去4點；及g)選擇具有最高分值的至少10000個候選多膚。
[0093] 任何合適的對象或哺乳動物均可用于產生抗體文庫。在一些實施方案中，抗體文庫是由免疫系統尚未被有意刺激W產生指定祀的抗體的對象或哺乳動物產生。在一些實施方案中，所述哺乳動物是小鼠，大鼠，兔，山羊，牛科動物如公牛、奶牛或水牛，犬科動物如狗，豬科動物如豬，或者馬。在一些實施方案中，所述哺乳動物可W是人。其它非哺乳動物對象如禽類動物如雞佑alius)也可用于產生抗體文庫。其它舉例的禽類動物包括鶴冀 (Co1:u;rnix)、火雞（Meleagrisgallopavo)、鴨、鶴和日本鶴冀（Coturnixjaponica)。
[0094] 在一些實施方案中，抗體文庫可W通過用完整的生物體、組織、細胞或者所述生物體、組織或細胞的全部蛋白質提取物免疫對象或哺乳動物而產生，其中所述完整生物體、組織、細胞與所述祀是免疫學不同的。例如，所述祀可W不或者可W不期望包含于用作免疫原的所述完整生物體、組織、細胞或者所述生物體、組織或細胞的全部蛋白質提取物中。在另一實例中，所述祀可W包含于用作免疫原的所述完整生物體、組織、細胞或者所述生物體、組織或細胞的全部蛋白質提取物中，但是僅組成所述完整生物體、組織、細胞或者所述生物體、組織或細胞的全部蛋白質提取物的一小部分或無意義部分。
[0095] 任何合適的完整生物體均可W使用。在一些實施方案中，可W使用擬南芥、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、果禍、斑馬魚、秀麗隱桿線蟲（Caenorh油ditiselegans)、水稻或玉米。
[0096] 任何合適的組織均可W使用。在一些實施方案中，可W使用血液、擬南芥芽、不同發育階段的秀麗隱桿線蟲組織或者小鼠腦組織。
[0097] 任何合適的細胞均可W使用。在一些實施方案中，可W使用脾細胞、腫瘤細胞或細胞系，例如人腫瘤細胞系。
[0098] 在一些實施方案中，抗體文庫由用與所述祀免疫學不同的抗原免疫的哺乳動物產生。
[0099] 在一些實施方案中，所述抗體文庫；a)由用多個多膚免疫的哺乳動物產生，所述多膚包含不同的隨機的氨基酸序列；b)由其免疫系統未被有意刺激的哺乳動物產生；C)由用完整生物體、組織、細胞或所述生物體、組織或細胞的全部蛋白質提取物免疫的哺乳動物產生；d)由用與所述祀免疫學不同的抗原免疫的哺乳動物產生；或者e)上述a)-d)的任意組合。
[0100] 所述抗體文庫可包含任何合適類型的抗體。例如，所述抗體文庫可包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。抗體文庫中的抗體在其從所述對象或哺乳動物中獲得后可W分離、純化、處理和/或修飾。
[0101] 在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。在免疫學中，親和性成熟是在免疫應答期間B細胞產生對于抗原具有增加的親和性的抗體的過程。重復暴露于相同抗原，宿主將產生持續更高親和性的抗體。二次應答可引出與初次應答相比具有幾個對數倍增高的親和性的抗體。與天然原型一樣，體外親和性成熟基于突變和選擇的原理。體外親和性成熟已經成功用于優化抗體、抗體片段或其它膚分子如抗體模擬物。CDR內部的隨機突變可W使用任何合適方法導入，例如放射、化學誘變或者易錯PCR。此外，遺傳多樣性可W通過鏈改組而增加。使用展示方法如瞻菌體展示方法的兩或H輪突變和選擇循環通常獲得具有在低納摩爾范圍親和性的抗體。見例如Roskosetal.，（2007).Stefanmibel. ed.HandbookofTherapeuticAntibodies.Weinheim:Wiley-VCH.PP. 145 - 169。
[0102] 抗體文庫可包含任何合適數目的不同抗體。在一些實施方案中，抗體文庫包含至少 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、 70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000 個不同抗體。
[0103] 抗體文庫中的抗體可W任何合適形式膽存、運輸和/或使用。在一些實施方案中，至少一些抗體固定在固體表面上。在一些實施方案中，至少1%、5%、10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或者所有抗體均固定在固體表面上。可W使用任何合適的固體表面。例如，所述固體表面可W是管如試管的一部分、平板如微滴定平板上的孔、珠、或者生物芯片。
[0104] 所述抗體文庫可W任何合適方式或形式篩選。例如，可W獲得雜交瘤細胞并從所述雜交瘤細胞克隆抗體基因。抗體分子可W從編碼基因中表達。抗體分子可W置于合適的測定形式中，如ELISA平板，W進行篩選。在另一實例中，腹水或純化的抗體可用于篩選。在再一個實例中，可W直接培養雜交瘤細胞，并可W將上清用于篩選中。
[0105] 抗體文庫可W在任何合適測定形式中篩選。在一些實施方案中，祀-抗體復合物可W通過如下方式評估；酶聯免疫吸附測定巧LISA)，免疫印跡，免疫沉淀，放射性免疫測定化IA)，免疫染色，膠乳凝集，間接血凝測定（IHA)，補體結合，間接免疫英光測定（IFA)，濁度法，流式細胞計量術，等離子共振測定，化學發光測定，側向流免疫測定法，U-捕獲測定，抑制測定或者親合力測定。在一些實施方案中，祀-抗體復合物可W在均質或異質測定形式中評估。
[0106] 所述祀可W是任何合適的物質。舉例的祀包括細胞、細胞器、病毒、顆粒、分子，或者其聚集體或復合物，或者分子的聚集體或復合物。舉例的細胞可W是有機或無機分子。舉例的有機分子可W是氨基酸，膚，蛋白質，如抗體或受體，核巧，核巧酸，寡核巧酸，核酸如 DNA或RNA，維生素，單糖，寡糖，碳水化合物，脂質，或其復合物。在一些實施方案中，所述祀是多膚。舉例的多膚包括線性多膚、可溶多膚、修飾的多膚、毒性多膚，或者導致對象中自身免疫的多膚。
[0107] 所述祀可W任何合適的方式或順序與抗體文庫中的抗體接觸。例如，所述祀可W 一次或同時與抗體文庫中所有抗體接觸。或者，所述祀可W與抗體文庫中的部分抗體平行或相繼地接觸。
[0108] 在一些實施方案中，所述祀與抗體文庫中抗體亞組接觸W確定所述抗體亞組是否包含特異性結合所述祀的抗體。一旦確定所述抗體亞組包含特異性結合所述祀的抗體，貝U 該方法可進一步包括步驟：a)將所述抗體亞組分成更小的抗體亞組；及b)與所述祀接觸W 確定所述更小的抗體亞組是否包含特異性結合所述祀的抗體。在一些實施方案中，可W重復步驟a)和b)直至鑒別出特異性結合所述祀的各個抗體。
[0109] 本發明的方法可用于鑒別特異性結合任何合適數目祀的抗體。在一些實施方案中，本發明的方法可用于鑒別特異性結合單個祀的抗體。在一些實施方案中，本發明的方法可用于鑒別特異性結合多個祀如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 或更多個祀的抗體。
[0110] 在一些實施方案中，將抗體文庫與多個祀接觸W鑒別特異性結合所述多個祀的抗體或抗體組。在一些實施方案中，所述方法可進一步包括將多個祀的每一個與鑒別的抗體或抗體組接觸W鑒別特異性結合多個祀的每一個的抗體或抗體組。
[0111] 在一些實施方案中，所述方法可進一步包括；a)將鑒別的抗體或抗體組分成更小的抗體亞組；及b)將多個祀的每一個與更小的抗體亞組接觸W確定所述更小的抗體亞組是否包含特異性結合多個祀的每一個的抗體。在一些實施方案中，可W重復步驟a)和b)，直至鑒別出特異性結合多個祀的每一個的各個抗體。
[0112] 可W進行本發明的方法W獲得鑒別特異性結合指定祀的抗體的任何合適的、預期的或希望的成功率。通常，所述成功率依賴于一或多種因素，如祀的類型、祀的數目、抗體文庫的大小、抗體文庫中抗體的類型和品質、產生抗體或抗體文庫的過程W及篩選測定形式等。在一些實施方案中，鑒別特異性結合祀的抗體的成功率是至少10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施方案中，所述抗體文庫包含至少10000個不同抗體，鑒別特異性結合祀的抗體的成功率為至少80%、 85%'90%'95%'96%'97%'98%'99% 或 100%。
[0113] 盡管上文使用得自哺乳動物的抗體文庫描述或說明鑒別祀的抗體的方法，但是本發明方法中也可W使用得自非哺乳動物對象如禽類動物如雞的抗體文庫。
[0114] 另一方面，本發明涉及特異性結合祀的抗體，其中所述抗體是通過上述方法鑒別的。
[0115] C.抗體、抗體文庫、多膚、多膚文庫及其應用
[0116] 再一方面，本發明涉及抗體文庫W鑒別祀的抗體，所述抗體文庫得自對象或哺乳動物及所述抗體文庫包含少于1〇7個不同種類抗體。在一些實施方案中，所述抗體文庫得自免疫系統未被祀外來刺激的對象或哺乳動物。
[0117] 抗體文庫可W通過任何合適方法產生。在一些實施方案中，抗體文庫；a)是由用多個多膚免疫的哺乳動物產生的，所述多膚包含不同的隨機的氨基酸序列；b)是由免疫系統未被有意刺激的哺乳動物產生的；C)是由用完整生物體、組織、細胞或者所述生物體、組織或細胞的全部蛋白質提取物免疫的哺乳動物產生的；d)是由用與所述祀免疫學不同的抗原免疫的哺乳動物產生的；或者e)上述a)-d)的任意組合。
[0118] 抗體文庫可包含任何合適數目的抗體。在一些實施方案中，所述抗體文庫包含至少 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、 70000、75000、80000、85000、90000、95000、或 100000 個不同抗體。
[0119] 抗體文庫可包含任何合適類型的抗體。在一些實施方案中，抗體文庫包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。在一些實施方案中，抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。
[0120] 抗體文庫中的抗體在其得自所述對象或哺乳動物之后可W被分離、純化、處理和/ 或修飾。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。
[0121] 再一方面，本發明涉及多膚文庫，所述多膚文庫包含多個分離的包含不同的隨機氨基酸序列的多膚，其中所述多膚包含大約5-100個氨基酸，優選10-20、10-30、10-40、 10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100個氨基酸，所述多膚不包含切S、不包含3個或更多個相同的連續的氨基酸，和/或不包含5個或更多個相同的氨基酸。在一些實施方案中，所述多膚可包含大約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸。
[0122] 所述多膚可W通過任何合適的標準或方法選擇。在一些實施方案中，所述多膚通過如下標準選擇；a)為所有候選多膚指定初始的相同的分值；b)候選多膚中每個潛在的糖基化位點則從初始分值中減去1點；C)候選多膚中每個Lys或Arg殘基則從初始分值中減去4點；及d)根據希望的多膚數目選擇具有最高可能分值的候選多膚。
[0123] 所述多膚文庫可包含任何合適數目的膚。在一些實施方案中，所述多膚文庫包含至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、60000、 70000、80000、90000、100000或更多個不同的多膚。在一些實施方案中，所述多膚文庫包含至少10000個不同的多膚。
[0124] 所述多膚可包含任何合適類型的氨基酸。在一些實施方案中，所述多膚可包含天然和/或非天然氨基酸。所述多膚可W通過任何合適方法產生。在一些實施方案中，所述多膚是通過化學合成和/或重組產生方法產生的。
[0125] 多膚文庫可用于任何合適的目的。例如，多膚文庫可用于產生抗體文庫。
[0126] 再一方面，本發明涉及產生抗體文庫的方法，所述方法包括；a)用上述多膚文庫免疫對象；及b)從所述對象回收抗體。
[0127] 抗體文庫中的抗體在其得自所述對象或哺乳動物之后可W被分離、純化、處理和/ 或修飾。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。在一些實施方案中，本發明的方法可進一步包括使用上述多膚文庫親和性純化從對象回收的抗體。
[012引所述對象可W用文庫中的多膚W任何合適的方式或順序免疫。典型地，單個對象或哺乳動物用較少數目的多膚免疫，多個哺乳動物免疫覆蓋指定數目的免疫。在一些實施方案中，單個對象或哺乳動物可W用大約1、2、3、4、5、10、15、20或25個不同的多膚免疫。例女口，如果單個哺乳動物用10個不同的多膚免疫及計劃使用100000個不同的多膚，則可W免疫10000個哺乳動物覆蓋計劃使用的100000個不同多膚。在一些實施方案中，一個對象或哺乳動物用文庫中一組大約5-20個多膚免疫例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19個不同多膚免疫，多個對象用文庫中多組大約5-20個多膚免疫，大約5-20個多膚的多個組涵蓋文庫中所有多膚。
[0129] 再一方面，本發明涉及抗體文庫，其是通過本發明方法產生的。
[0130] 所述抗體文庫可包含任何合適數目的抗體。在一些實施方案中，所述抗體文庫包含至少 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、 65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000 個不同抗體。抗體文庫可包含任何合適類型的抗體。在一些實施方案中，抗體文庫包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。在一些實施方案中，抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。
[0131] 抗體文庫中的抗體在其得自所述對象或哺乳動物之后可W被分離、純化、處理和/ 或修飾。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。
[013引再一方面，本發明涉及序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的分離的多膚。在一些實施方案中，本發明涉及序列表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9 個分離的多膚。所述分離的多膚可W是組合物、組合、復合物、試劑盒或者產品的任何合適形式。所述分離的多膚可W通過任何合適方法產生，例如化學合成、重組產生或者其組合。
[0133] 再一方面，本發明涉及多膚文庫，所述多膚文庫包含序列表（SEQIDNO: 1-55471) 中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 個或者所有分離的多膚。
[0134] 所述多膚文庫可用于任何合適目的。例如，多膚文庫可用于產生抗體文庫。
[01巧]再一方面，本發明涉及產生抗體文庫的方法，所述方法包括；a)用上述多膚文庫免疫對象；及b)從所述對象中回收抗體。
[0136] 抗體文庫中的抗體在其從所述對象或哺乳動物中獲得之后可W被分離、純化、處理和/或修飾。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。在一些實施方案中，本發明的方法可進一步包括使用上述多膚文庫對自所述對象中回收的抗體進行親和性純化。
[0137] 再一方面，本發明涉及抗體文庫，其是通過上述方法產生的。
[0138] 抗體文庫可包含任何合適數目的抗體。在一些實施方案中，所述抗體文庫包含至少 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、 70000、75000、80000、85000、90000、95000、或 100000 個不同抗體。
[0139] 抗體文庫可包含任何合適類型的抗體。在一些實施方案中，抗體文庫包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。在一些實施方案中，抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。
[0140] 抗體文庫中的抗體在其從所述對象或哺乳動物中獲得后可W被分離、純化、處理和/或修飾。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。
[014。再一方面，本發明涉及分離的抗體，其特異性結合序列表（SEQIDNO: 1-55471) 中列出的多膚。在一些實施方案中，本發明涉及分離的抗體，其特異性結合序列表（SEQID NO: 1-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9個分離的多膚。所述分離的抗體可W是組合物、組合、復合物、試劑盒或產品的任何合適形式。分離的抗體可W通過任何合適方法產生，例如免疫宿主、各種展示技術如瞻菌體展示技術、雜交瘤技術、重組產生或者其組合。
[0142] 再一方面，本發明涉及抗體文庫，所述抗體文庫包含特異性結合序列表（SEQ IDN0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000個或者所有多膚的抗體。
[0143] 抗體文庫可包含任何合適類型的抗體。在一些實施方案中，抗體文庫包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。在一些實施方案中，抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。
[0144] 抗體文庫中的抗體在其得自所述對象或哺乳動物之后可W被分離、純化、處理和/ 或修飾。在一些實施方案中，抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。
[0145] D.鑒別祀抗體的膚抗原性序列的方法
[0146] 再一方面，本發明涉及鑒別祀抗體的膚抗原性序列的方法，所述方法包括；a)將祀抗體與多膚文庫在適于所述祀抗體與所述多膚文庫中多膚之間結合的條件下接觸，如果該種多膚存在于所述多膚文庫中的話，所述多膚文庫包含序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 個或者所有分離的多膚；及C)評估所述祀抗體與所述多膚之間的結合，W鑒別所述祀抗體的膚抗原性序列。
[0147] 所述祀抗體可W與多膚文庫中的多膚W任何合適方式或順序接觸。例如，所述祀抗體與多膚文庫中的所有多膚可W-次或同時接觸。或者，祀抗體可W與多膚文庫中的一部分多膚平行或相繼接觸。
[014引在一些實施方案中，將祀抗體與多膚文庫中的多膚亞組接觸W確定所述多膚亞組是否包含特異性結合祀抗體的多膚。一旦確定了所述多膚亞組包含特異性結合祀抗體的多膚，則所述方法可進一步包括；a)將所述多膚亞組分成更小的多膚亞組；及b)將祀抗體與所述更小的多膚亞組接觸W確定該個更小的多膚亞組是否包含特異性結合祀抗體的多膚。可W重復步驟a)和b)，直至鑒別出特異性結合祀抗體的各個多膚。
[0149] 本發明的方法可用于鑒別單個祀抗體的膚抗原性序列。本發明的方法也可W用于鑒別多個祀抗體的膚抗原性序列。
[0150] 一旦鑒別出祀抗體的膚抗原性序列，則本發明的方法可包括進一步的鑒別后步驟。在一些實施方案中，所述方法可進一步包括分離特異性結合祀抗體的多膚。在一些實施方案中，所述方法可進一步包括確定分離的多膚的氨基酸序列。
[0151] 本發明的方法可用于任何合適的目的。在一些實施方案中，本發明的方法可用于鑒別祀抗體的膚抗原性序列，所述祀抗體是生物標記，例如診斷或預后生物標記。
[0152]E.特定祀的分離的抗體
[0153] 再一方面，本發明涉及特異性結合Akt的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列孤GGQKAVKD中包含的表位。
[0154] 再一方面，本發明涉及特異性結合ERK2的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列HPLGSPGSAS中包含的表位。
[0155] 再一方面，本發明涉及特異性結合Desmin的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列REIRRYQKST中包含的表位。
[0156] 再一方面，本發明涉及特異性結合CBL4的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列RSRA服QAYT中包含的表位。
[0157] 再一方面，本發明涉及特異性結合霍亂毒素的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列FEEREQANTA、EYQQAQLEAE或DSSMSMADSE中包含的表位。
[015引再一方面，本發明涉及特異性結合VEGF的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列VLDFILSMGL、AKRKAGTSPR或RNSDFSAGSP中包含的表位。
[0159] 上述抗體可W是任何合適類型的抗體。在一些實施方案中，所述抗體可W是多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。
[0160] 上述抗體可W通過任何合適方法產生，通過用祀多膚免疫宿主、通過瞻菌體展示或者重組產生方法等。上述抗體可W進一步被純化、處理和/或修飾。在一些實施方案中，上述抗體可W是親和性成熟的。
[0161]F.鑒別與病癥相關的祀的方法
[0162] 再一方面，本發明涉及鑒別與病癥相關的祀的方法，所述方法包括；a)將得自患有病癥的來源的樣品與抗體文庫接觸，并評估所述樣品中的物質與所述抗體文庫中的抗體之間的結合或缺乏結合情況，其中所述抗體文庫得自對象或哺乳動物，優選免疫系統未被祀外來刺激，所述抗體文庫包含少于1〇7個不同種類的抗體，或者所述抗體文庫是通過用多膚文庫免疫對象或哺乳動物獲得的，所述多膚文庫包含多個分離的包含不同的隨機的氨基酸序列的多膚，其中所述多膚包含大約10-20個氨基酸，所述多膚不包含切S、不包含3個或更多個相同的連續的氨基酸，和/或不包含5個或更多個相同的氨基酸，或者所述抗體文庫是通過用多膚文庫免疫對象獲得的，所述多膚文庫包含序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 個或者所有分離的多膚；b)將得自不具有所述病癥的來源的樣品與上述抗體文庫接觸，并評估所述樣品中的物質與所述抗體文庫中抗體之間的結合或缺乏結合情況；及C)當步驟a) 和b)中所述物質與所述抗體之間的結合或缺乏結合存在差別時，鑒別物質為與所述病癥相關的祀。
[0163] 本發明的方法可用于任何合適目的。在一些實施方案中，本發明的方法用于鑒別與對象中病癥相關的祀。在一些實施方案中，本發明的方法用于鑒別與疾病或失調相關的祀。
[0164] 本發明的方法可用于鑒別與一種病癥相關的祀。或者，本發明的方法可用于鑒別與病癥相關的多個祀。再或者，本發明的方法可用于鑒別與一種病癥相關的多個祀。再或者，本發明的方法可用于鑒別與多種病癥相關的多個祀。
[0165] 所述物質與抗體之間的結合或缺乏結合中的差別可W通過任何合適方式評估。在一些實施方案中，步驟a)和b)中所述物質與抗體之間的結合或缺乏結合中的差別是定性的。在一些實施方案中，步驟a)和b)中所述物質與抗體之間的結合或缺乏結合的差別是定量的。在一些實施方案中，步驟a)中所述物質與抗體之間的結合及步驟b)中所述物質與抗體之間的缺乏結合鑒別出所述物質為與所述病癥相關的祀。在一些實施方案中，步驟 a)中所述物質與抗體的缺乏結合及步驟b)中所述物質與抗體的結合鑒別出所述物質是與所述病癥相關的祀。
[0166] 所述祀可W是任何合適的物質。舉例的祀包括細胞、細胞器、病毒、顆粒、分子，或者其聚集體或復合物，或者分子的聚集體或復合物。舉例的細胞可W是有機或無機分子。舉例的有機分子可W是氨基酸，膚，蛋白質，例如抗體或受體，核巧，核巧酸，寡核巧酸，核酸，如DNA或RNA，維生素，單糖，寡糖，碳水化合物，脂質，或者其復合物。在一些實施方案中，所述祀是多膚。舉例的膚包括線性多膚、可溶多膚、修飾的多膚、毒性多膚或者導致對象中自身免疫的多膚。
[0167] 再一方面，本發明涉及鑒別與病癥相關的祀的方法，所述方法包括；a)將得自患有病癥的來源的樣品與多膚文庫接觸，所述多膚文庫包含多個分離的包含不同的隨機氨基酸序列的多膚，其中所述多膚包含大約10-20個氨基酸，所述多膚不包含切S、不包含3個或更多個相同的連續的氨基酸，和/或不包含5個或更多個相同的氨基酸，或者多膚文庫包含序列表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、 30000、35000、40000、45000、50000個或所有分離的多膚，并評估所述樣品中的物質與所述多膚文庫中多膚之間的結合或缺乏結合；b)將得自不具有所述病癥的來源的樣品與上述多膚文庫接觸，并評估所述樣品中的物質與所述多膚文庫中多膚之間的結合或缺乏結合；及C)當步驟a)和b)中所述物質與所述多膚之間的結合或缺乏結合中存在差別時，則鑒別物質為與所述病癥相關的祀。
[016引本發明的方法可用于任何合適目的。在一些實施方案中，本發明的方法用于鑒別與對象中病癥相關的祀。在一些實施方案中，本發明的方法用于鑒別與疾病或失調相關的祀。
[0169] 本發明的方法可用于鑒別與一種病癥相關的祀。或者，本發明的方法可用于鑒別與病癥相關的多個祀。再或者，本發明的方法可用于鑒別與一種病癥相關的多個祀。再或者，本發明的方法可用于鑒別與多種病癥相關的多個祀。
[0170] 所述物質與抗體之間的結合或缺乏結合的差別可W任何合適方式評估。在一些實施方案中，在步驟a)和b)中所述物質與多膚之間的結合或缺乏結合中的差別是定性的。在一些實施方案中，步驟a)和b)中所述物質與多膚之間的結合或缺乏結合中的差別是定量的。在一些實施方案中，步驟a)中所述物質與多膚的結合及步驟b)中所述物質與多膚的缺乏結合鑒別出所述物質是與所述病癥相關的祀。在一些實施方案中，步驟a)中所述物質與多膚之間的缺乏結合與步驟b)中所述物質與多膚之間的結合鑒別出所述物質是與所述病癥相關的祀。
[0171] 所述祀可W是任何合適的物質。舉例的祀包括細胞、細胞器、病毒、顆粒、分子，或者其聚集體或復合物，或者分子的聚集體或復合物。舉例的細胞可W是有機或無機分子。舉例的有機分子可W是氨基酸，膚，蛋白質，例如抗體或受體，核巧，核巧酸，寡核巧酸，核酸，如DNA或RNA，維生素，單糖，寡糖，碳水化合物，脂質，或者其復合物。在一些實施方案中，所述祀是多膚。舉例的多膚包括線性多膚，可溶多膚，修飾的多膚，毒性多膚或者導致對象中自身免疫的多膚。在一些實施方案中，所述祀包含抗體。
[0172]G.舉例的實施方案
[0173] 除非特別指出，本文使用的所有技術和科學術語均具有本領域已知的其通常的含義。除非特別指出，所有專利、專利申請、出版物、GenBank序列、網站及其它掲示的材料均并入本文作參考。
[0174] 關于蛋白質的抗體，其通常僅識別蛋白質的幾個氨基酸。當針對隨機的氨基酸序列制備的不同抗體的數目是足夠的時，該些抗體可構成抗體文庫。使用該種文庫，可W針對感興趣的蛋白質進行篩選，W獲得能識別所述蛋白質的抗體。
[0175] 此外，關于特定的生物體，如小鼠，如果其某一組織的總蛋白質提取物用于免疫動物，然后可W制備相應的抗體文庫，該種抗體文庫也可W用于篩選對所述生物體某一蛋白質具有高親和性的抗體。初次用于實驗的哺乳動物可用于進行雜交瘤融合，W篩選能分泌 IgG抗體的雜交瘤細胞，該些雜交瘤細胞也可W用于構建抗體文庫W篩選抗體。
[0176] 因此，在一些實施方案中，本發明提供了抗體文庫W篩選抗體，及使用所述抗體文庫篩選感興趣的蛋白質的抗體的方法。特別地，本發明涉及具有至少10000個不同成員的抗體文庫，其可用于篩選對感興趣的蛋白質具有高親和性的抗體。
[0177] 一方面，本發明提供了抗體文庫，其包含；（1)針對具有10-20個氨基酸的隨機膚的抗體，（2)IgG抗體，由從初次用于實驗的哺乳動物的脾細胞產生的雜交瘤細胞分泌，（3) IgG抗體，由從通過總蛋白質提取物免疫的哺乳動物的脾細胞產生的雜交瘤細胞分泌，所述蛋白質提取物來自完整生物體、其一或多種組織、和/或其一或多個細胞，（4)IgG抗體，由針對一或多個抗原建立的穩定雜交瘤株分泌；或者（1)-(4)的任意組合。
[0178] 在一些實施方案中，術語"抗體文庫"是指一系列抗體的集合，其可含有不同來源的抗體，如針對特定表位產生的抗體，或者針對感興趣的蛋白質的隨機膚產生的抗體。
[0179] 本發明的抗體文庫可W是具有單一來源的抗體的抗體文庫；其也可W是不同來源的抗體的抗體文庫混合物。
[0180] 在一些實施方案中，術語"初次用于實驗的哺乳動物"是指從未使用實驗方式刺激或處理的動物。在一些實施方案中，其特別是指從未用外源抗原接種或免疫的動物，所述動物可W是小鼠、大鼠、兔等。
[0181] 在一些實施方案中，術語"總蛋白質提取物"是指源自完整生物體、其組織或其細胞的所有蛋白質的集合。所述生物體可W是多種模型生物體，如擬南芥、小鼠、鼠、兔、牛、山羊、果禍、斑馬魚、燒蟲、玉米或者水稻等。
[018引在一些實施方案中，本文所用術語"隨機膚"是指隨機產生的氨基酸序列，其中所述氨基酸選自天然氨基酸或其類似物。在本發明中，隨機膚的長度可W是例如10-20個氨基酸，例如10個氨基酸的隨機膚。
[0183] 在一個實施方案中，本發明的隨機膚；1)不含有半脫氨酸，2)不含有3個或更多個連續相同的氨基酸，和/或3)不含有5個或更多個相同氨基酸。
[0184] 在一個實施方案中，每個隨機膚的初始分值設定為任何值，通過如下過程選擇隨機膚；1)對于具有潛在糖基化位點的氨基酸，每個潛在的糖基化位點從所述分值中減去1 點，2)每個氨基酸K或R從所述分值中減去4點；基于上述分值，從上至下選擇具有最高分值的希望數目的膚。
[0185] 在一個實施方案中，本發明的隨機膚通過如下步驟選擇；1)隨機產生具有10-20 個氨基酸的膚序列，其不含有半脫氨酸，2)每個隨機膚的初始分值等于其中含有的氨基酸的數目；對于具有潛在糖基化位點的氨基酸，每個潛在的糖基化位點從所述分值中減去1 點，3)具有10-20個氨基酸的所述膚序列不允許含有3個或更多個連續的相同氨基酸，4) 具有10-20個氨基酸的所述膚序列不允許含有5個或更多個相同氨基酸，5)具有10-20個氨基酸的所述膚序列中每個氨基酸K或R從所述分值中減去4點。基于上述評分原則，從上至下選擇具有最高分值的膚。
[0186] 在一個實施方案中，從上選擇例如10000個具有最高分值的膚。在另一實施方案中，從上選擇例如 15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、 65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000 個具有最高分值的膚。在一個實施方案中，選擇的隨機膚是化學合成的。
[0187] 在一特定實施方案中，使用具有10個氨基酸的隨機膚為實例，隨機膚的選擇可例如包括如下步驟；1)隨機產生具有10個氨基酸的膚序列，其不含有半脫氨酸；2)膚序列的淘選原則：每個隨機產生的膚的初始分值設定為10 ;對于具有潛在糖基化位點的氨基酸，每個潛在的糖基化位點從所述分值中減去1點；3)具有10個氨基酸的所述膚序列不允許含有3個或更多個連續的相同氨基酸；4)具有10個氨基酸的所述膚序列不允許含有5個或更多個相同氨基酸；及5)所述膚序列中每個氨基酸K或R從所述分值中減去4點。
[0188] 基于上述評分原則，可W從上至下選擇具有最高分值的10000個膚，然后可W化學合成。
[0189] 在本發明的一個實施方案中，所述隨機膚可W通過多種方法獲得，如化學合成、重組表達等。該種技術手段為本領域熟知。
[0190] 動物的免疫可W使用本領域已知的任何方法進行。用于本發明中進行免疫的動物可W是本領域常用的動物，如小鼠、大鼠、兔、綿羊、山羊、馬、牛等。
[0191] 在一個實施方案中，所述抗體文庫包含至少10000個不同成員，所述抗體文庫當用于篩選感興趣的蛋白質的抗體時的成功率為至少85%。在另一實施方案中，本發明的抗體文庫中的成員數目通過添加新抗體而可W進一步增加，如至少15000、20000、25000、 30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、 90000、95000、100000個不同抗體及甚至更多。隨著抗體文庫中抗體量的增加，所述抗體文庫篩選感興趣的蛋白質的抗體的成功率也因此增加，如86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及甚至更高。隨著文庫內容的增加，所述成功率可接近100%。
[0192] 在一個實施方案中，本發明的抗體文庫是雜交瘤細胞文庫形式。
[019引關于雜交瘤技術的詳細介紹可見于例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies:principles andpractice,3"edition,AcademicPress, 1996；ShepherdandDeanMonoclonal Antibodies,OxfordUniversityPress, 2000 等。
[0194] 使用隨機膚產生的本發明的抗體文庫可含有抗體的不同集合，如單克隆抗體的集合，多克隆抗體的集合。在一個實施方案中，本發明的抗體文庫含有針對一個物種所有蛋白質的抗體。在另一實施方案中，本發明的抗體文庫含有針對感興趣的一或多個蛋白質的所有表位的抗體。
[0195] 在一個實施方案中，本發明的抗體文庫存在于高通量篩選裝置中。
[0196] 在一個實施方案中，本發明中使用的高通量篩選裝置是生物芯片，如蛋白質芯片，或者 1 油-〇n-a-chip(LOC)D
[0197] 在一些實施方案中，術語"高通量篩選裝置"是指可用于進行高通量篩選（HT巧的裝置。高通量篩選是指使用分子水平或細胞水平的實驗手段為基礎，進行自動操作W在微平板形式的實驗載體上進行實驗過程，使用檢測儀器收集實驗數據，然后使用計算機分析并處理實驗數據。高通量篩選裝置和技術可用于同時檢測大量不同樣品，其可W與本發明的抗體文庫組合W實現快速有效篩選抗體的目的。
[019引常用的高通量篩選裝置包括生物芯片。生物芯片是一種微陣列技術，可用于高通量篩選生物學樣品。關于生物芯片，借助于顯微處理和微電子技術，可W將具有已知序列的大量核酸或蛋白質片段有序地排列在微玻片的表面上。待檢測樣品的相應成分或活性可W 通過與標記的核酸或蛋白質分子反應而分析。生物芯片典型可W分為H種不同類型，即基因芯片、蛋白質芯片和1油-on-a-chip(LOC)。
[0199] 蛋白質芯片是分析蛋白質功能的一種高通量技術，其可用于分析蛋白質的表達譜、研究蛋白質之間的相互作用及研究DNA與蛋白質W及RNA與蛋白質之間的相互作用。
[0200]Ub-on-a-chip是使用芯片作為平臺的一種顯微分析系統，其可W在生物芯片上整合基本的操作單元如樣品的制備和/或篩選及產物的分離和/或檢測，W完成不同的生物學或化學反應過程，從而分析所述產物。使用lab-on-a-chip，本發明的抗體的篩選、檢測和/或分離可W在一個芯片上快速有效進行。關于Ub-on-a-chip的詳細描述可見于例女口Herold,KE;Rasooly,A(eds) :Lab-〇n-a-ChipTechnology:BiomolecularSeparation andAnalysi,CaisterAcademicPress(2009)及EdwinOosterbroek&A.vandenBe rg(eds. ):Lab-on-a-Chip:Miniaturizedsystemsfor(bio)chemicalanalysisand synthesis,ElsevierScience,secondedition(2003)等。
[0201] 在一個實施方案中，對本發明抗體文庫中的抗體進行親和性成熟。在一特定實施方案中，本發明的抗體文庫可用于基于相對小量文庫成員獲得具有高親和性的抗體。
[0202] 術語"親和性成熟"的含義為本領域熟知，可見于例如Dong,Zhiweiet al.=AntibodyEngineering,BeijingMedicalUniversityPublications(2002)。典型地，術語"親和性成熟"是指在用特定抗原免疫動物之后，因此產生和分離的抗體是結構重排及重構的，W便所述蛋白質對于特定抗原的親和性可W增加例如3-4個數量級。在一些實施方案中，進行親和性成熟的抗體是所有IgG亞型抗體。因此，在對抗體文庫中的抗體進行親和性成熟的情況中，從該個抗體文庫中篩選具有高親和性的抗體的可能性將大大增加。
[0203] 另一方面，本發明提供了包含本發明抗體文庫的組合。
[0204] 本發明的抗體文庫可W是組合形式，例如所述抗體文庫的抗體成員可W制備為一定濃度的抗體溶液（制備方法包括腹水及體外培養等）。制備的抗體溶液可W化ISA平板形式膽存（例如96或384孔平板），或者W芯片形式膽存。
[0205] 或者，編碼所述抗體文庫中抗體成員的基因也可W自細胞株系中克隆，然后所述基因可用于制備抗體。
[0206] 另一方面，本發明提供了生物芯片，其包含本發明的抗體文庫。
[0207]另一方面，本發明提供了篩選感興趣的蛋白質的抗體的方法，包括使用本發明的抗體文庫、本發明的組合或者本發明的生物芯片篩選針對所述感興趣的蛋白質的一或多個抗體。
[020引在一些實施方案中，術語"感興趣的蛋白質"或者"感興趣的多膚"或者"感興趣的膚"在本文可W互換使用，其均是指任何天然蛋白質或其片段，或者通過可變剪接獲得的天然蛋白質的同種型，或者天然蛋白質的突變體，或者上述蛋白質的任意組合。
[0209] 在一些實施方案中，本文所用術語"可變剪接"是指從同一mRNA前體中通過不同的剪接模式（即通過不同的剪接位點組合外顯子）產生不同的HiRNA剪接同種型的過程。通過可變剪接獲得的蛋白質產物彼此是同種型，其可W呈現出不同功能和結構性質，或者由于其在相同細胞中的不同表達水平而可W產生不同的表型。
[0210] 在一個實施方案中，本發明的方法包括；(a)將所述感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合，及化）選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體或抗體組。
[0211] 在一個實施方案中，本發明的方法包括；(a)將所述感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合，化）選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體或抗體組，（C)將所述感興趣的蛋白質與在步驟化）中選擇的抗體或抗體組的抗體亞組混合，及（d)選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體或抗體亞組。在另一實施方案中，本發明的方法進一步包括使用在步驟（d)中選擇的抗體亞組重復步驟（C)和（d)，直至選擇出能結合所述感興趣的蛋白質的抗體。
[0212] 在另一實施方案中，本發明的方法包括針對幾個感興趣的蛋白質同時篩選，包括： (a)將所述幾個感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合，化）選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組，（C)將所述幾個感興趣的蛋白質的每一個單獨與在步驟化）中選擇的能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組混合，然后分別選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的每一個的抗體或抗體組。
[0213] 在另一實施方案中，本發明的方法包括針對幾個感興趣的蛋白質同時篩選，包括： (a)將所述幾個感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合，化）選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組，（C)將所述幾個感興趣的蛋白質的每一個單獨與在步驟化）中選擇的能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組混合，然后分別選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的每一個的抗體或抗體組，（d)將所述幾個感興趣的蛋白質的每一個單獨與在步驟（C)中選擇的能結合各個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組的抗體亞組混合，及（e)分別選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的每一個的抗體或抗體亞組。在另一實施方案中，本發明的方法進一步包括使用在步驟（e)中選擇的抗體亞組重復步驟（d)和（e)，直至分別選擇出能結合所述幾個感興趣的蛋白質的每一個的抗體。
[0214] 在一些實施方案中，術語"抗體組"是指不同抗體的混合物，其可含有幾個、幾十個、幾百個或者幾千個不同的抗體。抗體組可W進一步分成含有不同抗體的幾個抗體亞組。
[0215] 在一特定實施方案中，本領域技術人員根據特定需求可W將抗體文庫分成幾個抗體組，如含有幾個、幾十個、幾百個或幾千個不同抗體的組。例如，含有10000個抗體的抗體文庫可分成100個組，每組含有100個不同的抗體。將感興趣的蛋白質單獨與每組混合，然后選擇可W結合所述感興趣的蛋白質的組。該種組可用于進一步篩選。例如，上述選擇的含有100個抗體的抗體組可W進一步分成10個亞組，每個亞組含有10個抗體。將感興趣的蛋白質單獨與每個亞組混合，然后選擇可W結合所述感興趣的蛋白質的亞組。根據該種策略，可W重復進行所述篩選，直至選擇出可W結合所述感興趣的蛋白質的抗體。
[0216]在一個實施方案中，所述抗體可直接使用或者在稀釋后使用，優選其W相同濃度使用。例如，可W將不同的抗體均稀釋為100yg/ml，可W取等體積的抗體溶液及隨后混合， W獲得含有不同抗體的組。W此方式，幾十至幾千個抗體可W制備為抗體組組合。本領域技術人員可W選擇適合所述抗體的稀釋液體，如肥陽S溶液，例如含有2mg/mlProclin300、 I%BSA、pH7. 4的肥陽S溶液。
[0217]本發明中使用的篩選方法可W是化ISA、斑點印跡或蛋白質芯片W及可證實蛋白質與抗體之間相互作用的其它檢測方法。該些方法均是本領域熟知的技術手段。
[021引在一個實施方案中，本發明的方法可用于篩選線性多膚的抗體。
[0219]術語"線性多膚"是指在蛋白質中連續的氨基酸序列。
[0220] 在一個實施方案中，本發明的方法可用于篩選可溶多膚的抗體。
[0221] 在一個實施方案中，本發明的方法可用于篩選修飾的多膚的抗體。
[0222] 術語"修飾的多膚"、"修飾的蛋白質"和"修飾的膚"在本文可互換使用，其均是指已經被修飾或翻譯后修飾的蛋白質或多膚，如已經磯酸化、甲基化或己醜化的蛋白質或多膚。
[0223]本發明的抗體文庫可用于產生分別針對修飾的多膚和未修飾的前體多膚（也稱作區別多膚，即未被翻譯后修飾的多膚形式）的不同抗體。對于所述多膚是陽性的細胞株系可用于分別檢測修飾的多膚和未修飾的多膚的效價。當該兩個效價之間的差別達到某種程度時，如大于8 [單位？]，則所述抗體被認為能區分該兩種多膚。
[0224]在一個實施方案中，本發明的方法可用于篩選毒性多膚的抗體。術語"毒性多膚" 和"毒性蛋白質"在本文可互換使用，其均是指在動物或在細胞中可產生毒性的蛋白質或多膚。由于其毒性，常規的抗體制備方法不可用于產生對所述毒性多膚具有高親和性的抗體。
[0225]在一個實施方案中，本發明的方法可W使用高通量篩選裝置進行。在一個實施方案中，本發明方法中使用的高通量篩選裝置是生物芯片，如蛋白質芯片，或者 lab-〇n-a-chip(LOC)D
[0226]另一方面，本發明還涉及本發明的抗體文庫在制備篩選針對感興趣的蛋白質的抗體的裝置或試劑盒中的應用。在一個實施方案中，所述裝置是高通量篩選裝置。在另一實施方案中，所述高通量篩選裝置是生物芯片，如蛋白質芯片，或者1油-on-a-chip化OC)。
[0227]使用本發明的抗體文庫，可W獲得針對不同類型蛋白質（線性、可溶、未修飾的、修飾的）的抗體。使用本發明的抗體文庫獲得的50%W上的抗體的親和性低于lOOnM。獲得可用細胞株系的可能性在萬分之幾至幾萬分之一之間，該較常規的展示技術高得多。對于常規的瞻菌體展示文庫，盡管文庫的含量達到1〇6水平，但是從中篩選可用抗體的成功率幾乎為0,該是由于獲得的抗體的親和性通常不能滿足應用要求。
[022引本發明的抗體文庫基于相對特異性原理，所述抗體文庫含有針對幾萬個抗原的抗體，從而可W在短時間內（如一周）獲得對于祀抗原具有高親和性的單克隆抗體。該個時間及其成本較常規單克隆技術低得多。對于正常的蛋白質抗原，由此獲得的抗體的親和性當與W常規方法獲得的抗體相比時示出無實際差別。此外，本發明的抗體文庫的含量持續增加，隨著文庫含量的增加，篩選抗體的成功率將由此迅速增加。
[0229]另外，本發明的篩選方法也可用于篩選針對抗原的抗體，所述抗原的抗體不能使用常規方法制備，如毒性抗原或者自身免疫性抗原。
[0230] 本發明實現了W低成本及高通量方式制備具有高親和性的抗體的技術方法，其可用于在短時間內制備抗體。本發明的抗體文庫W及篩選方法也可W與高通量技術如蛋白質芯片組合。
[0231] D.實施例
[0232] 本發明通過如下實施例進一步詳細描述。提供該些實施例只是說明目的，不應理解為限制本發明的范圍。具體地，本發明含有如下實施例：
[0233] 實施例1描述了含有10000個抗體的抗體文庫的構建，及證實篩選20個不同蛋白質的抗體的成功率為85% ;
[0234] 實施例2描述了含有50000個抗體的抗體文庫的構建；
[0235] 實施例3描述了篩選修飾的膚的抗體；
[0236] 實施例4描述了篩選及檢測邸K2蛋白質的抗體；
[0237] 實施例5描述了篩選及檢測可溶蛋白質Desmin的抗體；
[023引實施例6描述了篩選毒性蛋白質霍亂毒素的抗體，及獲得的抗體的親和性成熟；
[0239] 實施例7描述了篩選不溶蛋白質的抗體；及
[0240] 實施例8描述了抗體生物芯片的制備，及使用所述生物芯片篩選人血管內皮生長因子（VEG巧的抗體。
[0241] 實施例1 ;抗體文庫的構建
[0242] 該個實施例描述了舉例的抗體文庫的構建。。24引A.體巧隨化化產牛杭體
[0244] 隨機膚的產生：
[0245] i.隨機產生具有10個氨基酸的膚序列，其不含有半脫氨酸；
[0246] ii.所述膚序列的淘選原理：每個隨機產生的膚的初始分值設定為10 ;對于具有潛在糖基化位點的氨基酸，每個潛在糖基化位點從所述分值中減去1點；
[0247] iii.具有10個氨基酸的所述膚序列不含有3個或更多個連續的相同氨基酸； [024引iv.具有10個氨基酸的所述膚序列不含有5個或更多個相同氨基酸；
[0249]V.所述膚序列中每個氨基酸K或R從所述分值中減去4點；及
[0巧0] Vi.基于上述分值，從上至下選擇具有最高分值的10000個膚，然后化學合成（合成方法可見于QiemistryofP巧tideSynthesis,N.LeoBenoiton, 2005)。
[0251]膚抗原的制備、免疫方法及單克隆抗體的制備均是本領域已知的常用技術，關于該些技術的描述可見于相關出版物和教材，例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies!principles andpractice,3"edition,AcademicPress,1996；ShepherdandDeanMonoclonal antibodies,OxfordUniversityPress, 2000等。。巧引 B.體巧初次巧于連輪的小鼠的脾細胸產牛杭體
[0巧；3] 制備單克隆抗體的方法可見于例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies!principles andpractice,3"edition,AcademicPress, 1996；ShepherdandDeanMonoclonal antibodies,OxfordUniversityPress, 2000等。
[0254] 從未進行免疫的小鼠脾中取淋己細胞，然后通過細胞融合制備雜交瘤細胞；使用山羊抗小鼠IgG抗體（Abmart, 20100815)檢測可W分泌抗體的雜交瘤細胞。
[0255] 特別地，將山羊抗小鼠IgG抗體使用0.OlMNa2C〇3/NaHC〇3緩沖液（pH9. 0)稀釋為 1yg/ml，然后加入具有高吸附容量的96孔ELISA平板（SYBI0,化ngzhou，China)中，在每孔中加入IOOy1，在4°C包被過夜，用PBST洗涂3次，每次加入250y1/孔洗涂溶液。在每個孔中加入250y1封閉溶液（含有1 %BSA的PBST溶液），在37C封閉1小時，用PBST洗涂3次，每次加入250y1/孔洗涂溶液。從細胞融合平板的每個孔取20y1上清，補加80y1 封閉溶液，在37C保溫1小時，除去平板中剩余的溶液，用PBST洗涂3次，每次加入250y1/ 孔洗涂溶液。將100UlHRP-標記的山羊抗小鼠抗體（Abmart，20110228)加入每個孔中，在37C保溫1小時，用PBST洗涂5次，每次加入250y1/孔洗涂溶液。加入辣根過氧化物酶底物TMB溶液（Sigma)，在37C保溫15分鐘，在每個孔中加入50y1的2M略〇4溶液W 結束反應，在450nm讀取吸收值。。巧引C.通巧巧總帝白質據取物免疫動物產牛杭體
[0巧7] 蛋白質制備；將化La細胞用含有蛋白酶抑制劑（Roche)的RIPA緩沖液巧OmM TrispH7.4，150mM化Cl，l%Triton-X-100，l%脫氧膽酸軸，0.1%SDS裂解溶液）裂解，并通過BCA炬iocolors,Shan曲ai,Qiina)量化。
[025引膚抗原的制備、免疫方法及單克隆抗體的制備均為本領域已知的常用技術，關于該些技術的描述可見于相關出版物和教材，例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies!principles andpractice,3"edition,AcademicPress, 1996；ShepherdandDeanMonoclonal antibodies,OxfordUniversityPress, 2000等。。巧引D.構律杭體專庫
[0260] 取在上述步驟A、B和C中獲得的純化的抗體并混合，W構成抗體文庫。將抗體文庫的每100個不同抗體混合W形成抗體亞文庫，獲得共100個亞文庫。。261 ] E.體巧含有10000個杭體的構律的杭體專庫篩洗帝白質的杭體
[0262] 將長度為100-600個氨基酸的20個可溶蛋白質用作祀蛋白質，W證實含有10000 個抗體的抗體文庫在篩選具有特殊構象的蛋白質的抗體的成功率。
[0263] 所述碑!蛋白質均購自化an曲aiPrimeGeneBio-TechLTD,所述特定的蛋白質可見于下表2。
[0264] 表2 ;篩選重組蛋白質的特異性抗體
【權利要求】
1. 一種鑒別靶的抗體的方法，所述方法包括： a) 提供得自哺乳動物的抗體文庫，所述哺乳動物的免疫系統未受靶外來刺激，其中所述抗體文庫包含少于1〇7個不同種類抗體； b) 將所述靶與所述抗體文庫在適于所述靶與所述抗體文庫中的抗體結合的條件下接觸，如果這種抗體存在于所述抗體文庫中；及 c) 評估所述靶與所述抗體之間的結合以鑒別所述抗體是所述靶的抗體。
2. 權利要求1的方法，其中所述抗體文庫是通過用包含不同的、隨機氨基酸序列的多個多肽免疫哺乳動物產生的。
3. 權利要求2的方法，其中所述多肽包含大約10-20個氨基酸。
4. 權利要求2或3的方法，其中所述多肽不包含Cys，不包含3個或更多個相同的連續氨基酸，和/或不包含5個或更多個相同氨基酸。
5. 權利要求2-4任一項的方法，其中所述多肽通過如下標準選擇： a) 為所有候選多肽指定初始的相同分值； b) 對于候選多肽中每個潛在糖基化位點則從初始分值減去1點； c) 對于候選多肽中每個Lys或Arg殘基則從初始分值減去4點；及 d) 針對希望數目的多肽，選擇具有最高可能分值的候選多肽用以免疫哺乳動物。
6. 權利要求2-5任一項的方法，其中所述哺乳動物用至少10000個多肽免疫。
7. 權利要求6的方法，其中所述哺乳動物用至少10000、15000、20000、25000、30000、 35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或100000個不同的多肽免疫。
8. 權利要求2-7任一項的方法，其中所述多肽包含大約10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19或20個氨基酸。
9. 權利要求2-8任一項的方法，其中所述多肽包含天然和/或非天然氨基酸。
10. 權利要求2-9任一項的方法，其中所述多肽是通過化學合成和/或重組產生方法產生的。
11. 權利要求2的方法，其中所述多肽通過如下標準選自候選多肽： a) 每個候選多肽包含大約10個氨基酸，不包括Cys; b) 每個候選多肽不包含3個或更多個相同的連續氨基酸； c) 每個候選多肽不包含5個或更多個相同的氨基酸； d) 每個候選多肽被指定為初始分值為10 ; e) 對于候選多肽中每個潛在的糖基化位點，從初始分值中減去1點； f) 對于候選多肽中每個Lys或Arg，從初始分值中減去4點；及 g) 選擇具有最高分值的至少10000個候選多肽。
12. 權利要求1的方法，其中所述抗體文庫是由哺乳動物產生的，所述哺乳動物的免疫系統未被有意刺激。
13. 權利要求12的方法，其中所述哺乳動物選自小鼠、大鼠和兔。
14. 權利要求1的方法，其中所述抗體文庫是由哺乳動物產生的，所述哺乳動物用完整生物體、組織、細胞或者所述生物體、組織或細胞的全部蛋白質提取物免疫，所述完整生物體、組織、細胞與所述靶是免疫學不同的。
15. 權利要求14的方法，其中所述完整生物體選自擬南芥（Arabidopsisthaliana)、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、果蠅?rosophila)、斑馬魚、秀_隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans)、水稻和玉米。
16. 權利要求14的方法，其中所述組織選自血液、擬南芥芽、在不同發育階段的秀麗隱桿線蟲組織、以及小鼠腦組織。
17. 權利要求14的方法，其中所述細胞選自脾細胞、腫瘤細胞和細胞系，如人腫瘤細胞系。
18. 權利要求1的方法，其中所述抗體文庫是由哺乳動物產生的，所述哺乳動物用與所述靶免疫學不同的抗原免疫。
19. 權利要求1的方法，其中所述抗體文庫： a) 是由用包含不同的隨機氨基酸序列的多個多肽免疫的哺乳動物產生的； b) 是由免疫系統未被有意刺激的哺乳動物產生的； c) 是由用完整生物體、組織、細胞或所述生物體、組織或細胞的全部蛋白質提取物免疫的哺乳動物產生的； d) 是由用與所述靶免疫學不同的抗原免疫的哺乳動物產生的；或者 e) 上述a)-d)任意的組合。
20. 權利要求1-19任一項的方法，其中所述抗體文庫中的抗體包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。
21. 權利要求1-20任一項的方法，其中所述抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。
22. 權利要求1-21任一項的方法，其中所述抗體文庫包含至少10000、15000、20000、 25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、 85000、90000、95000 或 100000 個不同抗體。
23. 權利要求1-22任一項的方法，其中至少一些抗體被固定在固體表面上。
24. 權利要求23的方法，其中所有抗體均被固定在固體表面上。
25. 權利要求23和24任一項的方法，其中所述固體表面是生物芯片的一部分。
26. 權利要求1-25任一項的方法，其中所述靶是多肽。
27. 權利要求26的方法，其中靶多肽選自線性多肽、可溶多肽、修飾的多肽、毒性多肽及在對象中導致自身免疫性的多肽。
28. 權利要求1-27任一項的方法，其中將所述靶與抗體文庫中的抗體亞組接觸以確定所述抗體亞組是否包含特異性結合所述靶的抗體。
29. 權利要求28的方法，其中所述抗體亞組包含特異性結合所述靶的抗體，及進一步包含： a) 將所述抗體亞組進一步分為更小的抗體亞組；及 b) 與所述靶接觸以確定所述更小的抗體亞組是否包含特異性結合所述靶的抗體。
30. 權利要求29的方法，其中重復步驟a)和b)直至鑒別出特異性結合所述靶的各個抗體。
31. 權利要求1-30任一項的方法，其用于鑒別特異性結合多個靶的抗體。
32. 權利要求31的方法，其中將所述抗體文庫與多個靶接觸以鑒別特異性結合多個靶的抗體或者抗體組。
33. 權利要求32的方法，其進一步包括將多個靶的每個靶與鑒別的抗體或抗體組接觸以鑒別特異性結合所述多個靶的每個靶的抗體或抗體組。
34. 權利要求32的方法，其進一步包括： a) 將鑒別的抗體或抗體組分成較小的抗體亞組；及 b) 將所述多個靶的每個靶與所述較小抗體亞組接觸以確定所述較小抗體亞組是否包含特異性結合所述多個靶的每個靶的抗體。
35. 權利要求34的方法，其中重復步驟a)和b)直至鑒別出特異性結合所述多個靶的每個靶的各個抗體。
36. 權利要求1-35任一項的方法，其中鑒別出特異性結合所述靶的抗體的成功率是至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
37. 權利要求1-35任一項的方法，其中所述抗體文庫包含至少10000個不同抗體，鑒別出特異性結合所述靶的抗體的成功率為至少80 %、85 %、90 %、95 %或100 %。
38. 特異性結合所述靶的抗體，其中所述抗體通過權利要求1-37任一項的方法鑒別。
39. 用于鑒別靶的抗體的抗體文庫，所述抗體文庫得自免疫系統未受靶外來刺激的哺乳動物，其中所述抗體文庫包含少于1〇7個不同種類抗體。
40. 權利要求39的抗體文庫，所述抗體文庫： a) 由用包含不同的隨機氨基酸序列的多個多肽免疫的哺乳動物產生； b) 由免疫系統未被有意刺激的哺乳動物產生； c) 由用完整生物體、組織、細胞或所述生物體、組織或細胞的全部蛋白質提取物免疫的哺乳動物產生； d) 由用與所述靶免疫學不同的抗原免疫的哺乳動物產生；或者 e) a)-d)任意的組合。
41. 權利要求39和40任一項的抗體文庫，其包含至少10000、15000、20000、25000、 30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、 90000、95000或100000個不同抗體。
42. 權利要求39-41任一項的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。
43. 權利要求39-42任一項的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。
44. 多肽文庫，所述多肽文庫包含多個分離的包含不同的隨機氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含大約10-20個氨基酸，所述多肽不包含Cys，不包含3個或更多個相同的連續氨基酸，和/或不包含5個或更多個相同氨基酸。
45. 權利要求44的多肽文庫，其中所述多肽通過如下標準選擇： a) 為所有候選多肽指定初始相同的分值； b) 對于候選多肽中每個潛在的糖基化位點，從初始分值中減去1點； c) 對于候選多肽中每個Lys或Arg殘基，從初始分值中減去4點；及 d) 根據希望的多肽數目選擇具有最高可能分值的候選多肽。
46. 權利要求44和45任一項的多肽文庫，其包含至少10000個多肽。
47. 產生抗體文庫的方法，所述方法包括： a)用權利要求44-46任一項的多肽文庫免疫對象； b)從所述對象中回收抗體。
48. 權利要求47的方法，其進一步包括使用權利要求44-46任一項的多肽文庫親和性純化從所述對象中回收的抗體。
49. 抗體文庫，其是通過權利要求47和48任一項的方法產生的。
50. 權利要求49的抗體文庫，其包含至少10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000個不同抗體。
51. 權利要求49和50任一項的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。
52. 權利要求49-51任一項的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。
53. 多肽文庫，所述多肽文庫包含序列表（SEQIDNO:l-55471)中列出的至少10、100、 1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 個或者所有分離的多肽。
54. 產生抗體文庫的方法，所述方法包括： a) 用權利要求53的多肽文庫免疫對象； b) 從所述對象中回收抗體。
55. 權利要求54的方法，其進一步包括使用權利要求53的多肽文庫親和性純化自對象中回收的抗體。
56. 抗體文庫，其通過權利要求55的方法產生。
57. 權利要求56的抗體文庫，其包含至少10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000個不同抗體。
58. 權利要求56和57任一項的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。
59. 權利要求56-58任一項的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。
60. 抗體文庫，所述抗體文庫包含特異性結合序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 個或者所有多肽的抗體。
61. 權利要求60的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體包含多克隆抗體、單克隆抗體和/或產生單克隆抗體的雜交瘤。
62. 權利要求60和61任一項的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體是親和性成熟的。
63. 鑒別靶抗體的肽抗原性序列的方法，所述方法包括： a)將靶抗體與包含序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、 15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 個或者所有分離的多肽的多肽文庫在適于所述靶抗體與所述多肽文庫中的多肽結合的條件下接觸，如果這種多肽存在于所述多肽文庫中；以及 c) 評估所述靶抗體與所述多肽之間的結合以鑒別所述靶抗體的肽抗原性序列。
64. 權利要求63的方法，其中將所述靶抗體與多肽文庫中多肽亞組接觸以確定所述多肽亞組是否包含特異性結合所述靶抗體的多肽。
65. 權利要求64的方法，其中所述多肽亞組包含特異性結合所述靶抗體的多肽，及進一步包括： a) 將所述多肽亞組分成更小的多肽亞組；及 b) 將所述靶抗體與所述更小的多肽亞組接觸以確定所述更小的多肽亞組是否包含特異性結合所述靶抗體的多肽。
66. 權利要求65的方法，其中重復步驟a)和b)直至鑒別出特異性結合所述靶抗體的各個多肽。
67. 權利要求63-66任一項的方法，其用于鑒別多個祀抗體的肽抗原性序列。
68. 權利要求63-67任一項的方法，其進一步包括分離特異性結合所述靶抗體的多肽。
69. 權利要求68的方法，其進一步包括確定所述分離的多肽的氨基酸序列。
70. 權利要求63-69任一項的方法，其中所述靶抗體是生物標記。
71. 權利要求70的方法，其中所述生物標記是診斷或預后生物標記。
72. 特異性結合Akt的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列 QDGGQKAVKD中包含的表位。
73. 特異性結合ERK2的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列 HPLGSPGSAS中包含的表位。
74. 特異性結合Desmin的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列 REIRRYQKST中包含的表位。
75. 特異性結合CBL4的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列 RSRARKQAYT中包含的表位。
76. 特異性結合霍亂毒素的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列 FEEREQANTA、EYQQAQLEAE或DSSMSMADSE中包含的表位。
77. 特異性結合VEGF的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合氨基酸序列 VLDFILSMGL、AKRKAGTSPR或RNSDFSAGSP中包含的表位。
78. 權利要求1的方法，其中所述抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。
79. 權利要求1的方法，其中所述抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。
80. 權利要求39的抗體文庫，其中所述抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。
81. 權利要求39的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。
82. 權利要求47的方法，其中一個對象用所述文庫中一組大約5-20個多肽免疫，多個對象用所述文庫中多組大約5-20個多肽免疫，所述多組大約5-20個多肽涵蓋了所述文庫中所有多肽。
83. 權利要求49的抗體文庫，其中所述抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。
84. 權利要求49的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。
85. 權利要求55的抗體文庫，其中所述抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。
86. 權利要求55的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。
87. 權利要求60的抗體文庫，其中所述抗體文庫中抗體的氨基酸序列先前是未知的。
88. 權利要求60的抗體文庫，其中所述抗體文庫中的抗體包含完整（或完全）抗體分子。
89. 鑒別與病癥相關的靶的方法，所述方法包括： a) 將得自患有病癥的來源的樣品與權利要求39-43、49-52和56-62任一項的抗體文庫接觸，評估所述樣品中的物質與所述抗體文庫中的抗體之間的結合或者缺乏結合； b) 將得自未患有所述病癥的來源的樣品與權利要求39-43、49-52和56-62任一項的抗體文庫接觸，評估所述樣品中的物質與所述抗體文庫中的抗體之間的結合或者缺乏結合；及 c) 當步驟a)和b)中所述物質與所述抗體之間的所述結合或缺乏結合存在差別時，鑒別物質為與所述病癥相關的靶。
90. 權利要求89的方法，其用于鑒別與對象中病癥相關的靶。
91. 權利要求89的方法，其用于鑒別與疾病或失調相關的靶。
92. 權利要求89的方法，其用于鑒別與病癥相關的多個靶。
93. 權利要求89的方法，其中步驟a)和b)中所述物質與所述抗體之間的結合或缺乏結合的差別是定性的。
94. 權利要求89的方法，其中步驟a)和b)中所述物質與所述抗體之間的結合或缺乏結合的差別是定量的。
95. 權利要求89的方法，其中步驟a)中所述物質與所述抗體之間的結合及步驟b)中所述物質與所述抗體之間缺乏結合鑒別所述物質是與所述病癥相關的靶。
96. 權利要求89的方法，其中步驟a)中所述物質與所述抗體之間缺乏結合及步驟b) 中所述物質與所述抗體之間的結合鑒別出所述物質是與所述病癥相關的靶。
97. 權利要求89的方法，其中所述靶包含多肽。
98. 鑒別與病癥相關的靶的方法，所述方法包括： a) 將得自患有病癥的來源的樣品與權利要求44-46和53任一項的多肽文庫接觸，并評估所述樣品中的物質與所述多肽文庫中的多肽之間的結合或缺乏結合； b) 將得自不具有所述病癥的來源的樣品與權利要求44-46和53任一項的多肽文庫接觸，并評估所述樣品中的物質與所述多肽文庫中的多肽之間的結合或缺乏結合；以及 c) 當步驟a)和b)中所述物質與所述多肽之間的結合或缺乏結合存在差別時，鑒別物質是與所述病癥相關的靶。
99. 權利要求98的方法，其用于鑒別與對象中的病癥相關的靶。
100. 權利要求98的方法，其用于鑒別與疾病或失調相關的靶。
101. 權利要求98的方法，其用于鑒別與病癥相關的多個靶。
102. 權利要求98的方法，其中步驟a)和b)中所述物質與所述多肽之間的結合或缺乏結合中的差別是定性的。
103. 權利要求98的方法，其中步驟a)和b)中所述物質與所述多肽之間的結合或缺乏結合中的差別是定量的。
104. 權利要求98的方法，其中步驟a)中所述物質與所述多肽之間的結合及步驟b)中所述物質與所述多肽之間的缺乏結合鑒別出所述物質是與所述病癥相關的靶。
105. 權利要求98的方法，其中步驟a)中所述物質與所述多肽之間的缺乏結合及步驟 b)中所述物質與所述多肽之間的結合鑒別出所述物質是與所述病癥相關的靶。
106. 權利要求98的方法，其中所述靶包括抗體。
107. 抗體文庫，其包含： (1) 針對具有10-20個氨基酸的隨機肽的抗體， (2) IgG抗體，由初次用于實驗的哺乳動物的脾細胞產生的雜交瘤細胞分泌， (3) IgG抗體，由用總蛋白質提取物免疫的哺乳動物的脾細胞產生的雜交瘤細胞分泌，所述蛋白質提取物來自完整生物體、其一或多個組織、和/或其一或多個細胞， (4) IgG抗體，由針對一或多種抗原建立的穩定雜交瘤株系分泌，或者 (5) (1)-⑷的任意組合；其中所述抗體文庫包含至少10000個不同成員，所述抗體文庫當用于篩選感興趣的蛋白質的抗體時具有至少85%的成功率。
108. 權利要求107的抗體文庫，其是雜交瘤細胞文庫形式。
109. 權利要求107的抗體文庫，其中所述隨機肽： 1) 不含有半胱氨酸， 2) 不含有3個或更多個連續的相同氨基酸， 3) 不含有5個或更多個相同氨基酸。
110. 權利要求109的抗體文庫，其中每個隨機肽的初始分值設定為任何值，所述隨機肽通過如下方法選擇： 1) 對于具有潛在糖基化位點的氨基酸，每個潛在的糖基化位點從所述分值中減去1 點， 2) 每個氨基酸K或R從所述分值中減去4點；基于上述分值，從上至下選擇具有最高分值的希望數量的肽。
111. 權利要求107的抗體文庫，其中所述初次用于實驗的哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔。
112. 權利要求107的抗體文庫，其中所述完整生物體選自擬南芥、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、果蠅、斑馬魚、蟯蟲、水稻或玉米。
113. 權利要求107的抗體文庫，其中所述一或多個組織選自血液組織、擬南芥花萼、不同發育階段的蟯蟲組織、或者小鼠腦組織。
114. 權利要求107的抗體文庫，其中所述一或多個細胞選自脾細胞、腫瘤細胞或細胞系，如人腫瘤細胞系。
115. 權利要求107的抗體文庫，其中所述抗體已經進行親和性成熟。
116. 權利要求107的抗體文庫，其中所述抗體文庫包含至少15000、20000、25000、 30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、 90000、95000或100000個不同成員。
117. -種組合，其包含權利要求107-116任一項的抗體文庫。
118. -種生物芯片，其包含權利要求106-116任一項的抗體文庫。
119. 篩選感興趣的蛋白質的抗體的方法，包括使用權利要求106-116任一項的抗體文庫、權利要求117的組合、或者權利要求118的生物芯片篩選所述感興趣的蛋白質的一或多種抗體。
120. 權利要求119的方法，包含： (a) 將所述感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合， (b) 選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體或抗體組。
121. 權利要求120的方法，進一步包括： (c) 將所述感興趣的蛋白質與在步驟（b)中選擇的抗體或抗體組的抗體亞組混合， (d) 選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體或抗體亞組。
122. 權利要求121的方法，進一步包括使用在步驟（d)中選擇的抗體亞組重復步驟 (c) 和（d),直至選擇能結合所述感興趣的蛋白質的抗體。
123. 權利要求119的方法，其中所述篩選是針對幾個感興趣的蛋白質同時進行的，包括： (a) 將所述幾個感興趣的蛋白質與所述抗體文庫的抗體或抗體組混合， (b) 選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組， (c) 將所述幾個感興趣的蛋白質的每一個單獨與在步驟（b)中選擇的能結合所述幾個感興趣的蛋白質的抗體或抗體組混合，然后分別選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的每一個的抗體或抗體組。
124. 權利要求123的方法，進一步包括： (d) 將所述幾個感興趣的蛋白質的每一個單獨與在步驟（c)中選擇的能結合各自感興趣的蛋白質的抗體或抗體組的抗體亞組混合， (e) 分別選擇能結合所述幾個感興趣的蛋白質的每一個的抗體或抗體亞組。
125. 權利要求124的方法，其進一步包括使用在步驟（e)中選擇的抗體亞組重復步驟 (d) 和（e)，直至分別選擇了能結合所述感興趣的蛋白質的每一個的抗體。
126. 權利要求119-125任一項的方法，其中所述感興趣的蛋白質是翻譯后修飾的蛋白質或多肽，或者毒性蛋白質或多肽。
【文檔編號】C12P21/00GK104379821SQ201380018434
【公開日】2015年2月25日申請日期:2013年4月1日優先權日:2012年3月31日
【發明者】孟遜, 李陽, 王小清申請人:艾比瑪特生物醫藥（上海）有限公司

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