骨膜素基因的表達抑制核酸分子、骨膜素基因的表達抑制方法及其用途
【專利摘要】本發明提供抑制骨膜素基因的表達的新分子。骨膜素基因的表達抑制核酸分子的特征在于，包含由序列號1?19中的任一個堿基序列構成的核苷酸作為骨膜素基因的表達抑制序列。利用本發明的表達抑制核酸分子，能夠抑制骨膜素基因的表達，因此能夠用于例如起因于骨膜素基因的表達的眼病，具體來說能夠用于增殖性糖尿病視網膜病變或黃斑變性等的治療。
【專利說明】骨膜素基因的表達抑制核酸分子、骨膜素基因的表達抑制 方法及其用途
【技術領域】
[0001] 本發明涉及成為眼病的原因的骨膜素（PeriOStin)基因的表達抑制核酸分子、骨 膜素基因的表達抑制方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 近年來，伴隨著糖尿病患者的增加，作為并發癥之一的糖尿病視網膜病變 (Diabetic Retinopathy :DR)患者正在增加。糖尿病視網膜病變根據疾病分期而分 類為單純糖尿病視網膜病變、前增殖型糖尿病視網膜病變和增殖型糖尿病視網膜病變 (Proliferative Diabetic Retinopathy JDR)。其中，增殖型糖尿病視網膜病變不僅存在 視力降低，而且有可能會失明。
[0003] 另外，作為眼病，老年性黃斑變性（Age-related Macular Degeneration :AMD)等 黃斑變性也同樣地成為問題。黃斑變性是因年齡增長或壓力等原因而出現黃斑變性、視力 降低的疾病。該疾病在嚴重時也有可能導致失明。
[0004] 這些眼病的起因是，脈絡膜視網膜陷于缺氧狀態等，為了補充氧，在視網膜上下形 成新生血管。由于新生血管脆弱，因而容易破裂出血，所出的血液會遮蔽光程，因而視力降 低。另外，所述新生血管發展為被稱作增殖組織的纖維膜，由于該原因，還有可能產生牽引 性視網膜脫離。并且，若該狀態持續、反復而嚴重化，則有可能導致失明（專利文獻1)。因 此，關于這些眼病，要求提供能夠成為治療藥的新的候補物質。
[0005] 有文獻報道，這些眼病與骨膜素基因的表達有關（非專利文獻1)。
[0006] 現有技術文獻
[0007] 專利文獻
[0008] 專利文獻1 :日本特開2011 - 220969號公報
[0009] 非專利文獻
[0010] 非專利文獻 I :S. Yoshida et al.，Investigative Ophthalmology&Visual Science，2011，Vol. 52, No. 8
【發明內容】
[0011] 發明要解決的問題
[0012] 因此，本發明的目的在于提供可抑制骨膜素基因的表達的新分子、以及提供使用 了該分子的表達抑制方法和眼病的治療方法等用途。
[0013] 用于解決問題的方案
[0014] 為了達到上述目的，本發明的骨膜素基因的表達抑制核酸分子的特征在于，包含 下述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸作為骨膜素基因的表達抑制序列。
[0015] (asl)由序列號1?19中的任一個堿基序列構成的核苷酸；
[0016] (as2)由所述（asl)的堿基序列中缺失、置換和/或添加了一個或多個堿基的堿基 序列構成的、具有骨膜素基因的表達抑制功能的核苷酸；
[0017] (as3)由與所述（asl)的堿基序列具有90%以上的同源性的堿基序列構成的、具 有骨膜素基因的表達抑制功能的核苷酸。
[0018] 本發明的組合物的特征在于，其包含本發明的所述表達抑制核酸分子。
[0019] 本發明的眼病用藥物的特征在于，其包含本發明的所述表達抑制核酸分子。
[0020] 本發明的抑制方法的特征在于，其為骨膜素基因的表達抑制方法，其使用本發明 的所述表達抑制核酸分子。
[0021] 本發明的眼病的治療方法的特征在于，其包括將本發明的所述表達抑制核酸分子 投與患者的步驟。
[0022] 發明的效果
[0023] 利用本發明的表達抑制核酸分子，能夠進行骨膜素基因的表達抑制。因此，本發明 對于骨膜素基因的表達成為原因的眼病、例如增殖型糖尿病視網膜病變或黃斑變性等各種 眼病的治療有效。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1是示出本發明的核酸分子的一例的示意圖。
[0025] 圖2是示出本發明的核酸分子的另一例的示意圖。
[0026] 圖3是示出本發明的核酸分子的另一例的示意圖。
[0027] 圖4是示出本發明的核酸分子的另一例的示意圖。
[0028] 圖5是示出本發明的實施例1中的體外的骨膜素基因表達量的相對值的圖。
[0029] 圖6是本發明的實施例2的結果，（A)是示出小鼠的眼的纖維性增殖組織的體積 的圖，（B)是示出小鼠的眼的新生血管的體積的圖。
[0030] 圖7是示出本發明的實施例3中的體外的骨膜素基因表達量的相對值的圖。
[0031] 圖8是示出本發明的實施例4中的體外的骨膜素基因表達量的相對值的圖。
[0032] 圖9是示出本發明的實施例4中的體外的骨膜素基因表達量的相對值的圖。
[0033] 圖10是示出本發明的實施例5中的體外的骨膜素基因表達量的相對值的圖。
【具體實施方式】
[0034] 只要沒有特別提及，則本說明書中使用的用語能夠以該【技術領域】中通常所用的含 義使用。
[0035] 〈表達抑制核酸分子〉
[0036] 如前所述，本發明的表達抑制核酸分子（下文中也稱為"本發明的核酸分子"）的 特征在于，其為表達抑制用的核酸分子，包括下述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸作為骨膜 素基因的表達抑制序列。
[0037] (asl)由序列號1?19中的任一個堿基序列構成的核苷酸；
[0038] (as2)由所述（asl)的堿基序列中缺失、置換和/或添加了一個或多個堿基的堿基 序列構成的、具有骨膜素基因的表達抑制功能的核苷酸；
[0039] (as3)由與所述（asl)的堿基序列具有90%以上的同源性的堿基序列構成的、具 有骨膜素基因的表達抑制功能的核苷酸。
[0040] 下文中，將所述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸稱為as核苷酸，分別稱為asl核 苷酸、as2核苷酸、as3核苷酸。
[0041] 本發明中，對骨膜素基因的表達的抑制沒有特別限制，例如，可以為基因轉錄自身 的抑制，也可以為通過分解基因的轉錄產物而進行的抑制。另外，骨膜素基因的表達的抑制 例如可以為具有本來的功能的骨膜素蛋白質的表達的抑制，在蛋白質被表達的情況下，所 述蛋白質例如可以為所述功能被抑制的蛋白質，也可以為所述功能缺失的蛋白質。
[0042] 所述表達抑制序列例如可以為由所述as核苷酸構成的序列，也可以為包含所述 as核苷酸的序列。
[0043] 對所述表達抑制序列的長度沒有特別限制，例如，為18?32堿基長、優選為19? 30堿基長、更優選為19、20、21堿基長。本發明中，例如，堿基數的數值范圍公開了屬于該 范圍的全部正整數，例如"1?4堿基"的記載是指公開了"1、2、3、4堿基"的全部（以下相 同）。
[0044] 下面示出所述asl核苷酸的序列。需要說明的是，由所述序列號1?19的堿基序 列構成的核苷酸、由所述核苷酸構成的表達抑制序列、包含所述核苷酸的表達抑制序列、和 包含所述核苷酸的核酸分子分別還有時用以下所示的名稱（序列號前的名稱）表示。
【權利要求】
1. 一種骨膜素基因的表達抑制核酸分子，其特征在于，包含下述（asl)、（as2)或（as3) 的核苷酸作為骨膜素基因的表達抑制序列， (asl)由序列號1?19中的任一個堿基序列構成的核苷酸； (as2)由所述（asl)的堿基序列中缺失、置換和/或添加了一個或多個堿基的堿基序列 構成的、具有骨膜素基因的表達抑制功能的核苷酸； (as3)由與所述（asl)的堿基序列具有90%以上的同源性的堿基序列構成的、具有骨 膜素基因的表達抑制功能的核苷酸。
2. 根據權利要求1所述的表達抑制核酸分子，其特征在于，所述表達抑制核酸分子為 單鏈核酸分子， 從5'側至3'側依次包含5'側區域（Xe)、內部區域⑵和3'側區域（Yc)， 所述內部區域（Z)由內部5'側區域（X)和內部3'側區域（Y)連結而構成， 所述5'側區域（Xe)與所述內部5'側區域⑴互補， 所述3'側區域（Yc)與所述內部3'側區域⑴互補， 所述內部區域（Z)包含所述表達抑制序列。
3. 根據權利要求2所述的表達抑制核酸分子，其中， 在所述5'側區域（Xe)與所述內部5'側區域（X)之間具有連接子區域（Lx)， 介由所述連接子區域（Lx)連結所述5'側區域（Xe)和所述內部5'側區域（X)， 在所述3'側區域（Yc)和所述內部3'側區域（Y)之間具有連接子區域（Ly)， 介由所述連接子區域（Ly)連結所述3'側區域（Yc)和所述內部3'側區域（Y)。
4. 根據權利要求3所述的表達抑制核酸分子，其中，所述連接子區域（Lx)和所述連接 子區域（Ly)由核苷酸殘基構成。
5. 根據權利要求3或4所述的表達抑制核酸分子，其中，所述連接子區域（Lx)和所述 連接子區域（Ly)由非核苷酸殘基構成。
6. 根據權利要求5所述的表達抑制核酸分子，其中，所述非核苷酸殘基包含吡咯烷骨 架和哌啶骨架中的至少一種。
7. 根據權利要求5或6所述的表達抑制核酸分子，其中，所述連接子區域（Lx)和所述 連接子區域（Ly)由下述式（I)表示，
所述式中， X1和X2各自獨立地為H2、0、S或NH ; Y1和Y2各自獨立地為單鍵、CH2、NH、0或S ; R3為與環A上的C-3、C-4、C-5或C-6鍵合的氫原子或取代基； L1為由n個原子構成的亞烷基鏈，此處，亞烷基碳原子上的氫原子任選被OH、0Ra、NH 2、 NHRa、NRaRb、SH、或者SRa取代或不被取代，或者， L1為所述亞烷基鏈的一個以上碳原子被氧原子取代的聚醚鏈， 其中，Y1為NH、0或S的情況下，與Y1鍵合的L1的原子為碳，與OR 1鍵合的L1的原子為 碳，氧原子彼此不相鄰； L2為由m個原子構成的亞烷基鏈，此處，亞烷基碳原子上的氫原子任選被OH、0R\ NH2、 NHRe、NReRd、SH或者SRe取代或者不被取代，或者， L2為所述亞烷基鏈的一個以上碳原子被氧原子取代的聚醚鏈， 其中，Y2為NH、0或S的情況下，與Y2鍵合的L2的原子為碳，與OR 2鍵合的L2的原子為 碳，氧原子彼此不相鄰； Ra、Rb、Re和Rd各自獨立地為取代基或保護基； 1為1或2 ; m為0?30的范圍的整數； n為0?30的范圍的整數； 環A中，所述環A上的C-2以外的1個碳原子任選被氮、氧或硫取代， 所述環A內任選包含碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵， 所述區域（Xe)和所述區域（X)分別介由-OR1-或-OR2-與所述連接子區域（Lx)結合， 此處，R1和R2任選存在或不存在，在存在的情況下，R1和R2各自獨立地為核苷酸殘基 或所述結構（I)。
8. 根據權利要求2?7的任一項所述的表達抑制核酸分子，其中，所述內部區域（Z)的 堿基數（Z)、所述內部5'側區域⑴的堿基數（X)、所述內部3'側區域⑴的堿基數（Y)、 所述5'側區域（Xe)的堿基數（Xe)和所述3'側區域（Yc)的堿基數（Yc)滿足下述式（1) 和⑵的條件， Z = X+Y ? ? ? (1) Z 彡 Xc+Yc ? ? ? (2)。
9. 根據權利要求8所述的表達抑制核酸分子，其中，所述內部5'側區域⑴的堿基數 (X)與所述5'側區域（Xe)的堿基數（Xe)之差、所述內部3'側區域⑴的堿基數⑴與所 述3'側區域（Yc)的堿基數（Yc)之差滿足下述條件， (a) 滿足下述式（11)和（12)的條件， X-Xc = 1、2 或 3 ? ? ? (11) Y-Yc = 0 ? ? ? (12) (b) 滿足下述式（13)和（14)的條件， X-Xc = 0 ? ? ? (13) Y-Yc = 1、2 或 3 ? ? ? (14) (c) 滿足下述式（15)和（16)的條件， X-Xc = 1、2 或 3 ? ? ? (15) Y-Yc = 1、2 或 3 ? ? ? (16) (d) 滿足下述式（17)和（18)的條件， X-Xc = 0 ? ? ? (17) Y-Yc = 0 ? ? ? (18)。
10. 根據權利要求1?9的任一項所述的表達抑制核酸分子，其中，所述表達抑制序列 的長度為18?32堿基長。
11. 根據權利要求1?9的任一項所述的表達抑制核酸分子，其中，所述表達抑制核酸 分子的序列為選自由序列號83?97組成的組中的至少一個堿基序列。
12. 根據權利要求1所述的表達抑制核酸分子，其中， 所述表達抑制序列進一步具有突出序列， 在所述核苷酸的3'端附加有所述突出序列。
13. 根據權利要求1或12所述的表達抑制核酸分子，其中，所述表達抑制序列為包含所 述（asl)的核苷酸的、序列號20?38中的任一個堿基序列構成的核苷酸，其中，n為正整 數。
14. 根據權利要求1、12和13的任一項所述的表達抑制核酸分子，其中，所述表達抑制 序列的長度為18?32堿基長。
15. 根據權利要求1和12?14的任一項所述的表達抑制核酸分子， 其進一步具有與所述表達抑制序列退火的互補序列， 所述互補序列包含與所述表達抑制序列中的所述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸互補 的核苷酸。
16. 根據權利要求15所述的表達抑制核酸分子，其中，所述互補序列中的所述核苷酸 為下述（si)、（s2)或（s3)的核苷酸， (si)由與所述（asl)的堿基序列互補的堿基序列構成的核苷酸； (s2)由與所述（as2)的堿基序列互補的堿基序列構成的核苷酸； (S3)由與所述（as3)的堿基序列互補的堿基序列構成的核苷酸。
17. 根據權利要求16所述的表達抑制核酸分子，其中，所述（si)的核苷酸為由序列號 39?57中的任一個堿基序列構成的核苷酸。
18. 根據權利要求15?17的任一項所述的表達抑制核酸分子，其中， 所述互補序列進一步具有突出序列， 在所述核苷酸的5'端附加有所述突出序列。
19. 根據權利要求15?18的任一項所述的表達抑制核酸分子，其中，所述互補序列為 包含所述（si)的核苷酸的、序列號58?76中的任一個堿基序列構成的核苷酸，其中，n為 正整數。
20. 根據權利要求12?19的任一項所述的表達抑制核酸分子，其中，所述突出序列為 1?3堿基長。
21. 根據權利要求12?20的任一項所述的表達抑制核酸分子，其中，所述表達抑制核 酸分子為由兩條單鏈構成的雙鏈核酸分子，其反義鏈具有所述表達抑制序列，其有義鏈具 有所述互補序列。
22. -種組合物，其特征在于，其包含權利要求1?21的任一項所述的表達抑制核酸分 子。
23. -種眼病用藥物，其特征在于，其包含權利要求1?21的任一項所述的表達抑制核 酸分子。
24. 根據權利要求23所述的眼病用藥物，其中，所述眼病為選自由視網膜病變、黃斑變 性、翼狀胬肉、結膜炎、眼內新生血管和眼的纖維瘢痕組成的組中的至少1種疾病。
25. 根據權利要求24所述的眼病用藥物，其中，所述視網膜病變為增殖型糖尿病視網 膜病變或增殖性玻璃體視網膜病變。
26. -種抑制方法，其特征在于，其為抑制骨膜素基因的表達的方法，使用權利要求 1?21的任一項所述的表達抑制核酸分子。
27. 根據權利要求26所述的抑制方法，其中，所述方法包括將所述表達抑制核酸分子 投與細胞、組織或器官的步驟。
28. 根據權利要求26或27所述的抑制方法，其中，在體內或體外投與所述表達抑制核 酸分子。
29. -種眼病的治療方法，其特征在于，所述方法包括將權利要求1?21的任一項所述 的表達抑制核酸分子投與患者的步驟。
30. 根據權利要求29所述的治療方法，其中，所述眼病為選自由視網膜病變、黃斑變 性、翼狀胬肉、結膜炎、眼內新生血管和眼的纖維瘢痕組成的組的至少1種疾病。
31. 根據權利要求30所述的治療方法，其中，所述視網膜病變為增殖型糖尿病視網膜 病變或增殖性玻璃體視網膜病變。
32. 根據權利要求1?21的任一項所述的表達抑制核酸分子，其用于眼病的治療。
33. 根據權利要求32所述的表達抑制核酸分子，其中，所述眼病為選自由視網膜病變、 黃斑變性、翼狀胬肉、結膜炎、眼內新生血管和眼的纖維瘢痕組成的組的至少1種疾病。
34. 根據權利要求33所述的表達抑制核酸分子，其中，所述視網膜病變為增殖型糖尿 病視網膜病變或增殖性玻璃體視網膜病變。
【文檔編號】C12N15/113GK104220598SQ201380018264
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年3月29日 優先權日:2012年3月29日
【發明者】吉田茂生, 濱崎智洋, 石川桂二郎, 水谷隆之, 石橋達朗, 大木忠明, 中間崇仁 申請人:國立大學法人九州大學, Aqua療法股份有限公司