高速基因放大偵測裝置制造方法

高速基因放大偵測裝置制造方法
【專利摘要】本發明提供一種高速基因放大裝置，包括：可實現更穩定的溫度控制的附加機構；包含導入可進行RNA偵測的PCR反應前的反轉錄反應程序的預處理機構；熔解曲線分析功能；及對液滴保持及光學測量最佳的芯片技術與PCR反應的光學式測量功能。
【專利說明】高速基因放大偵測裝置

【技術領域】
[0001]本發明是關于一種高速基因放大裝置，其系使用了在基礎生命科學、醫學基礎研究、以及醫療現場，適于迅速進行微量基因分析的研究或臨床試驗的反應容器；且有關一種基因分析，其系操作用以從例如以人類為首的動物或植物的基因體DNA、信使RNA等核堿基序列，高速偵測特定堿基序列的反應裝置。

【背景技術】
[0002]聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain react1n,以下簡稱為PCR。)系從各種種類的核酸混合物，放大特定堿基序列的方法。通過至少重復一次如下步驟，可使特定核酸序列放大:于混合物中，加入從基因體DNA或信使RNA經反轉錄的互補性DNA等的DNA模板、兩種以上的引物與熱安定性酶、鎂等的鹽類、及4種脫氧核糖核苷酸三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，使核酸分離的步驟；使所述引物結合的步驟；及將引物已通過熱安定性酶而結合的核酸作為鑄模，使其雜交的步驟。通過令用于DNA放大反應的反應容器升溫、降溫，以進行熱循環。可舉出各種溫度變化用機構，包括如下:以使用加熱器或帕耳帖(Peltier)組件、溫風的熱交換,使包含樣本的反應容器的溫度變化的機構；通過令反應容器交替接觸溫度不同的加熱器組塊或液體總線，以使溫度變化的機構；及于具有不同溫度區的流路中，流入樣本而改變溫度的方法。作為現有的市售裝置中速度最快的裝置，例如Roche公司的偵測系統實時熒光定量儀(Light Cycler)所具有的機構，系于復數個玻璃毛細管的各者，導入試料、DNA聚合酶、作為引物的DNA斷片及測量用熒光標記色素，通過吹以例如55°C與95°C兩種溫度等，溫度與欲令其變化的液滴溫度相同的溫風，使該毛細管內的微量液滴的溫度變化，同時對該玻璃毛細管照射熒光色度的激發光，測量所獲得的熒光強度。通過該等方法，可重復使樣本的溫度變化。
[0003]又，已報告一種流體沖突熱循環器裝置，其通過使流體噴射往試料含有區的外壁沖突，來控制試料溫度(日本特表2001-519224(專利文獻I))。因此，本
【發明者】等人為了進行比以往更高速的PCR，開發了照射對水異常具有吸收的波長的紅外線，高速轉換微小水滴的溫度的技術，以及利用循環水，通過與循環水的熱交換，可超高速進行溫度循環的超高速PCR裝置(日本特開2008-278791、日本特開2009-118798、W02010/113990、W02011/105507(專利文獻 2 ?5))。
[0004]先行技術文獻
[0005]專利文獻
[0006]專利文獻1:日本特表2001-519224
[0007]專利文獻2:日本特開2008-278791
[0008]專利文獻3:日本特開2009-118798
[0009]專利文獻4:W02010/113990
[0010]專利文獻5:TO2011/105507


【發明內容】

[0011]發明所欲解決的問題
[0012]如上述，若采用現有技術，在伴隨有急遽的溫度變化而重復復數種溫度之間的循環時，難以達成如下事項:1)嚴密的溫度控制；2)安定的溫度維持 '及3)往目標溫度移動時，不發生過沖。例如采用加熱器或帕耳帖組件時，溫度變化速度若甚緩慢，每秒為數。C程度，或由于發熱與熱傳導的關系，在達到目標溫度的過程中，為了高速成為目標溫度，若無過沖則難以使溫度變化。又，基本上若利用固體中的熱傳導，則于熱源與表面之間形成熱梯度，不能進行嚴密的控制。又，在樣本觸及加熱器或帕耳帖組件的瞬間，熱量流失，至表面溫度回復到預定溫度為止發生了延遲。又，使反應槽接觸不同的加熱器或液體總線時，移動用機構甚為復雜，難以控制加熱器或液體總線的溫度。進而言之，于具有不同溫度區的流路中，流入樣本的方法，具有流路本身的表面溫度會隨著樣本的移動而變化，難以控制溫度的問題。又，吹以溫風來進行溫度變化時，由于空器的熱容量少，須吹以大量空氣，而且同樣由于空氣的熱容量少，因此不易采用電熱線等，以1°C為單位，嚴密控制所吹空氣的最終吹出溫度。
[0013]本
【發明者】們截至目前自行開發了一種反應控制裝置，其系為了連續供給一定的熱量，利用恒定的紅外光照射或高速回流的溫水，可對目標物始終供給能量，可進行正確的溫度控制、溫度測定及迅速的升溫、降溫。進而通過于該裝置組合熒光偵測系統，開發了一種高速PCR偵測裝置，其系使用隨著PCR反應所造成的DNA放大，熒光強度會增加的熒光色素，安裝有實時偵測該放大反應的熒光偵測方法(專利文獻2?5)。
[0014]于本發明，本發明的發明人進一步改善以往的發明，目的在于提供一種可進行更正確的溫度控制、溫度測定與迅速的升溫、降溫的基因反應控制裝置。
[0015]解決問題的技術手段
[0016]有鑒于上述問題，本發明提供一種包括可實現更穩定的溫度控制的附加機構的高速反應控制裝置(例如:高速PCR裝置)，及使用該裝置的基因分析或基因放大方法。
[0017]亦即，本發明提供以下裝置及方法。
[0018][I] —種基因分析或基因放大用裝置，包括:反應槽(react1n vessel),包括用以裝入含核酸的樣本液的I個或復數個孔(well)；
[0019]熱沉(heat sink)或熱交換槽(heat exchange chamber)；
[0020]該熱沉或該熱交換槽的溫度控制裝置(temperature controller),用于上述熱沉或熱交換槽保持在第I溫度；
[0021]熱電組件(thermoelectric element),配置于上述熱沉或上述熱交換槽與上述反應槽之間，中介上述熱沉或熱交換槽與上述反應槽的間的熱移動；及
[0022]熱電組件控制裝置(thermoelectric element controller),通過控制上述熱電組件的動作(operat1n)，令上述反應槽的溫度，在上述第I溫度與第2溫度之間變化；
[0023]使得在上述熱電組件的動作為關閉(OFF)時，上述反應槽的溫度成為上述第I溫度。
[0024][2]如上述[I]的裝置,其中上述第I溫度為核酸的延長反應溫度；
[0025]上述第2溫度為(i)核酸的變性溫度，或為(ii)核酸的變性溫度或核酸的退火溫度。
[0026][3]如上述[I]或[2]的裝置，其中上述溫度控制裝置包括:
[0027]⑴溫度傳感器；
[0028](ii)熱電線，用以加溫上述熱沉；及
[0029](iii)回授控制機構，根據來自上述溫度傳感器的上述熱沉的溫度信息，控制對上述熱電線的電力供給。
[0030][4]如上述[I]或[2]的裝置，其中上述溫度控制裝置系通過令上述預定溫度液體，回流于保持有利用管狀流路而流體連接于上述熱交換槽的預定溫度液體的液體儲存槽與上述熱交換槽之間，來控制上述熱交換槽的溫度。
[0031][5]如上述[I]?[4]中任一項的裝置，其中上述熱電組件控制裝置包括:
[0032]溫度傳感器；及
[0033]計算機，根據來自上述溫度傳感器的上述反應槽的溫度信息，來控制上述熱電組件的動作。
[0034][6]如上述[I]?[5]中任一項的裝置，其中上述熱電組件為帕耳帖(Peltier)組件。
[0035][7]如上述[I]?[6]中任一項的裝置，其中為了提高上述熱電組件與上述反應槽的間的熱移動效率，進一步包括配置于上述熱電組件與上述反應槽之間的熱傳導用薄板。
[0036][8]如上述[I]?[7]中任一項的裝置，其中上述反應槽的底面及壁面系由厚度I微米至100微米，從鋁、鎳、鎂、鈦、鉬、金、銀及銅所組成的群組中選擇的金屬或硅所形成。
[0037][9]如上述[I]?[8]中任一項的裝置，其中上述樣本液的量系每一孔為數十μ L以下。
[0038][10]如上述[I]?[9]中任一項的裝置,其中使上述樣本液中含有熒光色素時,進一步備有熒光偵測裝置，用以與上述反應槽的溫度切換連動而偵測上述孔內的上述熒光色素所發出的熒光，測定熒光強度的時間變化。
[0039][11]如上述[I]?[10]中任一項的裝置,其中進一步包括反應槽套體,用以防止配置于上述孔的樣本液滴蒸發而密閉覆蓋，且用以防止冷凝。
[0040][12]如上述[11]的裝置，其中上述反應槽套體進一步包括孔洞或光學窗，容易測定來自該反應槽套體內的上述樣本的光學訊號；該光學窗包括光學上透明的發熱體。
[0041][13]如上述[I]?[9]中任一項的裝置，其中于上述反應槽的上述各孔的樣本配置場所，配置有支柱(柱體(Pillar))，樣本液蒸發防止用的密封劑以被該柱體支撐的方式覆蓋于該孔，通過該柱體，防止測定中的上述樣本液附著于上述蒸發防止用的密封劑。
[0042][14] 一種使用如上述[I]?[13]中任一項的裝置進行PCR的方法，包含如下步驟:
[0043](a)將含核酸的樣本液配置于孔的步驟；
[0044](b)將反應槽的溫度，從作為第I溫度的核酸的延長反應溫度，切換為作為第2溫度的(i)核酸的變性溫度或(ii)核酸的變性溫度或核酸的退火溫度的步驟；
[0045](C)接著將上述反應槽的溫度，從上述第2溫度切換為上述第I溫度的步驟；以及
[0046](d)以預定的時間間隔，將步驟(b)及步驟(C)重復預定次數的步驟；
[0047]上述反應槽的溫度從上述第2溫度對上述第I溫度的切換，系通過關閉上述熱電組件的動作來進行。
[0048][15]如上述[14]的方法，其中于上述步驟(d)，將步驟(b) (ii)及步驟(C)重復預定次數時，以預定的時間間隔，重復交替進行如下動作:
[0049]將上述反應槽的溫度，從作為上述第I溫度的核酸的延長反應溫度，切換為上述(b) (ii)作為第2溫度的核酸的變性溫度，以及接著將上述反應槽的溫度，從該核酸的變性溫度切換為上述第I溫度；
[0050]將上述反應槽的溫度，從作為上述第I溫度的核酸的延長反應溫度，切換為上述
(b)(ii)作為第2溫度的核酸的退火溫度，以及接著將上述反應槽的溫度，從該核酸的退火溫度切換為上述第I溫度。
[0051]與上述「可實現更穩定的溫度控制的附加機構」相關連，本發明的反應溫度控制裝置所具有的機構，系于短時間內，實現例如一般的PCR反應中所用的3種溫度，亦即變性溫度(以下稱為高溫)、退火溫度(以下稱為低溫)、以及延長反應溫度(以下稱為中溫)，尤其高速且穩定提供因應所欲使其反應的DNA鏈長度，而需要加長反應時間等調整的延長反應溫度。亦即，例如于本發明的一個實施例，提供一種高速基因放大裝置，其具有如下機構:(1)熱容量大的熱沉，控制為穩定于中溫；(2)供給熱以將該熱沉溫度維持在一定的電熱線，或者以一定溫度進行中溫液體的高速循環的機構；(3)DNA反應芯片，配置有進行DNA延長反應的試料；(4)容器，收放DNA反應芯片，具有針對將芯片上面溫度維持在75V以上的熒光觀察區的波長，在光學上呈透明的觀察窗；(5)帕耳帖組件等熱移動機構，配置于上述DNA反應芯片與熱沉之間，可主動使熱移動；及(6)偵測DNA反應芯片上的液體的熒光強度變化的機構。熱沉使用熱容量大的材料及電熱線等發熱源時，熱沉材料宜使用熱容量大且熱傳導性高的金屬(例如鋁、杜拉鋁、金、銀、鎢、尼泊爾黃銅、鎂、鑰、鈹，及使用該等元素的合金)。又，可與熱沉同等使用的物，亦可使用利用了設定為中溫的高速循環液體的熱交換槽。該情況下，不僅可使用只包括I個儲存槽的高速液體回流型反應控制裝置，亦可于本身包括可支持2溫度或3溫度PCR的2或3個儲存槽的高速液體回流型反應控制裝置，只使用設定為中溫的I個儲存槽。又，關于承載試料的DNA反應芯片，可直接利用發明人在以前申請的高速液體回流型PCR裝置(W02010/113990)的反應容器構成。
[0052]發明的效果
[0053]使用中溫熱沉或熱交換槽來控制反應槽溫度的本發明的優點可舉出如下:1)針對中溫可實現嚴密的溫度控制、2)針對中溫可實現安定的溫度控制、3)往中溫移動時不會過沖。關于可解決溫度過沖問題，由于具有大的熱容量的熱沉或熱交換槽的溫度大致一定，因此反應槽表面的溫度與熱沉或熱交換槽的溫度大致可于瞬間平衡。于本發明，與熱沉或熱交換槽相比較，反應槽及樣本的熱容量微乎其微，又，就熱電組件(帕耳帖組件)的動作來看，熱沉或熱交換槽的溫度穩定，又，由于該穩定點的溫度(中溫)位于高溫與低溫的中間，因此相對于以往從室溫開始動作的帕耳帖組件控制型基因放大裝置，移動至高溫或低溫時的熱移動量最小，又，只要熱沉或熱交換槽的溫度穩定，即容易估計往高溫或低溫的溫度變化動作所需的電流量。又，即便因帕耳體組件的動作，從熱沉或熱交換槽局部地逸失熱，由于熱沉或熱交換槽的熱容量充分大，因此基本上仍不會發生熱梯度。當然，帕耳帖組件等熱電組件關閉(OFF)時，反應槽溫度不會超過熱沉或熱交換槽的溫度。依據本發明的實施例，可于0.5秒內使溫度變化30°C以上。因此，若依據本發明，可極為縮短溫度變化所需的時間，例如可比現有的裝置，顯著縮短用以完成PCR反應的總時間。
[0054]本發明可提供如下優點:無須如現有的液體回流型反應控制裝置，為了進行2溫度或3溫度PCR而需要閥等切換稼動部，用以使來自不同的2溫度或3溫度的各液體儲存槽的液體，交替循環至熱交換槽。或者，使用包括可支持2溫度或3溫度的復數個儲存槽的液體回流型反應控制裝置，來實施本發明時，可提供如下優點:可容易實現使用閥等切換機構，于不同的復數種溫度設定中溫。
[0055]附圖簡單說明
[0056]圖1系表示高速液體回流型的反應控制裝置(例如:PCR裝置)的全體構成的模式圖。
[0057]圖2系高速液體回流型的反應控制裝置所使用的熱交換槽的概略圖。
[0058]圖3系表示本發明的裝置所使用的反應槽形態及冷凍干燥試藥的溶解方法的模式圖。
[0059]圖4系表示本發明的裝置所使用的圓柱型反應套體及其對熱交換槽的安裝方法的模式圖。
[0060]圖5系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的閥的切換順序的模式圖。
[0061]圖6系表示使用高速液體回流型的反應控制裝置進行關于(A)溫度變化的數據、及(B)PCR反應的結果的圖。
[0062]圖7系表示本發明的裝置所使用的載玻片型反應套體及其對熱交換槽的安裝方法的模式圖。
[0063]圖8系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的滑動型活塞閥的驅動機構的模式圖。
[0064]圖9系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的滑動型活塞閥的驅動機構的模式圖。
[0065]圖10系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的旋轉式閥的驅動機構的模式圖。
[0066]圖11系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的隔膜的溫度變化機構的模式圖。
[0067]圖12系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的溫度設定型閥的驅動機構的模式圖。
[0068]圖13系利用高速液體回流型的反應控制裝置的構成一例，來表示DNA反應芯片的配置、上面的溫度控制、以及熒光偵測方法的一個實施例的模式圖。
[0069]圖14系利用高速液體回流型的反應控制裝置的反應槽構成的一個實施例，來表示DNA反應芯片的配置、上面的溫度控制、以及熒光偵測方法的一個實施例的模式圖。
[0070]圖15系利用高速液體回流型的反應槽中的反應槽芯片的搬運系統以及進行反轉錄反應的裝置構成的一個實施例，來表示DNA反應芯片的配置、上面的溫度控制、以及熒光偵測方法的一個實施例的模式圖。
[0071]圖16系表不本發明的反應槽的試料的突光偵測方法的構成的一個實施例的模式圖。
[0072]圖17系表不本發明的反應槽的試料的突光偵測方法的構成的一個實施例的模式圖。
[0073]圖18系表示本發明的反應槽的構造的一個實施例的模式圖。
[0074]圖19系表示本發明的反應槽的構造的一個實施例及偵測方法的一個實施例的模式圖。
[0075]圖20系表示本發明的反應槽的構造的一個實施例的模式圖。
[0076]圖21系表示高速液體回流型的反應控制裝置的構成的一個實施例的模式圖。
[0077]圖22系表示光加熱型的反應控制裝置的構成的一個實施例的模式圖。
[0078]圖23系表示光加熱型的反應控制裝置的構成的一個實施例的ND濾光片的穿透率的角度相依性的模式圖。
[0079]圖24系表示本發明的構成的一個實施例的模式圖。
[0080]圖25系模式性表示本發明的DNA試料的溫度變化與帕耳帖組件的動作的圖。
[0081]詳細說明
[0082]用以實施發明的實施例
[0083]以下一面參考附圖，一面說明有關本發明的實施例，該等實施例為例示，本發明的范圍不得受到該等實施例所限定。
[0084]圖1系表示高速液體回流型的反應控制裝置的一個實施例的全體構成的模式圖。該反應控制裝置典型上包括:反應槽(react1n vessel) 1、反應槽套體2、熱交換槽(heatexchange vessel) 3、液體儲存槽(liquid reservoir tank) 4、熱源 5、攪拌裝置 6、泵 7、切換閥8、旁通流路9、及輔助溫度控制機構10。較宜進一步包括:熒光偵測器201、及用以送出控制訊號203的控制分析部202、及光學窗(或孔洞)204。
[0085]于較佳實施例，液體儲存槽4系通過微量液體可移動于槽間的細連結管15所連接，以使得不會在液體高速循環中，各槽中液體的高度產生差異，水位高度差異導致壓力差產生。又，為了以短時間實現熱交換，如圖1所示，從各儲存槽4始終通過泵7來使液體循環，不誘導至熱交換槽3時，仍通過切換閥8，將液體誘導至旁通流路9，亦使其始終循環。又，循環液體系配管如下:在回到儲存槽4前，通過輔助溫度控制機構10進行微調而回流，使其成為與儲存槽4的液體溫度相同的溫度。在此，輔助溫度控制機構10被裝入有加溫機構及冷卻機構，通過帕耳帖(Peltier)組件等實現加溫與冷卻雙方，或使用阻抗加熱機構的加溫系統與空氣散熱片型的冷卻機構均可。又，液溫傳感器16配置于各儲存槽4及各輔助溫度控制機構10，依據來自該等傳感器的溫度信息，可控制熱源5及輔助溫度控制機構10，以使液溫成為各所需溫度。在此，液溫傳感器宜使用由直接接觸液體也不會腐蝕的材料所形成的熱阻器、或經防蝕被覆的熱電偶等。
[0086]又，于較佳實施例，于各儲存槽，在來自熱源的熱供給產生水蒸汽等氣體，從而發生儲存槽內的壓力上升時，為了防止槽損壞，且為了防止起因于氣體壓力差，經由連結管而產生液面高度，配置了有效將產生的氣體排出至槽外的壓力泄閥2003。
[0087]反應槽I典型上系由具有復數個凹坑(孔(well))的鋁、鎳、或者金的薄板等所構成。為了提高熱傳導性，凹坑區的薄板厚度宜比周圍更薄地構成，典型上為10至30微米程度的厚度，但不限定于此。為了整體上確保強度，相鄰凹坑間的區域宜加厚，典型上厚度在100微米至500微米的范圍，但不限于此。反應槽I典型上固定于四角、圓形等形狀的反應槽套體2的底面而一體地形成。反應槽I及反應槽套體2典型上對于熱交換槽3可拆裝地構成(參考圖4)。
[0088]導入于熱交換槽3的液體的溫度，系由配置于液體儲存槽4內部的熱源5控制。為了從熱源5表面迅速取得熱，使液體儲存槽4內部的溫度均勻，宜包括攪拌機構6。液體儲存槽4中的液體系由泵7導引至流路內部。通過切換閥8，液體被導引至熱交換槽3，或被導引至旁通流路9，不經過熱交換槽3而直接回到液體儲存槽4。根據需要，通過輔助溫度控制機構10縝密地控制，將循環中變化的液體溫度，修正為與儲存槽4內的設定溫度相同的溫度之后排出，抑制液體儲存槽4內部的溫度變動。
[0089]導入于熱交換槽3的液體亦可使用水，但不限定于此，只要是熱容量大，且黏性低的液體(例如:液體氨)，可使用任意的物。其中，從安全性的觀點來看，宜使用非毒性、非可燃性的液體。又，例如通過使用沸點高于水的液體，以確實使樣本液成為100 °c，或者通過使用凝固點低于水的液體，可一面防止循環于裝置內的液體凝固，一面亦可確實進行到水凝固點為止的溫度變化。
[0090]較宜如圖1所示，于反應槽套體2配置熒光色素的激發光以及熒光會穿透的光學窗204，以便可針對I個或復數個反應槽的各者，測量由于反應槽I內的樣本液的反應而變化的樣本液中的熒光色素的熒光強度變化。又，通過配置熒光偵測器201，可測量已測量到的各反應槽I的熒光強度的時間變化。于圖1的實施例，于復數個熒光偵測器201各個的內部，具備激發光照射機構及熒光偵測機構，例如可采用進行PCR反應時，可獨立測量滴下不同引物、或不同樣本液的復數個反應槽I各個不同的PCR放大信息的構成。又，由熒光偵測器201取得的熒光強度數據系由控制分析部202記錄，具有估計通過PCR反應所得的樣本液內的DNA量、或者mRNA量的功能。進而言之,于控制分析部202,具有通過取得切換閥8的切換信息，從熒光強度的時間變化，來估計閥切換后的樣本液的溫度變化是否達到目標溫度的功能，以及亦具有根據該結果控制閥切換的功能。此系利用熒光色素普遍所具有基于水分子運動的熒光消光是取決于液溫，從熒光強度就單位時間來看的變化量小或者為零而估計，尤其在確認使DNA改質的高溫狀態達成時甚為有效。
[0091]又，于圖1所示的實施例，表示了于各反應槽I配置I個偵測器的構成，但搭配組合熒光激發用光源及冷卻CCD攝像機等可量化偵測熒光的攝像機，以測量復數個反應槽I的熒光強度變化亦可。或者，于使用數目少于反應槽I的偵測器時，通過將可高速移動于X-Y面的機械式驅動機構，與偵測器搭配組合，來測量所有反應槽I的熒光強度亦可。
[0092]又，樣本液容量系每一孔可使用0.1 μ L?10yL的范圍，但不限于此。較佳的樣本液容量系每一孔為0.1?數十(例如90、80、70、60、50、40、30、20、10) μ L，但根據需要，進一步以低容量，例如每一孔使用0.5yL?10 μ L、每一孔使用I μ L?5 μ L、每一孔使用I μ L?2 μ L等亦適宜。于孔中除了樣本液以外，亦可含有用以防止樣本液蒸發的礦物油等。礦物油容量宜為數μ L(例如:3?4μ?程度，但不限定于此，對本領域技術人員而言，當然可依孔大小或樣本量適當變更。
[0093]圖2系高速液體回流型的反應控制裝置所使用的熱交換槽3的概略圖。作為基本構成，熱交換槽3包括:導入不同溫度的液體的進口 A(Il)、進口 Β(12)。又，熱交換槽3包括用以使熱交換槽3的液體，回到液體儲存槽4的復數個出口、出口 Α(13)及出口 B(14)。分別而言，圖2Α系模式性表示從進口 A(ll)，導入來自液體儲存槽4的某溫度的液體，并從出口 Α(13)排出的狀況；圖2Β系模式性表示從進口 B (12)，導入來自液體儲存槽4的某溫度的液體，并從出口 B(14)排出的狀況。進口的數目不限定于2，可準備與欲使樣本液溫度變化的復數種溫度一致的數目，且為2溫度份量以上的復數個進口。例如欲達成3溫度系統時，進口的數目為3個。出口的數目亦與進口的情況相同，不限定于2。再者，圖2中的箭頭系大致表示于熱交換槽3導入或從熱交換槽3排出的液體流動方向。
[0094]循環于熱交換槽3與液體儲存槽4之間的液體總容積，系考慮用于循環的液體的流速、液體的熱容量或溫度的穩定性等，例如為了實現反應槽3的溫度變化的高速性與溫度穩定性，將流速設在每秒1mL以上時，一般為數十mL以上的總容量，宜為10mL以上，更宜為200mL以上，進而最宜為300mL以上。容積上限可考慮裝置的可搬性等來適當設定。
[0095]熱交換槽3的容量宜為每孔的樣本量的約10倍以上，更宜約為100倍以上，若約為1000倍以上最適宜。典型上，熱交換槽的容量系對于I孔約為0.0lmL?10mL，更宜約為0.05mL ?數 mL (例如 9、8、7、6、5、4、3、2、ImL)，最宜約為 0.1mL ?2mL。
[0096]圖3系表示本發明的裝置所使用的反應槽形態及冷凍干燥試藥的溶解方法的模式圖。可使用各種形狀的反應槽或孔，圖3A為一個實施例，分別表示了與熱交換槽3的液體相接的面如下:平坦的反應槽A (21);半球狀的反應槽B (22);三角錐狀的反應槽C (23)；球狀的反應槽D (24);及于球狀凹坑中具有圓錐狀構筑物，可保持液滴的安定位置與擴大接觸面積的反應槽C’(231)。若考慮熱傳導效率，本領域技術人員當可容易理解與熱交換槽的液體相接的面的面積越大，效率越佳。
[0097]反應所需的試藥若預先冷凍干燥，較為便利。如圖3B所示，可于反應槽26的底部，預先調制冷凍干燥試藥25。又，若于分注樣本時所用的分注芯片27內部，預先形成栓塞狀的冷凍干燥試藥25，則可通過上下移動樣本液28，使試藥容易溶解于樣本中。又，于尼龍纖維等成束的纖維珠29表面，預先形成冷凍干燥試藥25，通過插入于反應槽26內部的樣本28中攪拌，亦可溶解冷凍干燥試藥。
[0098]圖4系表示本發明的裝置所使用的圓柱型反應套體32及其對熱交換槽37的安裝方法的模式圖。由于直接處理由薄膜所構成的反應槽，較為不便，因此如圖4A所示，若將反應槽31固定于反應槽套體32，較為便利。反應槽套體32宜以隔熱性材質的聚苯乙烯、聚碳酸酯、PEEK、壓克力等來形成。又，對反應槽31的迅速且高精度的升溫、降溫而言，期望盡量壓低與反應槽31的結合面積(例如:5_2以下)。
[0099]圖4B系作為將反應槽31安裝于熱交換槽37的一個實施例，表示于反應槽套體32表面，預先形成螺紋槽34，將反應槽套體32旋入熱交換槽37的反應槽承口 33的方法。如圖4B所示，為了保持水密性，宜于開口部安裝封材35。圖4C進一步表示其他安裝方法。如圖4C所示，亦可采用錐形狀反應槽套體36，僅以壓力安裝于熱交換槽38。
[0100]圖5系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的閥的切換順序的模式圖。表示了用以于反應槽導入液體的進口閥A(41)、進口閥B(43)、用以導引至外部的出口閥A(42)及出口閥B(44)。從進口閥A(41)導引的液體系從出口閥A(42)回到液體儲存槽4，從進口閥A(43)導引的液體系從出口閥B(44)回到別的液體儲存槽4。通過交互輪替該兩種狀態，可使反應槽中的樣本反應。進而期望的閥切換方法，除了上述兩種狀態以外，通過一瞬間同時開放進口閥B(43)與出口閥A(42)，或進口閥A(41)與出口閥B(44)，可抑制不同溫度的液體混合，容易進行各個系統的液體儲存槽的溫度控制。
[0101]液體循環速度并未特別限定，一般約為ImL/秒?10mL/秒，更宜為5mL/秒?50mL/秒，最宜為7mL/秒?15mL/秒。為了使儲存槽中的溫度不降低而循環至熱交換槽3，液體宜通過泵7，始終從儲存槽以10mL/S以上的高速循環。
[0102]圖6A系表示從有關通過使用上述機構可實現的溫度控制的數據所得的線圖。如圖6A所示，可于1.5秒的短時間，使溫度從60°C升溫至92°C或回到60V。圖6B系表示實時PCR的結果的線圖。進行PCR時的溶液條件如下。以反應緩沖劑1.0yL、2mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP) I μ L、25mM 硫酸鎂 1.2 μ L、10 % 胎牛血清 0.125 μ L、SYBR Green I
0.5 μ L、引物兩種各 0.6 μ L、殺菌水 3.725 μ L、KOD plus polymerase 0.25yL、基因體DNA 1.0yL的比率混合。溫度條件首先以95°C進行10秒，接著將95°C I秒、60°C 3秒的溫度變化進行40循環。液體循環速度約為1mL/秒。
[0103]圖7系表示有關本發明的裝置所使用的反應槽59及反應槽套體51對熱交換槽的拆裝方法的變化。反應槽59展伸于載玻片型反應槽套體51而安裝(圖7A)。將該載玻片型反應槽套體51安裝于熱交換槽時，可沿著導軌53，使反應槽套體51往橫向滑動，推壓于封材54而固定(圖7B)。又，亦可將載玻片型反應槽套體51插入于玻片承口 55，活用鉸鏈56推壓于封材57 (圖7C)。
[0104]圖8系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的閥切換機構的變化的模式圖，其表示與圖5不同的滑動型活塞閥的驅動機構。作為改變反應槽66的溫度的閥機構，使用可往左右滑動的活塞65。于活塞65的左側，從進口 iU61)對熱交換槽67導入液體，從出口 A(62)導引至外部。于活塞65的右側，從進口 B (63)對熱交換槽67導入液體，從出口B (64)導引至外部。若活塞65對于反應槽66往右滑動,貝U反應槽66會與從進口 A(61)導入的液體的溫度達到平衡，反之，若往左側滑動，則會與從進口 B(63)導入的液體的溫度達到平衡。又，活塞65位于反應槽66的正下方時,液體可不漏泄而拆下反應槽66。活塞65宜由隔熱性良好的材料制作，或內部宜成為空洞，充滿氣體，亦或成為真空狀態。再者，圖8中的箭頭大致表示液體的流動方向。
[0105]圖9系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的活塞閥的活塞的驅動機構的數種變化。一方法系活塞71與活塞桿72成為一體，從外部直接運作的方法(圖9A)。其他方法系以鐵、鎳等強磁性材料制作活塞73，或于其他材料制作的活塞內部，裝入磁鐵74。于外部設置電磁線圈75，通過控制電流來使活塞73左右滑動(圖9B)。進一步的方法亦可通過控制進口側的壓力或出口的流體阻抗，利用活塞76兩側的壓力差，使活塞76往左右滑動(圖9C)。再者，圖9中的刷白箭頭表示活塞的運動方向，涂黑箭頭表示流體的流向，通過箭頭方向大致表示流體的流動方向，通過箭頭粗細大致表示流量。
[0106]圖10系表不聞速液體回流型的反應控制裝置所使用的閥切換機構的其他實施例。旋轉閥81插入于剖面呈圓形的熱交換槽83內部，而所述旋轉閥81系由結合有作為旋轉軸的棒82的傾斜的橢圓形板材所組成。旋轉閥81系將熱交換槽83分隔為左右，通過轉動旋轉軸82，可將從熱交換槽的右部或左部導入的液體，導引至反應槽84。圖10的旋轉閥81的形狀為傾斜的平板，但亦可為其他螺旋螺紋等形狀，若通過使旋轉軸旋轉，可產生同樣的效果即可。再者，圖10中的涂黑箭頭表示旋轉軸82的旋轉方向，刷白箭頭大致表示液體的流動狀況。
[0107]圖11系表示通過閥以外的構造來置換液體的構造。熱交換槽98系由隔膜A(95)及隔膜B(96)所區隔。從隔膜A(95)導入的液體系通過出口 A(92)導出至外部。由于隔膜的存在，不會從進口 B(93)或出口 B(94)導出(圖11A)。從進口 A(91)導入的液體的壓力凌駕于從進口 B(93)導入的液體的壓力時，通過將隔膜A(95)及隔膜B(96)往左側推出，從進口 A(91)導入的液體的熱會傳至反應槽97 (圖11B)。從進口 A(91)及進口 B (93)導入的液體的壓力關系為相反時，反應槽97的溫度會與從進口 B (93)導入的液體的溫度達到平衡狀態(圖11C)。隔膜宜由耐熱橡膠等耐熱性良好的薄膜制作。再者，圖11中的箭頭大致表示液體的流動方向。
[0108]圖12系表示高速液體回流型的反應控制裝置所使用的溫度設定型閥的進一步其他驅動機構的模式圖。在此，可設定的溫度不限定于兩種溫度。于圖12表示可將反應槽的溫度設定為3種以上的構造。于熱交換槽103，插入側面形成有溝槽102的轉閥101。于轉閥101兩側，設有進口及出口。例如從進口 A(104)導入的液體系經過流路108而流入溝槽102，對反應槽109傳熱的后，從出口 A(105)導引至外部。相對于此，從進口 B (106)導入的液體不與反應槽109相接，從出口 B (107)導引至外部。然而，通過旋轉轉閥101，可使得從任意進口導入的液體與反應槽相接(圖12C)。通過伴隨著經過時間111而旋轉轉閥101，可如圖12C的線圖所示令溫度110變化。轉閥101宜由隔熱性材料制作。
[0109]圖13系針對省略了高速液體回流型的反應控制裝置的3溫度型系統的控制系統部分的描述，表示一個實施例的全體構成的模式圖。用以引起高速PCR反應的反應控制裝置在典型上包括:反應槽(react1n vessel) I ;反應槽套體2,防止來自外部對于反應槽上的PCR反應液滴的污染及液滴蒸發；熱交換槽(heat exchange vessel) 3,導入有熱交換用的高速循環液；3個液體儲存槽(liquid reservoir tank)4,以個別的溫度保持3種溫度的液體；以及對于各儲存槽包括:熱源5、攪拌裝置6、泵7、切換閥8、旁通流路9、及輔助溫度控制機構10。為了實現高速PCR，從各個儲存槽，液體系往液體流動方向18的箭頭方向循環，于接頭90，從各儲存槽經各切換閥而接合有流路，誘導至通往熱交換槽3的流路而構成，又，從熱交換槽3流出的液體亦于下游側的接頭90，分支成通往各儲存槽的回流流路，使位于熱交換槽3的上游側及下游側雙方的各分支流路的各切換閥8同時連動，為了高溫、中溫、低溫的各儲存槽4的任一儲存槽液體的循環而切換，可瞬間將對于熱交換槽3導入的高速循環液體切換為高溫、中溫、低溫的任一溫度。在此，于圖13，為了便于理解而模式性表示裝置構成及配管配置，因此各零件間的配管長度并未表示如實際長度，但連結接頭90與各切換閥8的間的管長度，為使高速液體量幾乎無殘留，宜采鄰接于接頭90的方式配置切換閥8。又，為了使從各儲存槽4供給至熱交換槽3的高速循環液體的溫度下降維持在最小限度，應使得從各儲存槽4通往熱交換槽3的流路長度成為最小長度，在構成上嵌入于各儲存槽4與熱交換槽3之間的零件，宜為僅嵌入有切換閥8的兩個零件(機構)的最少數目的零件嵌入。另，關于從熱交換槽3回流至各儲存槽4的流路長度，即使稍長，由于會在通過下游輔助溫度控制機構10進行溫度補正后回流至儲存槽4，因此不構成問題。又’泵7的配置位置為了確實于熱交換槽3維持流速，供給高速循環液體，而且不對熱交換槽3供給時，通過切換閥瞬間且確實經過輔助溫度控制機構10回流至各儲存槽，宜將泵7配置于各儲存槽4與供給至熱交換槽4的上游側的切換閥8之間，配置成始終從儲存槽4直接「壓出」高速回流液體的構成。又，為了將從各儲存槽4對熱交換槽3供給的高速循環液體的溫度下降維持在最小限度，該等流路的流路內徑宜為2mm以上。
[0110]于圖1的實施例中亦已說明，于各儲存槽及各輔助溫度控制機構，配置有測量液體溫度的液溫傳感器16，根據該傳感器16的各信息，可將各儲存槽4的熱源5的溫度控制、及通過各輔助溫度控制機構10的液體溫度，微調成與儲存槽4的溫度相同的溫度。又，通過導入該輔助溫度控制機構10，可使儲存槽4的溫度緩沖功能成為最小，可將儲存槽4的容量，亦即循環液體量保持在最小。又，于本實施例，相對于圖1實施例的2溫度PCR反應,可實現分別對應于改質、退火、延長3種狀態的3溫度PCR反應而構成。在此，有關高溫、中溫、低溫3溫度的控制，就高溫而言，(圖13，中央儲存槽4)為了變性而保持95°C以上的高溫，因此儲存槽溫度僅利用加溫系統即足夠，但就中溫、低溫儲存槽而言，有時須根據使用酶的種類，進行其反應溫度，亦即儲存槽溫度的微調。在此，可通過來自熱源的熱量供給，容易地實現各儲存槽4內的液體溫度上升，而降低溫度時，例如可通過附加于儲存槽4的輔助溫度放熱機構17來降低液溫。該輔助溫度放熱機構17僅于欲使儲存槽4內的液體溫度降低時動作，采用通過嵌入機構內的泵系統，以高速吸入儲存槽內的液體，并通過嵌入有空冷式或帕耳帖組件等冷卻機構的流路的程序，來使液體的熱量放熱，直到最后確認成為通過設置于儲存槽4內的液溫傳感器16所設定的液溫為止，可進行液體冷卻。
[0111]因此，各儲存槽4的液體如圖1至圖6的說明所描述，從熱源5對儲存槽4供給熱，通過溫度傳感器16的回授控制，將各儲存槽的溫度保持在高溫(熱改質溫度)、中溫(延長反應溫度)、低溫(退火反應溫度)。又，由于以高于室溫的高溫進行溫度控制，因此為了有效進行熱對流，熱源位置宜配置于儲存槽4的底面，而且不僅使儲存槽4內的液體溫度進行熱對流，為了使其高速成為均溫，通過攪拌機構6等使得液體的溫度分布成為一樣的機構進行動作，以使溫度成為均溫而構成。然后，從各儲存槽4，始終以例如流速1mL/秒，通過泵6排出液體，不通過配置于該泵的后段的切換閥8，將液體誘導至熱交換槽3時，使其通過旁通流路9而回流至輔助溫度控制機構10，將液體溫度微調成儲存槽4的設定溫度后，回流至儲存槽4。亦即，進行儲存槽4 —泵7 —切換閥8 —輔助溫度控制機構10 —儲存槽4的循環，預先完成準備態勢。另，在欲使反應槽I的溫度變化為該液體溫度時，將泵7后段的切換閥8往熱交換槽3方向切換，且亦開關從熱交換槽3排出的液體流動方向的切換閥8，循環如儲存槽4 —泵7 —切換閥8 —熱交換槽3 —切換閥8 —輔助溫度控制機構10 —儲存槽4，使反應槽I的溫度變化為與預定的儲存槽4的液體溫度相同的溫度。
[0112]又，于3個儲存槽4，由于在該切換程序中，液體回流會發生些許的量偏差，因此在獨立運用3個儲存槽時，于重復反應程序中，于液面高度產生差異，可能發生液體從槽溢出，或從3個槽的送液速度產生差異。為了處置此問題，亦可設置連結管15，作為輔助性使液面高度齊平的機構。該連結管15的目的在于使液面高度齊平，并不以積極移動不同溫度的液體作為目的，因此宜為充分細的管。又，其配置位置宜為各儲存槽4的底面附近。
[0113]使用3溫度的儲存槽4進行PCR反應時，與圖6B的2溫度時的PCR反應相同，使用典型例來說明本裝置系統的動作。在此，以如下步驟進行3溫度PCR反應。首先，作為初始反應，使溫度成為94°C以上，以進行反應的雙股DNA進行熱改質，從設定為95°C或96°C的高溫儲存槽4，將高溫液體回流10秒以上，使反應槽I的溫度成為94°C以上達10秒以上。在此，設定上述高溫儲存槽4的溫度，使得進行熱變性時的溫度，即使于反應槽I整體的溫度分布產生差異時，溫度最低處的溫度仍為94°C以上。藉此，制備單鏈DNA，并且依酶類而定，活化PCR反應所需的酶類。接著，使引物與DNA特殊結合的退火步驟，通過來自為使反應槽溫度約略成為60°C而設定液溫為60°C的低溫儲存槽4的液體回流，使得反應槽I的溫度成為60°C,將該循環進行I秒，最后是通過耐熱性DNA聚合酶的互補DNA鏈的延長反應,為使反應槽I約略成為72°c，于設定為中溫的儲存槽4的溫度成為72°C的條件下，將中溫的儲存槽4的液體循環進行3秒，于延長結束時，再次進行熱變性步驟，以來自高溫儲存槽4的95°C液體的循環I秒，使得反應槽I的溫度進展至94°C以上的溫度，接著以低溫60°C I秒、中溫72°C 3秒的反應作為I循環，重復反應約略40循環，藉此可進行作為目標的DNA序列區的放大。在此，為了實際上使得溫度不從儲存槽4的溫度發生下降，須以對于送液至熱交換槽3充分的高速，使液體回流。于本實施例，液體的循環速度約為1mL/秒，以防止溫度下降的形式，可進行溫度變化。又，于上述實施例，退火溫度系依設計的引物，與最佳引物的結合溫度會有不同，因此宜利用后述的熔解曲線分析，算出最佳的退火溫度，于該溫度，設定低溫儲存槽4的溫度。又，于上述實施例，延長反應時間設定為3秒，但不限定于此，通過從DNA聚合酶的延長速度與目標序列尺寸的關系算出，可適當決定設定時間。例如由代表性的Taq聚合酶所造成的DNA延長速度，在70°C時，約為60核苷酸/秒，因此在該酶的情況下，以3秒的延長反應，可放大150?180堿基長的目標區。因此，為了有效實現本發明的裝置系統下的高速PCR反應，宜將目標區集中于數百堿基長而進行引物設計，根據目的選擇最佳的DNA聚合酶，盡量使用進行高速反應的聚合酶。
[0114]又，以上述3溫度進行循環時，可搭配組合終點型測量與采實際時間(實時)的放大測量的至少兩種測量法。于圖1亦已表示，于本發明的高速基因放大裝置，可嵌入光學偵測系統，就光學上監測目標基因產物的放大。一般使用由于被帶進稱為嵌入劑型的雙鏈DNA的氫結合區，熒光強度會大幅變化的熒光色素進行測量時，就量化地測量產物量而言，目標DNA產物為雙鏈系甚為重要。因此，終點型由于可于反應結束后測量，因此宜于反應結束后，在可于雙鏈DNA狀態下測量的溫度范圍內，令其穩定而測量，或者于最后放大循環結束后，立即測定熒光強度，通過與放大反應開始前的熒光強度比較分析，來估計由雙鏈DNA所造成的熒光強度的放大量。在此，作為重要的注意點，由于熒光色素會有溶液中的熒光強度取決于溶液溫度而變化的熱熒光消光現象，因此測量時的溫度務必以相同溫度進行，此甚為重要。
[0115]另，于實際時間測量，從估計各放大循環的放大量來看，須于各循環測量。各循環的測量時序宜于上述延長反應接近結束，熱變性正要開始前測量。在此，同樣為了排除熱熒光消光的影響，在各循環測量時的溶液溫度宜設為相同溫度。又，于一般稱為TaqMan探針法，使用具有5’_3’核酸外切酶功能的DNA聚合酶、及為了對應熒光能量移動而嵌入有給體熒光色素與受體熒光色素的探針DNA片段而測量時，由于5’ -3’核酸外切酶反應是于DNA聚合酶的延長反應時進展，因此于終點型，將測量開始前的給體熒光色素與受體熒光色素，于各自的熒光波長測定熒光強度后，進行基因放大反應，于結束后，將給體熒光色素與受體熒光色素，于各自的熒光波長測定熒光強度后，量化地偵測探針DNA實際上被酶所分解的程度，藉此可分析目標堿基序列的有無。在此，同樣為了排除熱熒光消光的影響，測量時的溶液溫度宜設為相同溫度。另，于實際時間側量，探針DNA片段的分解反應若于聚合酶的延長反應時進展之后，各放大循環的延長反應結束時，或者熱變性時，進行退火時的給體熒光色素的波長與受體警告色素的波長的熒光強度測量即可。其中，在此作為應留意點，同樣為了排除熱熒光消光的影響，測量時的溶液溫度宜設為相同溫度。
[0116]又，使用于本發明的高速PCR反應的反應槽I可為拋棄式芯片，因此進行交換時，須采取排出充滿于熱交換槽3中的液體,成為無液體狀態后,取下反應槽套體2,然后取下反應槽I的程序。因此，于圖13所示的實施例，配置為空氣的流入管2001夾住閥(切換閥)8而與熱交換槽3接觸，又，熱交換槽3的液體的排出管2002同樣經過閥(切換閥)8、液體排出泵6，連接于通往儲存槽4的I個輔助溫度控制機構10的循環路徑。實際上，于使用3溫度的儲存槽4的液體進行基因放大反應等時，裝設于管2001、2002的2個閥8被關閉，不會對來自3個儲存槽4的液體的回流造成影響。于基因放大反應結束的階段，切換與3個儲存槽4結合的6個切換閥8，不與本熱交換槽3進行液體交換而切離，其后將連接于管2001、2002的各個的閥8予以連接，使用泵7，將熱交換槽3內部的液體送液至例如低溫用的儲存槽4的輔助溫度控制機構10，熱交換槽3內部能以空氣來充滿。如此之后，交換反應槽1，重新裝上別的反應槽1，封閉連接于管2001、2002的切換閥8，當從出自儲存槽4的回流系統開始將液體送液時，熱交換槽3內被液體充滿，可重開一般的基因放大反應。
[0117]進而言之，于本發明的裝置，通過利用進行液體溫度控制的機構，亦可進行熔解曲線測定。進行熔解曲線分析時，例如對反應槽I的反應液，連續從65至95°C，以ramprate0.1 TC /sec給予溫度變化，一面以設置于反應槽I內的液溫傳感器，監測反應槽I的溫度，一面使用如圖1所示的光學測量模塊，測量當時反應槽I的PCR反應液的嵌入劑熒光色素的強度變化等，可測量溫度與熒光強度的相關熔解曲線分析的測量。此時，例如使用圖13的3個儲存槽4中嵌入了輔助溫度控制機構10的儲存槽，首先降低儲存槽內的液溫，直到成為預定的低溫側的開始溫度。接著，對儲存槽內的熱源逐漸些許加施熱量，一面以溫度傳感器16進行測量，一面進行恰為0.1 TC /sec程度的溫度上升的熱量供給，在此同時，對熱交換槽3供給該儲存槽的液體。從熱交換槽3返回的液體系以輔助溫度控制機構10，調整成與儲存槽的溫度相同的溫度。然后，最后作為最終溫度，若達到95°C，為了降低儲存槽內的液溫，再次通過輔助溫度放熱機構17，將液體溫度降低至當初設定的溫度即可。
[0118]于圖1亦已說明，反應槽I系由反應槽套體2保持在密閉狀態。于較佳實施例,反應槽套體2系根據由溫度傳感器16測量的溫度數據，通過嵌入于反應槽套體2的加熱器始終保持在75°C以上。通過利用該加熱器加熱，防止套體內的水蒸汽在套體的內表面冷凝，藉此，套體內的水蒸汽保持在一定，其結果，反應槽的液滴即使以無添加礦物油等的暴露狀態的液滴狀態來配置，仍可不蒸發且于50?97°C的范圍內進行溫度變化。
[0119]又，同樣地，熔解曲線分析用的溫度控制手法，亦可為了以不同于PCR反應的溫度，來保持于一定溫度而采用。藉此，亦可針對反應槽的PCR反應液,進行反轉錄反應。例如亦能以50°C的液體溫度，使液體回流10分鐘以上，藉此從RNA對DNA進行轉錄后，將該儲存槽的溫度調整為一般進行PCR反應的溫度，連續從反轉錄反應進展至PCR反應。
[0120]具體上接續于反轉錄步驟而進行的基因放大反應的步驟，包括單步操作(反轉錄與放大在I個管內連續進行)或二步操作(反轉錄與放大在個別的管內進行)兩種步驟，在此以單步操作為例來表示操作程序的一個實施例。作為對于短目標的單步RT-PCR用反轉錄酶，例如使用Tth DNA Polymerase(Roche)時，該反應的最佳反應溫度為55?70°C，因此(I)將低溫儲存槽的溫度設定為低于一般退火溫度的50?60°C，使該低溫儲存槽4的液體以30分鐘程度回流至熱交換槽3，進行反轉錄反應，接著(2)通過高溫儲存槽4，對熱交換槽3使94°C以上的液體回流約2分鐘，進行初始熱變性，其后，(3)作為放大循環，以3秒循環進行如下程序及反應:通過來自高溫儲存槽4的94°C以上的液體進行I秒以上的熱變性程序，接著是對應于來自為了退火用而進行了溫度調整的低溫儲存槽4的引物特性，通過45?66°C的液體所進行的退火程序，然后是配合中溫儲存槽4的酶特性，通過68?70°C的液體進行延長反應。于該實施例中，3種不同溫度的儲存槽4的I種溫度，調整為對于反轉錄反應最佳的溫度，進行反轉錄反應后，再次重設定為對于PCR反應最佳的溫度，進行3溫度基因放大反應，亦可同樣附加對于反轉錄反應最佳的溫度的第4儲存槽4，進行上述程序。
[0121]圖14系表示用以使反應槽I具有上述熔解曲線分析的測量功能的其他手法的實施例之一。于該實施例，帕耳帖溫度控制機構19配置于熱交換槽3的底面，在此，于帕耳帖溫度控制機構19，貫通有PCR反應用循環液體的流路管20，因此可同樣進行上述圖13所述的高速PCR反應用的液體循環，進而于進行熔解曲線分析時，使液體流路管20的液流18停止，通過帕耳帖溫度控制機構19及熱交換槽3內的溫度傳感器16，控制充滿于熱交換槽3的靜止液體的溫度，來進行熔解曲線分析。又，該機構同樣可用于反轉錄反應。屆時，可由帕耳帖溫度控制機構19提供對于反轉錄反應最佳的溫度及時間，于反轉錄反應結束時，使用圖1所示的2溫度基因放大裝置的構成、或圖13所示的3溫度基因放大裝置的構成，接著連續進行聞速基因放大。
[0122]圖15系表示本發明的連續拋棄式反應槽I的利用方法的一個實施例，以及包括可進行反轉錄反應的反應槽I的反應槽部的一個實施例的模式圖。本發明的反應槽I系如上述圖13的說明所述，可作為拋棄式芯片來使用。此時，如圖15的A-A剖面圖所示，例如進行高速基因放大反應的反應槽典型上通過包括:用以進行PCR的反應槽1，以固定反應槽I的O型環1010等保證了隔熱性與密閉型的間隔件，夾住反應槽I上下的反應槽套體2與熱交換槽3，及用以搬運反應槽的導軌1011，可沿著導軌1011將復數個反應槽I搬運至反應槽部1015。將反應槽I用于反應時，通過以反應槽套體2與熱交換槽3夾住，通過O型環1010使反應槽I固定，可從液體儲存槽4導入液體。另，搬運時，通過使反應槽套體2與熱交換槽3脫離反應槽1，松開O型環1010，可使反應槽I的芯片沿著導軌1011移動而交換。從圖15的A-A剖面圖可知，反應槽套體2系為了就光學上觀察并測量配置于反應槽I上的反應液，可采取在光學上呈透明的構成。此時，于2片薄的玻璃板1013之間，夾入ITO等通過阻抗有效引起發熱的透明電極1014，可對光學式觀測不造成妨礙且控制反應槽套體2的溫度。尤其通過于內側的玻璃板1013內面設置溫度傳感器16，調整為75°C以上的溫度，可防止反應槽套體2內面冷凝，防止蒸汽壓變化，因該結果，可防止配置于反應槽I上的反應液蒸發。
[0123]又，通過于導軌1011上反應槽部1015的前段，配置反轉錄反應槽部1016，可將RNA樣本反轉錄于cDNA，以后段的反應槽部1015，進行高速基因放大。于反轉錄反應槽部1016，從圖15的B-B剖面圖亦可知，與反應槽套體2相同構成的套體，為了就光學上觀察并測量配置于反應槽I上的反應液，可采取在光學上呈透明的構成。此時，于2片薄的玻璃板1013之間，夾入ITO等通過阻抗有效引起發熱的透明電極1014，可對光學式觀測不造成妨礙且控制套體內部的溫度。尤其通過于內側的玻璃板1013內面設置溫度傳感器16，調整為75°C以上的溫度，可防止反應槽套體2內面冷凝，防止蒸汽壓變化，因該結果，可防止配置于反應槽I上的反應液蒸發。于反應槽I的下面，配置有反轉錄反應用溫度板1012，對反轉錄最佳的溫度設定于例如50°C的狀態下，通過緊貼于反應槽1，以50°C使裝有PCR溶液的反應槽I的板溫度反應30分鐘程度，于反轉錄完畢時，其后通過讓導軌滑動于反應槽部1015，以開始PCR。
[0124]圖16系表不本發明的多樣本的基因放大反應的實時偵測方法的一個實施例的模式圖。本發明的反應偵測裝置在典型上包括多孔反應槽(react1n vessel) 1101、配置為數組狀的復數個反應孔1102、及偵測裝置1201。通過使偵測裝置1201，于PCR反應中往例如方向1202掃描，偵測反應孔1102上的PCR樣本的熒光強度，藉此包括以數目少于反應孔數的偵測器，測定全樣本中的熒光強度的功能。在此，如圖13的說明亦已敘述，于采嵌入劑方式進行熒光偵測時，宜于PCR的延長反應結束時，且于開始熱變性前的雙鏈DNA狀態尚維持的時間內測量。又，于TaqMan探針方式，突光探針的PCR延長反應時產生量變化的突光探針量的熒光偵測時，從PCR延長反應結束后的時序，可于熱變性、退火階段的任一階段測量。其中，于任一情況下，為了比較測量熒光強度，宜使得含熒光色素的反應液的溫度相同。此系為了防止由于具溫度相依性的熒光消光，即使反應液內的熒光色素量相同，因溫度不同導致熒光強度不同。
[0125]圖17系表不本發明的多樣本的基因放大反應的實時偵測方法的一個實施例的模式圖。本發明的反應偵測裝置在典型上包括多孔反應槽1101、配置為數組狀的復數個反應孔1102、及偵測探針1203。準備與位于1101上的反應孔1102的數目同量的偵測探針1203的數組，定點觀測PCR樣本的熒光強度，以便測量無分段的連續的時間變化，藉此可與圖16所示的掃描型不同，偵測連續的熒光強度變化。
[0126]圖18系作為用以使反應槽I上的反應液在PCR反應中不干燥的手段，模式性地表示了將封入有為了防止載置于反應孔1102上的樣本蒸發而封的封材1302，黏貼于反應槽1101上的一個實施例。在此，為了使封材1302不與反應孔1102中的樣本溶液1303相接，且于反應液滴下時、搬運時、PCR測定中，抑制樣本反應液在孔內的移動，于各反應孔的中心構成有柱(柱體(pillar))1301的構造的一個實施例。該柱1301采用由熱傳導性高的鋁等金屬的凸紋加工或附加而制作的構造，或以光學上具穿透性的玻璃或塑料來制作。
[0127]藉此，5?1yL的PCR溶液不移動于PCR反應中，且可防止與密封劑相接。又，通過柱體可于更廣的表面積延展液滴，其結果，與單純于反應槽1101的表面滴下反應液的液滴的情況相比，可于更廣的表面積延展液滴，可更有效與熱交換槽交換反應液溫度。又，柱體1301為光學上透明的塑料或PDMS等高分子構造材料時，通過摻入會發出與實時PCR測定中偵測的波長不同熒光的物質，可作為校準PCR的熒光強度的參考來使用。
[0128]圖19系表示于設置在反應孔1102內，由具光學性傳導性或光纖玻璃或塑料等材料形成的柱體1301表面，結合有DNA探針1306或引物，以使PCR反應中的DNA可于附近雜交的一個實施例的模式圖。藉此，于有效進行PCR反應物放大時,在柱體表面附近，DNA放大物有效結合，可利用柱體的光纖特性，以高于一般的偵測感度，將其熒光進行實時PCR反應。發出熒光的手段可利用如圖19A所示，使用通過DNA雙鏈時嵌入，以發出熒光的SYBRGreen等嵌入劑1304的手段，或利用如圖19B所示，PCR反應物1302雜交時，DNA的立體構造崩解，藉此結合于DNA探針末端的熒光物質1305發出熒光的熒光共鳴能量移動(FRET)法的探針法等。或者，于柱體1301表面或柱體1301中，導入熒光受體熒光色素，將嵌入劑作為給體熒光色素使用，藉此有效放大目標DNA時，結合于柱表面的探針DNA與放大產物DNA結合，嵌入劑熒光有效產生于柱體表面，藉此亦可從柱的熒光發光來測量受體發光。此優點若從以往采用嵌入劑的熒光強度變化的指針來觀察目標DNA而言，通過熒光能量移動，觀察受體熒光的發光信息的與別的嵌入劑熒光色素不同波長的熒光，藉此可量化地測量，可實現噪聲更低的量化測量。
[0129]圖20系模式性地表示為了有效控制反應液溶液，于反應槽1101中，實現無法僅以現有的液滴滴下來實現，可于更廣的表面積與熱交換槽相接的反應液的空間配置，通過微加工技術，于反應槽中構成反應液的導入路徑及反應區的一個實施例。本實施例所示的微流路型反應槽1401系于上述圖1至19所示的實施例所用的熱傳道性良好的鋁薄板等的反應槽1404上，黏著聚二甲基硅氧烷等具光學穿透性及彈性的材料所組成的流路形成用高分子1403。于該芯片配置有:樣本注入口 1405 ;微流路1402，通過毛細現象，從樣本注入口導入反應液而通過；反應液儲存槽1407，充滿反應液；及空氣儲存槽，回收反應液時按壓此，通過空氣壓從樣本注入口 1405回收反應液。于該實施例，在將反應液導入于注入口1405之后，以上述圖1或圖13所示的高速基因放大裝置進行基因放大后，按壓樣本回收用空氣儲存槽1406，從樣本注入口 1405回收反應液以5μ L以下較妥當，宜將注入口 1405至反應液儲存槽1407的容積抑制在5μ L以內。又，于上述實施例使用了空氣儲存槽，亦可如圖20Α-Α’剖面圖所示，將空氣儲存槽的位置設在樣本排出口 1408。此時，于反應后的反應液回收時，通過從樣本注入口 1405吹入空氣，可從樣本排出口 1408回收。又，于圖20的實施例，反應液儲存槽1407的高度設定高于微流路1402，但為了更有效進行熱交換，盡可能將反應液儲存槽1407的高度設定較低，藉此可進行更有效的PCR反應。
[0130]圖21系針對圖13所示的實施例，作為溫度控制用液體的送液手段，模式性表示使用了注射泵1411時的一個實施例的。能以每秒1mL以上的流速進行自動送液及自動吸液的注射泵1411表面，配置有熱源5，于注射泵中配置有溫度傳感器16，將溫度控制用的液體導入于熱交換槽3時，切換欲送液溫度的注射泵1411的切換閥8，從各注射泵經接頭90而將液體導入于熱交換槽3。然后，從熱交換槽3返回的液體具如下功能:經過接頭90及切換閥8而儲存于輔助溫度控制機構10，使液體回到與設定于注射泵1411內的溫度相同的溫度后，回流至注射泵。然后，來自注射泵的送液結束，來自別的注射泵1411的其他溫度的送液開始之際，使得切換閥8與注射泵1411及輔助溫度控制機構10連接而進行切換，將液體回收于注射泵1411內而構成。
[0131]圖22系表示為了反應液的溫度控制，照射反應液的水吸收強的紅外線，利用該吸收的溫度變化的一個實施例的。發明人已經針對該聚焦紅外光吸收的高速PCR裝置技術，記載于日本特開2008-278291，于圖22的本實施例，所采用的構成系反應液的溫度控制不以紅外雷射1510的強度控制來進行，而使用連續為圓狀，穿透率階段性變化的漸變ND濾光片1515，及經由軸體縝密控制該ND濾光片1514的角度的步進馬達等馬達1513，通過使角度可高度變化，以使光強度高速變化。藉此不僅可達成急遽的溫度變化，而且通過設為各種一定旋轉各速度，不僅可正確且縝密進行反應液的每單位時間的溫度梯度，而且可將溫度變化自由編程。
[0132]圖22的本實施例的裝置構成系以聚光透鏡1502，將來自照明用光源(鹵素燈等)1501的可見光，為了可就光學上觀察自動XY平臺1503上的反應孔盤1507的各反應液的狀態，經由物鏡1508對準焦點，能以圖像觀察用攝像機(冷卻CXD等)1522來觀察。自動XY平臺1503可通過X軸用馬達1504及Y軸用馬達1505驅動，來觀察任意坐標的孔。又，通過平臺加熱器1506，可控制反應孔盤1507的溫度，成為例如退火溫度等PCR反應中的最低溫度的溫度。另，紅外雷射1510可通過射束擴束器1511、雷射遮斷器1512、漸變ND濾光片1515,以紅外雷射用分色鏡1509導入于顯微鏡光學系統。又,漸變ND濾光片1515系其中心的軸體1514與步進馬達等馬達1513相連接，藉此可利用漸變ND濾光片1515自由調整紅外雷射的穿透率。在此，關于漸變ND濾光片1515表面的ND的漸變模式，一般如圖23(a)所示，采用因應其角度，以直線式ND = NDmax.( Θ / Θ mx)的關系變化者即可。或者，通過取決于角度Θ，事先寫入漸變的模式，藉此一面以一定的角速度旋轉，一面于水滴照射預定的穿透光強度的紅外線亦可。圖23(b)系以旋轉一圈時，用以進行一般的3溫度PCR反應的程序會成為I循環的方式來構成漸變的I例。首先，從穿透光0%的狀態一口氣上升至100%的穿透，并使水滴溫度提高至95度以上的溫度，藉此進行核酸的熱變性，接著使穿透光回到O%，以便預先使外部溫度從55度回復到60度程度的退火溫度，藉此水滴下將至退火溫度，進而以ND濾光片圓盤的旋轉,使得穿透光穿透例如30%程度,藉此可使水滴溫度變化為70度，PCR延長反應進展。此時，在以一定角速度旋轉圓盤時，各穿透光的照射時間比可通過反應于該漸變模式的空間配置來實現。為了量化測量反應孔中的PCR反應而進行熒光反應，于該光學系統，可將來自熒光激發用光源(水銀燈等)1517的激發光，經由熒光激發光源用遮斷器1518、熒光激發光用投光透鏡1519，通過熒光激發光用分色鏡1516導入激發光，并經由調整為不導入加熱用紅外雷射的波長光以及激發光的攝像機用分色鏡1520、成像透鏡1521，通過冷卻CXD等圖像觀察用攝像機1522，量化地測量熒光強度而構成。關于圖22所述的光學加熱法，可與上述圖1至21所述的手法靈活地搭配組合。
[0133]例如上述圖1至21的實施例，通過附加本圖22的光學加熱法，可不變更儲存槽4的溫度，簡單地嵌入熔解曲線分析功能。具體而言，關于來自儲存槽4的高速循環液體的流動，使最低溫度的液體預先循環，或于使高速循環液體的導入開始前，對包含目標核酸分子及嵌入劑功能的熒光色素的水滴，連續照射加熱用紅外雷射，此時，使得構成為減光的漸變程度呈一次函數的線性(直線)減少的漸變ND濾光片1515，以水滴溫度充分安定追隨的程度的一定角速度旋轉，藉此可使水滴溫度直線地上升或下降。在此，關于上升，可于使其以ND大小減少的方向旋轉時實現，關于下降，可于使其以ND大小上升的方向旋轉時實現。通過以每秒0.1弧度以下的緩慢旋轉，記錄其角度信息及熒光強度變化，以便可通過采用以下所述從角度Θ的液滴溫度估計法，來獲得熒光強度的結果，可進行熔解曲線分析。在此，溫度估計法系采用如下手法:將穿透光0%設為Θ = O弧度，穿透光100%設為Θ = 2 π弧度，預先調整照射光源的紅外線強度，使得照射穿透光100%時，水滴溫度會成為95度以上，一面原樣維持該調整過的熒光強度，一面旋轉漸變ND濾光片，以(Θ /2 ii ).(Tmax-Tmin)的關系式，從角度Θ的測定來估計水滴溫度。其中，在此，TmaxS穿透光100%的照射時的水滴溫度，Tmin為照射如的芽透光0%的水滴溫度。
[0134]或者，將本構成與如圖23(b)所示的I系統高速回流系統搭配組合，亦可簡單通過光學式光熱轉換，來實現高速PCR反應，而前述I系統高速回流系統系于漸變ND濾光片的圓盤上，預先將穿透光的比率以Θ采一定速度旋轉作為前提，相依于Θ來配置，以便使得旋轉一圈時，一次或數次PCR反應會結束，藉此使得目標在于令液滴的最低溫度安定化的最低溫度的高速液體回流。在此，由于高速回流系統為I系統，因此無須嵌入上述圖1至21所記載的復雜切換閥或嵌入切換程序，而且儲存槽I個即足夠，可大幅簡化構成。
[0135]本發明還提供基因分析或基因放大用裝置，該裝置包括:反應槽(react1nvessel),包括用以裝入含核酸的樣本液的I個或復數個孔(well);熱沉(heat sink)或熱交換槽(heat exchange chamber);熱沉或熱交換槽的溫度控制裝置(temperaturecontroller)(例如:溫度傳感器、熱電線、液體回流型溫度控制裝置)，將熱沉或熱交換槽保持在第I溫度而構成；熱電組件(thermoelectric element)(例如:帕耳帖組件)，配置于熱沉或熱交換槽與反應槽之間，中介熱沉或熱交換槽與反應槽之間的熱移動；及熱電組件控制裝置(thermoelectric element controller)(例如:溫度傳感器、計算機(例如:PC))，通過控制熱電組件的動作(operat1n)，令反應槽的溫度，在第I溫度與第2溫度之間變化；使得在熱電組件的動作為關閉時，反應槽的溫度成為第I溫度而構成。
[0136]圖24系表示該類本發明的基因分析或基因放大用裝置的構成的非限定性的一個實施例的模式圖。圖24所示的本發明的實施例包括:DNA反應芯片容器2401，用以保持含DNA的樣本；帕耳帖組件2403 ;熱傳導用薄板2402，用以提高帕耳帖組件2403與DNA反應芯片容器2401之間的熱傳導效率；熱沉2404 ;熱電線2405，用以加熱熱沉2404 ;溫度傳感器2406，用以監控DNA反應芯片容器2401的溫度；溫度傳感器2407，用以監控熱沉2404的溫度；觀察窗2408，用以觀察設于DNA反應芯片容器2401的樣本；及熒光偵測模塊2409，用以經由觀察窗2408，將樣本液中的樣本狀況進行熒光觀察。
[0137]作為DNA反應芯片容器2401，可直接使用前述液體回流型或光吸收加熱型反應控制裝置所用的反應容器構成，以及光學熒光強度偵測系統。關于熱源，將控制在DNA延長反應溫度(中溫)的熱沉2404作為安定熱源使用，從該熱沉，經由帕耳帖組件2403及使熱均質傳遞于平面上的熱傳導用薄板2402(由包含鋁、杜拉鋁、金、銀、鎢、尼泊爾黃銅、鎂、鑰、鈹，及使用該等元素的合金的熱傳導性高的金屬或合金所構成)，對DNA反應芯片供給熱，能高速移動至DNA變性溫度(高溫)，或使熱逸失而高速移動至退火溫度(低溫)。溫度傳感器2406配置于被配置在反應芯片正下的熱傳導用薄板2402上面，可實時監控熱傳導板上面的反應芯片的溫度，驅動帕耳帖組件2403，以使該計測溫度與事先寫入于程序的溫度經時變化配置文件成為相同溫度。由于熱沉是由具有足以安定處于中溫的熱容量與熱傳導性的金屬等材料(例如:鋁、杜拉鋁、金、銀、鎢、尼泊爾黃銅、鎂、鑰、鈹，及使用該等元素的合金)所組成，因此從電熱線2405等可安定供給熱的模塊，監控配置于熱沉的溫度傳感器2407的溫度，依據來自該傳感器2407的信息，通過溫度控制模塊(例如:回授控制機構)(電熱線等電流驅動型熱源的情況下，此系控制電流量及極性，就液體回流型溫度控制裝置而言，此系具有對水溫加熱冷卻模塊傳送0N/0FF控制訊號的功能)，穩定地將所需的熱供給至熱沉，保持中溫。本發明的最大特征在于通過將熱沉設定為中溫(備注:嚴格來說，為了將反應槽或反應容器設定為中溫，若考慮熱傳導損失，熱沉溫度可能從反應容器的設定溫度往高溫或低溫側相當偏離)，若使帕耳帖組件2403關閉，則可不過沖，且自律性地高速使得DNA反應芯片的溫度，達到目標的中溫的DNA延長反應溫度，以作為平衡溫度。一般而言，通過使用帕耳帖組件等回授控制組件持續供給熱，以維持一定溫度的手法，容易導致起因于回授控制的過沖或溫度振動，且具有消耗電力非常大，由于連續的帕耳帖組件動作而造成組件壽命縮短等問題。另，如此通過關閉帕耳帖組件而可實現中溫的本發明，可于PCR反應中最耗費時間的PCR延長反應時關閉帕耳帖組件，又，無須使得在低溫側通過退火而結合的雙鏈DNA，冒著因溫度上升所造成的過沖而乖離的風險，即能以接近平衡點的形式達成延長反應溫度。又，由于高溫側的DNA變性溫度及低溫側的退火溫度為I秒程度短時間的帕耳帖組件動作(變性反應與退火反應)，且容許些許過沖，因此不須進行嚴密的溫度控制，又，由于對DNA反應芯片取出/置入熱的帕耳帖組件所接觸的熱源安定于中溫，因此關于用以達到目標溫度所加施的電流量，亦可估計大約值。亦如上述液體回流型裝置例所示，DNA反應芯片系于DNA反應芯片容器2401的上面，配置有被配置了 ITO等發熱性透明電極的觀察窗2408，供給熱以使芯片上面的溫度成為75°C以上，藉此可防止芯片內的試藥從底面蒸發及在容器上面冷凝，即使為微量的試藥反應液，仍可使其不蒸發，以熒光偵測模塊2409偵測PCR反應。
[0138]圖25系模式性表示實際上DNA反應芯片中的試藥的反應溫度(a)及對帕耳帖組件的電流施加例(b)。從圖可知，帕耳帖組件的動作時間限于用以成為高溫及低溫的短時間動作，又，成為低溫后往中溫的溫度變化，系通過熱沉對DNA反應芯片的熱傳導所達成的熱平衡來實現。
[0139]若依據本發明，可進行以高速令溫度變化的溫度控制。因此，就標準的PCR而言，例如變性溫度(高溫)設定為94°C，延長溫度(中溫)設定為72°C，以及退火溫度(低溫)設定為55°C時，從中溫到高溫、高溫到中溫、中溫到低溫、以及低溫到中溫各個溫度變化所需時間，可成為例如2秒、I秒、0.9秒、0.8秒、0.7秒、0.6秒、0.5秒、0.4秒或0.3秒，亦或更短的時間。
[0140]于本實施例，例示了 3溫度PCR的情況，但同樣地，僅包括高溫及中溫的2溫度PCR，亦可同樣只以帕耳帖組件對高溫的開啟/關閉(0N/0FF)來實現。又，關于熔解曲線分析或RT-PCR步驟，亦可通過使熱沉溫度緩慢變化來實現，或者通過溫度傳感器，一面回授控制帕耳帖組件對DNA反應芯片的熱供給，一面緩慢使溫度變化來實現。
[0141]又，于本實施例雖使用熱沉及電熱線作為中溫熱源，但于包括I個中溫液體儲存槽的高速液體回流型的反應控制裝置，或于諸如圖1、圖13、圖21所記載，可支持2溫度或3溫度的高速液體回流型的反應控制裝置，亦可取代上述熱沉而使用設定為中溫的I個液體儲存槽及熱交換槽3。又，于包括可支持2溫度或3溫度的復數個儲存槽的液體回流型反應控制裝置，具有中溫本身亦可有不同溫度變化的優點。
[0142]產業上的可利用性
[0143]本發明系作為用以進行要求嚴密控制樣本溫度的反應的反應裝置甚為有用。本發明亦作為用以進行要求迅速變更樣本溫度的反應的反應裝置甚為有用。
[0144]本發明尤其作為可進行高速、高精度、高放大率的PCR反應的PCR裝置甚為有用。本發明的裝置亦可小型化，因此作為可攜式PCR裝置甚為有用。
[0145]符號說明
[0146]I 反應槽
[0147]2 反應槽套體
[0148]3 熱交換槽
[0149]4 液體儲存槽
[0150]5 熱源
[0151]6 攪拌機構
[0152]7 泵
[0153]8 切換閥
[0154]9 旁通流路
[0155]90接頭
[0156]10輔助溫度控制機構
[0157]11進口 A
[0158]12進口 B
[0159]13出口 A
[0160]14出口 B
[0161]15連結管
[0162]16溫度傳感器
[0163]17輔助液體放熱裝置
[0164]18液體的流動方向
[0165]19帕耳帖溫度控制機構
[0166]20液體的流路管
[0167]2001 空氣的流入管
[0168]2002 熱交換槽的液體的排出管
[0169]2003 壓力泄閥
[0170]21、22、23、24、26、231 反應槽
[0171]25冷凍干燥試藥
[0172]27分注管
[0173]28樣本
[0174]29纖維珠
[0175]31反應槽
[0176]32反應套體
[0177]33反應槽承口
[0178]34螺紋槽
[0179]35封材
[0180]36錐形狀反應槽套體
[0181]37,38 熱交換槽
[0182]41進口閥 A
[0183]42出口閥 A
[0184]43進口閥 B
[0185]44出口閥 B
[0186]51載玻片型反應槽套體
[0187]52、58 熱交換槽的反應槽承口
[0188]53導軌
[0189]54封材
[0190]55玻片承口
[0191]56鉸鏈
[0192]59反應槽
[0193]61進口 A
[0194]62出口 A
[0195]63進口 B
[0196]64出口 B
[0197]65活塞
[0198]66反應槽
[0199]67熱交換槽
[0200]71活塞
[0201]72活塞桿
[0202]73活塞
[0203]74磁鐵
[0204]75電磁線圈
[0205]76活塞
[0206]81旋轉閥
[0207]82旋轉軸
[0208]83熱交換槽
[0209]84反應槽
[0210]91進口 A
[0211]92出口 A
[0212]93進口 B
[0213]94出口 B
[0214]95隔膜 A
[0215]96隔膜 B
[0216]97反應槽
[0217]98熱交換槽
[0218]101 轉閥
[0219]102 溝槽
[0220]103 熱交換槽
[0221]104 進口 A
[0222]105 出口 A
[0223]106 進口 B
[0224]107 出口 B
[0225]108 流路
[0226]109 反應槽
[0227]110溫度
[0228]111 經過時間
[0229]201 熒光偵測器
[0230]202 控制分析部
[0231]203 控制訊號
[0232]204光學窗
[0233]1010O 型環
[0234]1011導軌
[0235]1012反轉錄反應用溫度板
[0236]1013玻璃板
[0237]1014透明電極
[0238]1015反應槽部
[0239]1016反轉錄反應槽部
[0240]1101反應槽
[0241]1102反應孔
[0242]1201突光偵測探針
[0243]1202熒光偵測探針的掃描方向
[0244]1203數組化的突光偵測探針
[0245]1301柱體
[0246]1302蒸發防止用封材
[0247]1303PCR 溶液
[0248]1304嵌入劑
[0249]1305熒光探針
[0250]1306DNA 探針
[0251]1401微流路型反應槽
[0252]1402微流路
[0253]1403流路形成用高分子
[0254]1404反應槽
[0255]1405樣本注入口
[0256]1406樣本回收用空氣儲槽
[0257]1407反應液儲存槽
[0258]1408樣本排出口
[0259]1411樣本泵
[0260]1501照明用光源(鹵素燈等)
[0261]1502聚光透鏡
[0262]1503自動XY平臺
[0263]1504X軸用馬達
[0264]1505Y軸用馬達
[0265]1506平臺加熱器
[0266]1507反應孔盤
[0267]1508物鏡
[0268]1509紅外雷射用分色鏡
[0269]1510紅外雷射
[0270]1511射束擴束器
[0271]1512雷射遮斷器
[0272]1513馬達(步進馬達等)
[0273]1514軸體
[0274]1515漸變ND濾光片
[0275]1516突光激發光用分色鏡
[0276]1517熒光激發用光源(水銀燈等)
[0277]1518熒光激發光源用遮斷器
[0278]1519熒光激發光用投光透鏡
[0279]1520攝像機用分色鏡
[0280]1521成像透鏡
[0281]1522圖像觀察用攝像機(C⑶等)
[0282]2401DNA反應芯片容器
[0283]2402熱傳導用薄板
[0284]2403帕耳帖組件
[0285]2404熱沉
[0286]2405電熱線
[0287]2406、2407 溫度傳感器
[0288]2408觀察窗
[0289]2409熒光偵測模塊
【權利要求】
1.一種基因分析或基因放大用裝置，包括: 反應槽，所述反應槽包括用以裝入含核酸的樣本液的I個或復數個孔； 熱沉或熱交換槽； 所述熱沉或該熱交換槽的溫度控制裝置，用于將所述熱沉或所述熱交換槽保持在第I溫度; 熱電組件，配置于所述熱沉或所述熱交換槽與所述反應槽的間，中介所述熱沉或熱交換槽與所述反應槽的間的熱移動；及 熱電組件控制裝置，通過控制所述熱電組件的動作，令所述反應槽的溫度，在所述第I溫度與第2溫度之間變化； 使得在前述熱電組件的動作為關閉時，所述反應槽的溫度成為所述第I溫度。
2.根據權利要求1的裝置，其中所述第I溫度為核酸的延長反應溫度； 所述第2溫度為(i)核酸的變性溫度，或為(ii)核酸的變性溫度或核酸的退火溫度。
3.根據權利要求1或2的裝置，其中所述溫度控制裝置包括: (i)溫度傳感器； (?)熱電線，用以加溫所述熱沉 '及 (iii)回授控制機構，根據來自所述溫度傳感器的所述熱沉的溫度信息，控制對所述熱電線的電力供給。
4.根據權利要求1或2的裝置，其中所述溫度控制裝置系通過令所述預定溫度液體，回流于保持有利用管狀流路而流體連接于所述熱交換槽的預定溫度液體的液體儲存槽與所述熱交換槽之間，來控制所述熱交換槽的溫度。
5.根據權利要求1至4中任一項的裝置，其中所述熱電組件控制裝置包括: 溫度傳感器；及 計算機，根據來自所述溫度傳感器的所述反應槽的溫度信息，來控制所述熱電組件的動作。
6.根據權利要求1至5中任一項的裝置，其中所述熱電組件為帕耳帖組件。
7.根據權利要求1至6中任一項的裝置，其中為了提高所述熱電組件與所述反應槽之間的熱移動效率，進一步包括配置于所述熱電組件與所述反應槽之間的熱傳導用薄板。
8.根據權利要求1至7中任一項的裝置，其中所述反應槽的底面及壁面系由厚度I微米至100微米，從鋁、鎳、鎂、鈦、鉬、金、銀及銅所組成的群組中選擇的金屬或硅所形成。
9.根據權利要求1至8中任一項的裝置，其中所述樣本液的量系每一孔為數十微升以下。
10.根據權利要求1至9中任一項的裝置，其中當所述樣本液中含有熒光色素時，進一步包括熒光偵測裝置，用以與所述反應槽的溫度切換連動而偵測所述孔內的所述熒光色素所發出的熒光，用以測定熒光強度的時間變化。
11.根據權利要求1至10中任一項的裝置，其中進一步包括反應槽套體，用以防止配置于所述孔的樣本液滴蒸發而密閉覆蓋，且用以防止冷凝。
12.根據權利要求11的裝置，其中所述反應槽套體進一步包括孔洞或光學窗，用于測定來自該反應槽套體內的所述樣本的光學訊號；所述光學窗備有光學上透明的發熱體。
13.根據權利要求1至9中任一項的裝置，其中于所述反應槽的所述各孔的樣本配置場所，配置有支柱，樣本液蒸發防止用的密封劑以被該柱體支撐的方式覆蓋于所述孔，通過所述柱體，防止測定中的所述樣本液附著于所述蒸發防止用的密封劑。
14.一種使用根據權利要求1至13中任一項的裝置進行PCR的方法，包含如下步驟: (a)將含核酸的樣本液配置于孔的步驟； (b)將反應槽的溫度，從作為第I溫度的核酸的延長反應溫度，切換為作為第2溫度的(i)核酸的變性溫度或(ii)核酸的變性溫度或核酸的退火溫度的步驟； (c)接著將所述反應槽的溫度，從所述第2溫度切換為所述第I溫度的步驟；以及 (d)以預定的時間間隔，將步驟(b)及步驟(C)重復預定次數的步驟； 所述反應槽的溫度從所述第2溫度向所述第I溫度的切換，系通過關閉所述熱電組件的動作來進行。
15.根據權利要求14的方法，其中于所述步驟(d)，將步驟(b)(ii)及步驟(c)重復預定次數時，以預定的時間間隔，重復交替進行如下動作: 將所述反應槽的溫度，從作為所述第I溫度的核酸的延長反應溫度，切換為所述(b)(ii)作為第2溫度的核酸的變性溫度，以及接著將所述反應槽的溫度，從所述核酸的變性溫度切換為所述第I溫度； 將所述反應槽的溫度，從作為所述第I溫度的核酸的延長反應溫度，切換為所述(b)(ii)作為第2溫度的核酸的退火溫度，以及接著將所述反應槽的溫度，從所述核酸的退火溫度切換為所述第I溫度。
【文檔編號】C12Q1/68GK104245915SQ201380018167
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月5日 優先權日:2012年3月6日
【發明者】賢二 安田, 英之 寺薗, 賢徹 金, 服部　明弘 申請人:公益財團法人神奈川科學技術研究院, 一般社團法人片上席爾羅米克斯合伙, 國立大學法人東京醫科齒科大學