從經基因改造的微生物生產黏康酸的制作方法

從經基因改造的微生物生產黏康酸的制作方法
【專利摘要】本發明處于使用生物催化劑生產可再生化學原料的領域，該生物催化劑已經經基因改造增加了其將可再生碳源轉化成有用化合物的能力。更具體而言，本發明提供利用基因修飾的生物體生產黏康酸形式的可再生碳源的方法。
【專利說明】從經基因改造的微生物生產黏康酸
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年1月30日提交的美國臨時申請系列號61/632, 777的優先 權益。 發明領域
[0003] 本發明處于使用生物催化劑生產可再生化學原料的領域，該生物催化劑已經經基 因改造增加了其將可再生碳源轉化成有用化合物的能力。更具體而言，本發明提供利用基 因改造的生物催化劑從可再生碳源生產黏康酸異構體的方法。
[0004] 發明背景
[0005] 己二酸是在尼龍66的制造中使用的大量化學品。己二酸目前是由石化產品制備， 但合成并不是環境友好的（Niu等人，2002)。備選地，己二酸可以由黏康酸的三種異構體 (順，順；順，反；反，反）中的任一者經化學氫化作用制得。通過用微生物進行發酵從可再 生資源生產黏康酸、接著氫化成己二酸將會是令人合意的，因為這樣的至己二酸的途徑將 比傳統的石化途徑更加環境友好。
[0006] 目前針對微生物生產黏康酸的努力可以分組到三個類別，即：（1)用于黏康酸 生產的芳族降解通路，其中供給多種芳族化合物，且芳族化合物的苯環部分氧化切割而 打開；（2)黏康酸鹽積累（buildup)通路，其中黏康酸骨架從多種C2、C3、C4化合物或 賴氨酸形成；和（3)芳族氨基酸生物合成黏康酸通路，其中黏康酸從3-脫氫莽草酸鹽 (3-dehydroshikimate)形成,所述3-脫氫莽草酸鹽是許多生物體中芳族氨基酸生物合成 通路中的中間體。
[0007] 許多微生物能夠利用這樣的通路來降解含有苯環的芳族化合物例如苯酚、兒茶 酚和苯甲酸，該通路切割芳環得到非芳族化合物的終末化合物或中間體化合物，例如順， 順 -黏康酸、或3-羧基-順，順-黏康酸（Niu等人，2002 ;Perez-Panto ja等人，2008)。過去， 許多小組已經嘗試開發微生物以工業水平生產順，順-黏康酸的能力（Mizuno等人，1988 ; Yoshikawa 等人，1990 ;Choi 等人，1997)。在 1980 年代末，美國的 Celgene Corporation 和 日本的Mitsubishi Chemical Industries分別積極研發從甲苯和苯甲酸制造黏康酸的方 法，這由該領域中多項已授權的美國專利和日本專利所證實。
[0008] 多種微生物已經被報道為利用甲苯、苯甲酸、苯或兒茶酚生產順，順-黏康酸。例 如，以兒茶酚作為碳源，利用表達CatA基因的重組大腸桿菌（E. coli)細胞可以以近乎 100%的摩爾轉化產率實現順，順-黏康酸生產，所述catA基因編碼作為生物催化劑負責催 化兒茶酚的鄰位切割的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)mt_2兒茶酚1，2-雙加氧酶 (Kaneko等人，2011)。利用該體系用于連續生產黏康酸的生物反應器已有過記載。
[0009] 利用環狀C6碳化合物進行順，順-黏康酸的微生物生產的此方法從未在商業上實 現；然而，在理解用于微生物中的黏康酸生產的降解通路中的酶的功能作用方面有著持續 的學術興趣。
[0010] 近來公開的國際專利申請（W0 2011/017560)要求保護具有黏康酸鹽通路的生物 催化劑和利用這些生物催化劑來生產黏康酸的方法。簡而言之，這件公開的專利申請公 布了四種不同的生產黏康酸的通路。第一種用于黏康酸生產的通路以琥珀酰-CoA和乙 酰-CoA起始。第二種用于黏康酸生產的通路以丙酮酸和丙二酸半醛起始。第三種用于黏康 酸生產的通路以丙酮酸和琥珀酸半醛起始。第四種用于黏康酸生產的通路以賴氨酸起始。 在此專利申請中提出的所有這些用于黏康酸生產的通路都是基于計算機建模，而這些生物 催化劑究竟能否產生為具備商業上可接受的黏康酸生產力和產率還有待觀察。
[0011] 利用基因改造的大腸桿菌體系的得到順，順-黏康酸的發酵途徑已經記載于科 學文獻（Niu 等人，2002)和專利文獻（US 5,616,496;US 5,487,987;TO 2011/085311 Al)中，但現有技術方法在用于大規模商業生產從而有經濟吸引力的滴度、產率和適用 性方面需要實質改進。已有兩例經基因改造以從葡萄糖生產順，順-黏康酸的釀酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)酵母菌的報道，但公開的滴度僅為I. 5mg/l和140mg/ I (Weber等人，2012 ;Curran等人，2012)。在這些滴度下，這些酵母方法對于商業生產無一 有吸引力。本發明描述了通過在用于大規模商業生產的適用性方面與領域內已知的公開方 法相比有實質改進的發酵來生產順，順-黏康酸或順，反-黏康酸的方法。
[0012] 本文公開的本發明的目的之一是利用適用于大規模商業生產的基因改造的生物 體，通過微生物發酵來生產順，順-黏康酸，該發酵起始于可再生的非芳族碳源例如糖或其 它可源自光合作用植物的簡單的碳化合物。
[0013] 在2002年，Niu等人公開了這樣的生產己二酸的"無苯"途徑，其利用發酵方法生 產順，順-黏康酸，然后是催化化學方法將順，順-黏康酸轉化成己二酸。該方法獲得專利 權，但據本發明人所知，該方法尚未商業化（US 5, 487, 987 ;US 5, 616, 496)。此公開方法的 發酵部分利用基因改造的大腸桿菌菌株，其最佳者命名為WNl/pWN2. 248。該通路利用天然 的芳族氨基酸生物合成通路（也稱為"莽草酸通路"、"莽草酸鹽通路"、"分支酸酯通路"、"共 同芳族通路"、"中心芳族通路"，或簡單地為"芳族通路"，部分示于圖1中）的一部分。在此 說明書中，在供給至生物體的碳源（如葡萄糖）下游的、和直接或間接通向分支酸的任何生 化步驟被視為莽草酸通路的一部分，包括，例如由Glf、Glk、Zwf、TktA、TalB和Pps催化的步 驟。此外，該公開的方法利用三種異源的酶，所述異源的酶經由中間體原兒茶酸和兒茶酚將 3_脫氫莽草酸鹽（芳族通路中的中間體）轉化成順，順-黏康酸。改造的宿主菌株是大腸 桿菌 K-12 的衍生物，其具有 aroE353, serA: : (aroB, aroZ)，IacZ: : (tktA, aroZ)基因型，其 中aroB編碼3-脫氫奎尼酸合酶（以下稱為AroB)，tktA編碼轉酮醇酶，且aroZ是來自肺 炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae)的編碼3-脫氫莽草酸脫水酶（以下稱為"AroZ"） 的異源的基因。該改造的菌株含有多拷貝質粒PWN2. 248,其衍生自pBR322且含有用于表 達catA、catX、aroY、aroF (反饋抗性的）、serA、IacIq和氨節青霉素抗性的基因盒。異源 的基因 catA和catX來自乙酸I丐不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus)且編碼兒茶酌? 1，2_雙加氧酶（以下稱為"CatA"）和功能未知的可能增強CatA活性的蛋白（"CatX"）。 在文獻中，catX基因也稱為"orfl"（Neidle和0rnston，1986)。在本專利說明書中，我們 要將來自不動桿菌屬（Acinetobacter)的catA加 catX基因對稱為"catAX."。異源基因 aroY來自肺炎克雷伯桿菌且編碼原兒茶酸脫羧酶（以下稱為"AroY"）。
[0014] 與上述授權專利相關的較新的專利申請已經公開（W0 2011/085311 Al)。在此 申請中，利用同樣的上述菌株WNl/pWN2. 248來生產順，順-黏康酸，其隨后被異構化成順， 反-黏康酸。
[0015] 然而，菌株WN1/PWN2. 248并不能良好地適用于大規模商業生產，因此對于更加改 進的方法有需求。本發明提供用于順，順-黏康酸的發酵生產的改進的生物催化劑。
[0016] WO 2011/085311 Al中記載的方法具有數個其它特征，這些特征使得不能實現商 業大規模實施。順，順-黏康酸的發酵生產中使用的生物催化劑WNl/pWN2. 248中所包含 的ar〇E353突變的發揮作用以阻斷碳流入莽草酸鹽通路的較下部分，從而使進入得到順， 順-黏康酸的期望通路的碳流最大化。但aroE突變是"無效"突變（使基因對于所有實際 目的都失活的突變），其具有將菌株變成芳族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和芳族 維生素或莽草酸鹽通路產生的維生素樣中間體（對羥基苯甲酸、對氨基苯甲酸和2, 3-二羥 基苯甲酸）的營養缺陷型的作用。芳族氨基酸相對昂貴，并且其需求將會對生產順，順-黏 康酸的成本增加大量負擔。因此，對于不需要向生產介質中添加這些昂貴的營養素的方法 也存在需求。
[0017] 與目前可得的用于生產順，順-黏康酸的生物催化劑相關的再一問題涉及到維持 多拷貝質粒以表達一些必需基因的需求（Niu等人，2002)。多拷貝質粒經常太不穩定而不 能用于大規模工業方法。而且，質粒上基因中的至少一個從啟動子Pta。表達，其需要異丙基 硫代半乳糖苷（IPTG)或乳糖來誘導，而這兩種化學品對于允許在經濟上有吸引力的方法 而言太過昂貴。因此，對于具有穩定整合到生產菌的染色體中的表達盒的更穩定菌株存在 需求，并且對于從組成型啟動子高水平表達從而減輕對用于啟動子的化學誘導物的需求也 存在需求。
[0018] 發明概述
[0019] 本發明提供從非芳族碳源開始生產順，順-黏康酸的基因改造的微生物。該基因 改造微生物不需要包含任何外源質粒以生產黏康酸，盡管它們具有某些實現期望的表型所 必需的外源或異源基因。引入到微生物中的外源基因穩定地整合到染色體DNA中。作為外 源基因的此染色體DNA整合的結果，使用抗生素或其它選擇性方法以維持攜帶外源DNA的 質粒的需求全部消除。此外，使用不需要化學誘導物的強啟動子來表達從碳源如葡萄糖至 順，順-黏康酸的通路所必需的基因。
[0020] 在本發明的一個實施方案中，芳族氨基酸生物合成的負調節物的活性受基因操 縱。在本發明的一個方面，負調節物TyrR的活性通過控制編碼TyrR蛋白的tyrR基因的 表達而實質降低。在本發明的另一方面，負調節物TyrR的活性通過將來自微生物的染色體 DNA的tyrR基因缺失或失活而完全消除。
[0021] 在本發明的另一實施方案中，因某些代謝物引起的芳族氨基酸通路中某些酶的反 饋抑制通過基因操縱而克服。在大多數野生型大腸桿菌菌株中，脫氧阿拉伯-庚酮糖酸 磷酸（DAHP)合酶作為已知由三種不同基因即aroG、aroF和aroH編碼的三種不同的異 構酶出現。由該三種基因中的每種編碼的蛋白受到負責芳族氨基酸生物合成的莽草酸通路 的一種或多種代謝物的反饋抑制。在本發明的一個方面，野生型aroG基因被修飾的aroG 基因取代，所述修飾的aroG基因編碼抵抗微生物細胞中芳族氨基酸通路的一種或多種代 謝物的反饋抑制的AroG蛋白。在本發明的另一方面，野生型aroF基因被這樣的aroF基因 取代，所述aroF基因編碼抵抗微生物細胞中芳族氨基酸通路的一種或多種代謝物的反饋 抑制的AroF蛋白。在本發明的另一方面，野生型aroH基因被這樣的aroH基因取代，所述 aroH基因編碼抵抗微生物細胞中芳族氨基酸通路的一種或多種代謝物的反饋抑制的AroH 蛋白。在本發明的另一實施方案中，選擇用于順，順-黏康酸的商業生產的生物催化劑可以 具有多于一種的抵抗脫氧阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸（DAHP)合酶的反饋的異構酶。
[0022] 在本發明的另一實施方案中，通過在微生物細胞中的芳族氨基酸通路參與到碳流 中的一種或多種酶的活性被增強。在本發明的一個方面，參與到芳族氨基酸通路和/或黏 康酸通路的運轉中的一種或多種酶的活性的增強通過基因操縱而實現。在本發明的優選實 施方案中，一種或多種編碼酶或蛋白 AroF、AroG、AroH、AroB、TktA、TalB、AroZ、QutC、qa_4、 asbF、QuiC、AroY、Rpe、Rpi、Pps、CatA和CatX或其同源物或類似物的基因的表達被增強， 導致增強的所述酶的活性。Rpe是核酮糖-5-磷酸差向異構酶，Rpi是核酮糖-5-磷酸異構 酶，且Pps是磷酸烯醇丙酮酸合成酶（Neidhardt和Curtiss, 1996)。如果宿主菌株是酵母 (如釀酒酵母），或絲狀真菌（如粗糙脈孢菌（Neurospora crassa))，數種催化莽草酸鹽通 路中的反應的酶可以組合成一個大蛋白或多肽，稱為Arolp，在釀酒酵母情形中由AROl基 因編碼。AroIp組合了 AroB、AroD、AroE、AroK (或AroL)和AroA的功能。這樣，出于本發 明的目的，Arolp和AROl或其部分可以作為AroB、AroD、AroE、AroK和/或AroA的替代物 使用、或者在AroB、AroD、AroE、AroK和/或AroA之外使用。
[0023] 在本發明的另一實施方案中，細菌細胞中經由赤蘚糖-4-磷酸的通量通過過表達 戊糖磷酸通路的運轉中的酶而增強。在本發明的一個方面，由talB或talA基因編碼的轉 醛醇酶的超量產生被工程化。在本發明的另一方面，編碼轉醛醇酶和轉酮醇酶的基因的表 達均通過基因操縱而增強。在本發明的另一方面，編碼核酮糖-5-磷酸差向異構酶和核酮 糖-5-磷酸異構酶之一或二者的基因的表達通過基因操縱而增強。
[0024] 在本發明的另一實施方案中，可用于芳族氨基酸通路的運作的PEP (磷酸烯醇丙 酮酸）通過基因操縱而增加。在本發明的一個方面，對PEP池的競爭通過以用于葡萄糖攝 取的PEP獨立性體系消除和/或補償用于葡萄糖攝取的PEP依賴性磷酸轉移酶體系（PTS) 而降低。在本發明的另一實施方案中，PEP的可得性通過增加編碼PEP合成酶的基因如pps 的表達而增加。 附圖簡介
[0025] 圖1.大腸桿菌中用于芳族氨基酸生物合成的通路。
[0026] 圖2.大腸桿菌中用于黏康酸生產的通路。
[0027] 圖3.顯示用于全部黏康酸和生化中間體的HPLC分析的標準物的色譜。
[0028] 圖4.顯示用于黏康酸異構體的HPLC分析的標準物的色譜。
[0029] 圖5.在用質粒pCP32AMP、pCP14和pCP54轉化的大腸桿菌菌株MYR34中生產DHS 的滴度。大腸桿菌的MYR34菌株具有aroE基因缺失。質粒pCP32AMP表達編碼DAHP合酶 的aroG基因。質粒pCP14表達編碼DHQ合酶的aroB基因。質粒pCP54表達aroB和aroG 基因-者。
[0030] 圖6.在用質粒pCP32AMP和pCP54轉化的大腸桿菌菌株MYR34和MYR170中生產 DHS的滴度。大腸桿菌的MYR34菌株具有aroE基因缺失。MYR170菌株具有aroE基因缺失 和在宿主染色體DNA的ack基因座處整合的處于P 15啟動子控制下的aroB基因的第二拷 貝。質粒PCP32AMP表達編碼DAHP合酶的aroG基因。質粒pCP54表達aroB和aroG基因 二者。
[0031] 圖7.在僅用質粒PMG37或用PMG37和PCP32AMP質粒二者轉化的大腸桿菌菌株 MYR34和MYR170中生產順，順-黏康酸的滴度。大腸桿菌MYR34菌株具有aroE基因缺失。 MYR170菌株具有aroE基因缺失和在宿主染色體DNA的ack基因座處整合的處于P15啟動 子控制下的aroB基因的第二拷貝。質粒pCP32AMP表達編碼DAHP合酶的aroG基因。質粒 PMG37表達編碼在黏康酸通路中起作用的蛋白的aroZ、aroY和catAX基因。
[0032] 圖8.在僅用表達aroG基因的質粒（pCP32AMP)或同時表達aroG和tktA基因的 質粒（PCP50)轉化的大腸桿菌MYR170菌株中生產DHS的滴度。MYR170菌株具有aroE基因 缺失和在宿主染色體DNA的ack基因座處整合的處于P 15啟動子控制下的aroB基因的第二 拷貝。
[0033] 圖9?來自用質粒pCP32AMP和pCP50轉化的大腸桿菌MYR34和MYR170菌株的DHS 產率。DHS產率計算為每克消耗的葡萄糖所產生的DHS克數。質粒pCP32AMP表達aroG基 因，而PCP50表達aroG和tktA。細菌菌株MYR34具有aroE基因缺失。大腸桿菌MYRl70菌 株衍生自MYR34且具有在染色體DNA上的ack基因座處整合的額外的aroB基因。
[0034] 圖10.來自用質粒pCP32AMP和pCP50轉化的大腸桿菌MYR170和MYR261菌株的 DHS滴度。質粒pCP32AMP表達aroG基因，而pCP50表達aroB和tktA基因。MYR170菌株具 有aroE基因缺失和在宿主染色體DNA的ack基因座處整合的處于P 15啟動子控制下的aroB 基因的第二拷貝。大腸桿菌MYR261菌株衍生自大腸桿菌MYR170菌株。大腸桿菌MYR261 菌株具有在染色體DNA的poxB基因座處整合的tktA基因的第二拷貝及其天然啟動子。
[0035] 圖11.大腸桿菌菌株MYR170、MYR261和MYR305中的黏康酸和乙酸生產，這些菌株 轉化有表達編碼莽草酸生物合成通路中的DAHP合酶的aroG的質粒pCP32AMP和表達編碼 在黏康酸通路中起作用的蛋白的ar 〇Z、ar〇Y和catAX基因的質粒pMG37。MYR170菌株具有 aroE基因缺失和在宿主染色體DNA中ack基因座處插入的處于P15啟動子控制下的aroB基 因的額外拷貝。MYR261和MYR305是MYR170菌株的衍生物。MYR261具有在宿主染色體DNA 上的PoxB基因座處整合的tktA基因的額外拷貝，而MYR305在宿主染色體DNA上的poxB 基因座處具有缺失
[0036] 圖12.由大腸桿菌菌株MYR34產生的內源性DHS向黏康酸的轉化。大腸桿菌MYR34 菌株在編碼莽草酸脫氫酶的aroE基因中具有缺失。因此，存在DHS的積累。當MYR34菌株 用表達在黏康酸通路中起作用的蛋白的編碼基因 aroZ、aroY和catAX的質粒轉化時，DHS 轉化成黏康酸。然而，當用無任何外源基因的空質粒載體（PCL1921)轉化MYR34菌株時，沒 有出現DHS轉化成黏康酸。
[0037] 圖13. aroZ同源物將DHS轉入黏康酸通路中的能力的比較。將三種不同的 aroZ同源物，即來自不動桿菌屬物種ADPl的quiC、來自蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)的asbF和來自粗糙脈孢菌的qa-4克隆到還分別自P 15和X Pk啟動子表達 catAX和aroY基因的低拷貝質粒中P26啟動子下。通過轉化使這三種不同的質粒構建體在 MYR34中表達，并測量所產生的黏康酸的量。
[0038] 圖14.將單拷貝的catAX、aroY和quiC染色體整合到大腸桿菌MYR170菌株 (AaroE，Aack ::P15-aroB)中，產生MYR352(SEQ ID No.41)。還用攜帶黏康酸通路運作所 需的所有基因的低拷貝質粒PMG37轉化MYR170,得到MYR219菌株。用YEp24(中拷貝的空 載體）或PCP32AMP (中拷貝的aroG表達質粒）或pCP50 (中拷貝aroG和tktA表達質粒） 轉化MYR352和MYR219,并使用HPLC方法對產生的PCA、兒茶酚和黏康酸的量進行定量。
[0039] 圖15.通過增加 catAX的表達來去除MYR352中的兒茶酚積累。對MYR352轉化僅 表達aroY的質粒（pMG27)或僅表達quiC的質粒（pMG39)或表達所有三種黏康酸通路基因 即catAX、aroY和quiC的質粒（pMG37)或僅表達黏康酸通路中的兩種基因即catAX和aroY 的質粒（PMG33)。僅catAX的過表達足以防止兒茶酚積累。
[0040] 圖16.利用不同體系輸入葡萄糖的菌株的生長。PtsHI和galP(MYR31)的缺失導 致在基本葡萄糖培養基中生長不足，而安置gif和glk基因（MYR217)挽回生長。對照菌株 MYR34是A ar〇E，否則則是野生型。向培養基中添加三種芳族氨基酸和三種芳族維生素以 允許營養缺陷型菌株的生長。
[0041] 圖17.大腸桿菌MYR34和MYR217菌株中的DHS生產。當用導致DHS生產的質粒 轉化時，利用glf-glk用于葡萄糖輸入的MYR217較之利用磷酸轉移酶體系（PTS)的MYR34 的轉化子產生更高滴度的DHS。
[0042] 圖18.在7升發酵罐中以大腸桿菌MYR428菌株進行的黏康酸生產。對用質粒 PCP32AMP 和 pMG37 轉化具有 A aroE A ackA: : P15-aroB A p〇xB: : tktA 基因型的大腸桿菌 MYR261菌株以產生大腸桿菌MYR428菌株。
[0043] 優選實施方式詳述
[0044] 如本專利申請中所用，短語"例如"或"如"意指對于當下主題存在多于一種的方 法、途徑、方案或物質組成，且給出的實例并不意在局限于該實例。
[0045] 術語"異源的"是指并非在生物體中天然或原生發現、但可以通過基因改造如通過 轉化、交配或轉導而引入到生物體中的基因或蛋白。異源基因可以整合（插入）到染色體 中或包含于質粒上。術語"外源的"是指出于提高、降低或消除活性的目的通過基因改造如 通過轉化、交配、轉導或突變已經引入到生物體中或在生物體中改變的基因或蛋白。外源基 因或蛋白可以是異源的，或者其可以是對于宿主生物體為原生但通過一種或多種方法例如 突變、缺失、改變啟動子、改變終止子、重復或者在染色體或質粒中插入一個或多個額外拷 貝而改變的基因或蛋白。因此，例如，如果在染色體中在與原生位點不同的位點處插入aroB 基因的第二拷貝，第二拷貝將是外源性的。
[0046] 如本發明中所用的術語"微生物"包括可通過發酵方法用于順，順-黏康酸的商業 生產的細菌、古細菌、酵母、藻類和絲狀真菌。
[0047] 對于命名法，基因或編碼區通常以斜體的小寫字母命名，例如"aroZ"，而由基因 所編碼的酶或蛋白可以以相同的字母命名但第一個字母大寫且不斜體，例如"AroZ"或 "Arolp"，后者為在酵母中使用的用于指示酶或蛋白的慣例的實例。"p"是由所指示的基 因編碼的蛋白的縮寫。酶或蛋白也可以用更加描述性的名稱指代，例如，AroZ也可以指代 3_脫氫莽草酸脫水酶。編碼具有特定催化活性的酶的實例之一的基因或編碼區可以因歷 史不同起源或因為基因來源于不同種類而具有數種不同的名稱。例如，編碼蘇云金芽孢桿 菌或炭疽桿菌（Bacillus anthracis)的3-脫氫莽草酸脫水酶的基因可命名為asbF而非 aroZ，來自構巢曲霉（Aspergillus nidulans)的相關基因可命名為qutC，來自粗糙脈胞桿 菌的相關基因可命名為qa-4,而來自貝氏不動桿菌（Acinetobacter baylyi)(也稱為乙酸 鈣不動桿菌和不動桿菌屬物種ADPl)的相關基因可命名為quiC。
[0048] "質粒"意指實質地小于染色體、與微生物的一個或多個染色體分開且獨立于一個 或多個染色體進行復制的環狀或線性DNA分子。"質粒"可以以每細胞約一拷貝或以每細胞 多于一個的拷貝存在。將質粒維持在微生物細胞中通常需要抗生素選擇，但也可使用營養 缺陷型互補。
[0049] 如本發明中所用的術語"染色體"或"染色體DNA"在細菌細胞的環境下是實質地 大于質粒且不需要任何抗生素選擇的環狀DNA分子。
[0050] "表達盒"意指這樣的DNA序列，其可以是染色體或質粒的一部分，并且其含有至少 啟動子和編碼酶或其它蛋白的基因或區域，從而使編碼區由啟動子表達，且含有該DNA序 列的宿主細胞產生該酶或蛋白。"表達盒"可以是至少部分合成的或通過基因工程方法構 建，從而使編碼區從并非與編碼區天然關聯的啟動子表達。任選地，"表達盒"可含有轉錄終 止子，其可以是或者可以不是與編碼區天然關聯的終止子。"表達盒"可以具有針對多于一 個蛋白的編碼區，在這種情況下其可稱為操縱子或合成操縱子。
[0051] 基因或編碼區的"過表達"意指致使在相同或相似的生長條件下由該基因或編碼 區編碼的酶或蛋白以高于宿主微生物野生型形式中所見水平的水平在宿主微生物中產生。 這可以通過例如一種或多種以下方法而實現：1)安置更強的啟動子，2)安置更強的核糖 體結合位點，如5' -AGGAGG的DNA序列，使其位于翻譯起始密碼子上游約四至十個堿基的 位置，3)安置終止子或更強的終止子，4)改善對編碼區中一個或多個位點處的密碼子的選 擇，5)改善mRNA穩定性，和6)提高基因的拷貝數，通過在染色體中引入多個拷貝或是在多 拷貝質粒上放置盒。由過表達的基因產生的酶或蛋白被稱為"超量產生的"。"過表達的"基 因或"超量產生的"蛋白可以是對于宿主微生物原生的基因或蛋白，或者其可以是已通過基 因工程方法從不同的生物體移植到宿主微生物中的基因或蛋白，在這種情況下酶或蛋白以 及編碼該酶或蛋白的基因或編碼區被稱為"外來的"或"異源的"。外來的或異源的基因和 蛋白按定義是過表達和超量產生的，因為它們在未經改造的宿主生物體中不存在。
[0052] 第一基因、DNA序列或蛋白的"同源物"是執行與所述第一基因、DNA序列或蛋 白相似的生物學功能，且經用于序列比較的BLAST計算機程序所測定（Altschul等人， 1990 ;Altschul等人，1997)與所述第一基因或蛋白具有至少25%的序列同一性（當比 較蛋白序列或比較從基因序列得到的蛋白序列時），并允許缺失和插入的第二基因 、DNA 序列或蛋白。大腸桿菌aroG基因的同源物實例會是來自鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)的 aroG 基因。
[0053] 第一基因、DNA序列或蛋白的"類似物"是執行與所述第一基因、DNA序列或蛋白 相似的生物學功能，且經用于序列比較的BLAST計算機程序所測定（Altschul等人，1990 ; Altschul等人，1997)與所述第一基因、DNA序列或蛋白具有少于25%的序列同一性（當比 較蛋白序列或比較從基因序列得到的蛋白序列時），并允許缺失和插入的第二基因、DNA序 列或蛋白。肺炎克雷伯桿菌AroZ蛋白的類似物的實例會是來自構巢曲霉的QutC蛋白，因 為兩種蛋白都是催化3-脫氫莽草酸脫水酶反應的酶，但在兩種酶或其各自的基因之間沒 有顯著的序列同源性。本領域中有見解的科學家將會知曉，在許多不同的生物體中可以找 到許多具有特定生物學功能的酶和蛋白，如DAHP合酶或3-脫氫莽草酸脫水酶，它們或是作 為同源物或是作為類似物，并且因為這些酶或蛋白家族的成員共有相同的功能，故盡管它 們可能在結構上稍有不同或實質不同，但在許多情況下，使用現有的基因改造方法，相同家 族的不同成員可以用于執行相同的生物學功能。因此，例如，AroZ酶和QutC酶催化相同的 反應，DHS脫水酶，這樣任一者在合適的環境下都會導致順，順-黏康酸產生，并且選哪一個 來使用最終可通過選擇在相似的發酵條件下產生更高滴度的順，順-黏康酸的一個來作出 選擇。
[0054] "非芳族碳源"或"非芳族化合物"是可作為碳源和/或能量用于供養本發明的微 生物的含碳化合物，其中該化合物不含有與苯相關的六元環。非芳族碳源的實例包括葡萄 糖、木糖、乳糖、甘油、醋酸、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖或蔗糖。"芳族化合物"是含有 一個或多個與苯相關的六元環的化合物。芳族化合物的實例是兒茶酚或1，2-二羥基苯。
[0055] "強組成型啟動子"是這樣的DNA序列，其通常位于由RNA聚合酶轉錄的DNA序列 或基因的上游（當以習慣的5'至3'方向描述時在基因的5'側），并且其導致所述DNA序 列或基因通過RNA聚合酶轉錄以容易經由任何適當的測定法步驟直接或間接檢測到的水 平表達。適當的測定法步驟的實例包括1)定量逆轉錄酶+PCR，2)對于所編碼酶的酶測定 法，3)考馬斯藍染色的蛋白凝膠，或4)可測量的作為所述轉錄的結果間接產生的代謝物的 產生，且這樣的可測量的轉錄的發生不論特定調節轉錄水平的蛋白、代謝物或誘導物化學 品存在與否。不是"強組成型啟動子"的啟動子的實例是大腸桿菌的P la。啟動子，因為其在 沒有乳糖或誘導物IPTG的情況下受阻遏物的阻遏。通過使用領域內熟知的方法，可以使用 "強組成型啟動子"取代原生的啟動子（否則天然存在于DNA序列或基因上游的啟動子）， 得到如下的表達盒，所述表達盒可以置于質粒中或染色體中，且以高于原生啟動子水平的 水平提供期望DNA序列或基因的表達水平。強組成型啟動子可以是種或屬特異性的，但來 自細菌的強組成型啟動子常常可以在遠緣相關的細菌中良好發揮功能。例如，來自枯草芽 孢桿菌（Bacillus subtilis)或來自通常在枯草芽孢桿菌上生長的噬菌體的啟動子可以在 大腸桿菌中良好發揮功能。"強組成型啟動子"與誘導型啟動子如P ta。實質地不相同，誘導 型啟動子已在現有技術中用于生產順，順-黏康酸且對于期望的功能水平通常需要昂貴的 化學品或其它環境變化（Niu等人，2002)。強組成型啟動子的實例是來自枯草芽孢桿菌噬 菌體SPOl的P 15、P26，和大腸桿菌噬菌體入PK(SEQ ID No. 1、2和3)。
[0056] "黏康酸通路"是指從DHS到PCA到兒茶酚到順，順-黏康酸的生化通路，且"黏康 酸通路基因"是這樣的基因，其編碼催化黏康酸通路中的步驟的酶，或編碼用來增強所述酶 例如ar 〇Z、ar〇Y、CatA、catX和qutC中之一者的活性的輔助功能。DHS是3-脫氫莽草酸鹽 的縮寫，且PCA是原兒茶酸的縮寫。"黏康酸質粒"是含有一種或多種黏康酸通路基因的質 粒。
[0057] 本發明中所用的一些基因操縱的中心圍繞著如圖1所示的存在于細菌細胞中的 芳族氨基酸生物合成共同通路。圖1所示的從DAHP合酶到分支酸合酶的芳族氨基酸生物 合成共同通路也稱為"莽草酸通路"。
[0058] 關于微生物基因改造以生產芳族氨基酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有著大量的 已公開工作（US 4,681，852、US 4,753,883、US 6, 180, 373、歐洲專利申請 86300748.0)。方 法包括利用反饋抗性酶（41'<^、41'〇6、？1164、17^)、轉錄阻遏(^7冰）的去調控、增加啟動子 強度（P tac;、Pla。）和增加一個或多個基因（tktA)的拷貝數的多種組合。然而，上述方法的許 多具體組合并未嘗試過，或是因為存在太多的組合而難以無過度實驗地進行嘗試，或是因 為不能洞察哪一種將是最佳組合。更重要的是，這些基因操縱組合的任一種在開發用于使 用可再生的非芳族碳源來商業生產黏康酸的生物催化劑中的適用性尚不知曉。
[0059] 對于許多微生物特別是大腸桿菌，芳族氨基酸生物合成通路是熟知的（Neidhardt 和Curtiss，1996)。在野生型細胞中，該通路受反饋抑制和轉錄阻遏的緊密調控。第一個關 鍵步驟由脫氧-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸（DAHP)合酶催化，對其而言存在由ar 〇F、ar〇G和 aroH編碼的三種同工酶。三種同工酶AroF、AroG和AroH分別受芳族氨基生物合成通路的 產物即酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反饋抑制。對所有三者具有反饋抗性的突變體是已知 的（Draths 等人，1992 ;Lutke_Eversloh 和 Stephanopoulos, 2007 ;Hu 等人，2003 ;Shumilin 等人，1999)。本發明的一個方面涉及利用aroF、aroG和aroH基因的反饋抗性等位基因以 表達抵抗芳族氨基酸生物合成通路的產物的反饋抑制的AroF、AroG和AroH酶蛋白。芳族 通路中涉及的數種操縱子的轉錄受tyrR基因所編碼的阻遏物或trpR基因所編碼的阻遏物 或二者的調控（Neidhardt等人，1996)。特別重要的是當TyrR蛋白與一種或多種芳族氨基 酸結合時其對aroG和aroF轉錄的負調節。本發明的一個方面涉及通過從宿主細菌菌株的 染色體中消除tyrR或trpR基因而去除這些基因的負調節。
[0060] 本發明的主題是創造具有新的基因改造元件的基因改造盒的新組合，以提高用于 大規模商業生產順，順-黏康酸產生菌株的發酵參數和適用性。特別地，生產順，順-黏康 酸的現有技術并未教導遺傳元件的某些組合，例如但不限于，超量產生的反饋抗性的AroG、 超量產生的反饋抗性的AroF、過表達的tktA、過表達的talA、染色體上整合的用于從強組 成型啟動子表達aroZ、aroY和catAX(或其類似物或同源物）的表達盒，以及滲漏aroE等 位基因（我們將其定義為編碼AroE酶的基因，該AroE酶對于芳族氨基酸和維生素的原養 型，但不導致芳族化合物的顯著分泌）的多種組合。
[0061] 本文公開的菌株構建體的所有具體實例衍生自野生型大腸桿菌C菌株 (ATCC8739)或大腸桿菌K-12菌株（YMC9或MM294)，但本文公開的遺傳元件可以組裝到任 何其它合適的大腸桿菌菌株中，且本文公開的表達盒或遺傳元件的適當類似物和同源物可 以組裝到任何其它的合適微生物中，如可通過發酵方法用于商業生產順，順-黏康酸的其 它種類的細菌、古生菌、酵母、藻類和絲狀真菌。
[0062] 在大腸桿菌中，自葡萄糖的芳族氨基酸生物合成通路起始于戊糖磷酸通路（PPP) 的非氧化分支。非氧化戊糖磷酸通路中的四種關鍵酶是轉酮醇酶、轉醛醇酶、核酮糖-5-磷 酸差向異構酶和核酮糖-5-磷酸異構酶。這些酶催化導致從己糖或戊糖糖類形成赤蘚 糖-4-磷酸（E4P)的反應。為提高大腸桿菌中E4P的可得性，可以過表達編碼轉酮醇酶的 tktA基因（Niu等人，2002)。類似地，還預期過表達轉醛醇酶基因在一些情況中提高E4P的 可得性（Bongaerts等人，2001)。在本發明的另一方面，通過導致轉酮醇酶和轉醒醇酶的酶 活性增加的基因操縱來增強轉酮醇酶和轉醛醇酶基因的表達。在本發明的另一方面，通過 超量產生核酮糖-5-磷酸差向異構酶和核酮糖-5-磷酸異構酶來提高經由PPP的非氧化分 支的通量。
[0063] 共同芳族氨基酸通路中的第一關鍵步驟和最緊密調節的反應是經DAHP合酶（由 aroG、aroF和aroH編碼）的磷酸烯醇丙酮酸（PEP)和E4P的縮合以產生脫氧阿拉伯-庚 酮糖酸7-磷酸（DAHP)。大腸桿菌消耗的D-葡萄糖部分通過PPP且部分通過糖酵解被帶入 芳族生物合成。當通過用提高拷貝數而使表達增強的質粒轉化來擴增轉酮醇酶（tktA)和 DAHP合酶（aroG)的同工酶時，進入芳族通路的葡萄糖流大大提高（Niu等人，2002)。在本 發明的優選方面，出于擴大轉酮醇酶和DAHP合酶的酶活性的目的，將外源aroG和tktA基 因整合到染色體DNA中。
[0064] 在本發明的另一實施方案中，通過增加 DAHP合成可用的PEP來提高微生物細胞中 經由PEP的通量。許多菌屬細胞在利用磷酸轉移酶體系（PTS)的跨細胞膜葡萄糖轉運中消 耗I3EP,其中對于每分子跨細菌外膜轉運的葡萄糖消耗一個PEP分子。通過用非PEP依賴性 的（PEP獨立的）葡萄糖攝取機制取代或補償PEP依賴性的PTS，可以增加微生物細胞內芳 族氨基酸生物合成通路可用的PEP池的大小。例如，用于糖攝取的PTS體系可以由基于GalP 的糖攝取體系或基于Glf/Glk蛋白的糖轉運體體系進行取代或補償（Chandran等人，2003 ; Yi等人，2003)。在本發明的優選方面，除了出于保存微生物細胞內的PEP池的目的將用于 糖攝取的PTS體系缺失外，還出于保存微生物細胞內的ATP的目的將基于GalP的糖攝取體 系失活。在PTS體系和基于Gal-P的糖攝取體系（APTS/AgalP)的運作都有缺陷的微生 物細胞中，可通過引入編碼Glf?的外源基因，或編碼Glf (葡萄糖易化擴散蛋白）和Glk (葡 糖激酶）蛋白二者的外源基因來實現糖攝取。如本發明所用，術語功能性的葡萄糖易化擴 散蛋白是指任何Glf蛋白以及在功能上等同于Glf且作用于通過易化擴散將糖轉運到微生 物細胞中的任何其它蛋白。在本發明的一個方面，將編碼葡萄糖易化蛋白Glf的基因引入 A PTS/ A galP微生物細胞中，且轉運到微生物細胞中的葡萄糖通過內源葡萄糖激酶而磷酸 化。在本發明的另一方面，將編碼Glf和Glk蛋白二者的基因引入到A PTS/AgalP微生物 細胞中。在本發明的優選方面，引入到微生物細胞中的外源gif和glk基因被整合到宿主 染色體DNA中。
[0065] 在本發明的另一實施方案中，當生長用的碳源和能量需要糖異生（例如如果碳源 是醋酸鹽或琥珀酸鹽）時，可通過提高細胞內已存在的羧化酶（例如PEP羧化激酶，其由大 腸桿菌中的Pck編碼）的活性或通過引入外源的羧化酶而增加 PEP池。在優選的實施方案 中，引入的編碼羧化酶的外源基因穩定整合到宿主染色體中。編碼羧化酶的基因可以源自 多種多樣的微生物種類。編碼羧化酶的基因還可經歷基因操縱，從而使得用于順，順-黏康 酸生產的生物催化劑內的羧化酶表達顯著增加。
[0066] 在本發明的另一實施方案中，通過降低或消除利用PEP作為底物的丙酮酸激酶如 PykA和PykF的活性而增加微生物細胞內的PEP池。
[0067] 從DAHP，芳族氨基酸通路經由多個中間體至分支酸（CHA)，其是三種芳族氨基酸 即L-酪氨酸（L-Tyr)、L-苯丙氨酸（L-Phe)和L-色氨酸（L-Trp)的生物合成的分支點。
[0068] 在共同芳族氨基酸通路的初始階段，3-脫氫奎尼酸（DHQ)合酶（AroB)從DAHP移 除磷酸基，導致DHQ的形成。酶DHQ脫水酶（AroD)從DHQ中移除水分子，導致3-脫氫莽草 酸鹽（DHS)的形成，其隨后被莽草酸脫氫酶（AroE)還原成莽草酸鹽（SHK)。莽草酸激酶1/ II (AroK，AroL)將莽草酸鹽磷酸化成莽草酸3-磷酸（S3P)。S3P與PEP進行縮合，導致5烯 醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP)的形成。EPSP的形成由EPSP合酶（AroA)介導。EPSP 的磷酸基由分支酸合酶（AroC)移除，導致分支酸（CHA)的形成。
[0069] 如圖2中所示，芳族氨基酸通路可以因 aroE基因突變在3-脫氫莽草酸鹽（DHS)轉 化成莽草酸鹽（SHK)的水平被阻斷，導致DHS的積累（Niu等人，2002)。引入外源aroZ基因 起到將DHS轉化成原兒茶酸（PCA)的作用。PCA隨后通過由AroY酶介導的脫羧反應轉化成 兒茶酚。兒茶酚通過catA基因產物的作用最終轉化成順-順黏康酸（ccMuA)。ccMuA可以 受馬來酰乙酰乙酸異構酶的作用而產生反-反黏康酸（ttMuA)。從DHS到ccMuA和ttMuA 的生物合成通路被稱為黏康酸通路。負責將DHS轉化成ccMuA的三種不同基因可以從多種 微生物種類獲得并引入到選擇用于黏康酸生產的微生物如大腸桿菌中。在本發明的優選實 施方案中，編碼黏康酸通路所涉及蛋白的外源基因被整合到宿主染色體DNA中。
[0070] 在將芳族氨基酸通路重定向到順，順-黏康酸生產的過程中，aroE基因突變是關 鍵性的。aroE基因可以完全失活，導致芳族氨基酸生物合成的完全阻斷，如使用描述用于黏 康酸生產的大腸桿菌WNl/pWN2. 248菌株所進行的（Niu等人，2002)。采用WNl/pWN2. 248 大腸桿菌菌株和相關菌株的重大缺點在于，由于aroE基因完全失活，該菌株成為上述的芳 族酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以及芳族維生素或維生素類化合物的營養缺陷型。結果， 在其生長以生產順，順-黏康酸的過程中，該菌株需要外源添加這六種化合物（或共同中 間體，如莽草酸鹽），由此使得利用該菌株進行的順，順-黏康酸商業生產的成本實質增加。 克服對芳族氨基酸的外部來源的這種依賴性的新方法是使用具有aroE滲漏突變的菌株。 滲漏aroE突變體將允許有限的碳流向莽草酸，同時積累顯著量的DHS，其隨后可用于經由 AroZ酶的作用轉化成PCA。由此，使用aroE的滲漏突變體形式將消除對外源芳族氨基酸的 依賴性，同時仍然將碳流轉向順，順-黏康酸。
[0071] 用于合成DHS轉化成順，順-黏康酸所必需的AroZ、AroY和CatA蛋白的編碼基因 可以源自許多微生物種類。在一個實施方案中，這些外源基因整合到正在開發的生物催化 劑的宿主染色體中。在優選的實施方案中，這些外源基因在生物催化劑內的表達由組成型 啟動子驅動而不需要任何誘導物。
[0072] 中間體原兒茶酸的生物合成需要3-脫氫莽草酸脫水酶（AroZ ;EC4. 2. 1. 118)這種 酶。在本說明書中，"AroZ"應指任何催化3-脫氫莽草酸脫水酶反應的酶。在現有技術中，該 酶從肺炎克雷伯桿菌菌株A170-40 (ATCC25597)的aroZ基因表達（Niu等人，2002 ;Draths 和Frost, 1995)。然而，AroZ的比活在生物體之間廣泛變化，從0. 1至261微摩爾/min/ mg (Wheeler等人，1996 ;Fox等人，2008 ;Pf Ieger等人，2008)，因此，通過從比肺炎克雷伯桿 菌具有更高的比活的生物體，例如貝氏不動桿菌、構巢曲霉（Wheeler等人，1996)(現在也 稱為構巢裸胞殼（Emericella nidulans))、或粗糙脈孢菌（Rutledge, 1984 ;Stroman等人， 1978)、或鵝柄抱殼菌（Podospora anserina，也稱為 Podospora pauciseta) (Hansen 等人， 2009)表達 aroZ 基因，其也稱為 asbF (Fox 等人，2008 ;Pf Ieger 等人，2008)、qutC (Wheeler 等人，1996)、qa_4 (Rutledge, 1984)和quiC，可以具有顯著的改進。
[0073] 作為一個特別的實例，來自粗糙脈孢菌的編碼3-脫氫莽草酸脫水酶的qa-4基因 的編碼序列可以通過數種已知方法中的任一者獲得，例如全基因 DNA合成、cDNA克隆或通 過基因組DNA克隆與PCR或合成DNA接頭合成的組合。由于qa-4基因中沒有內含子，可以 通過PCR從基因組DNA獲得編碼區（Rutledge, 1984)。qa-4酶的蛋白序列（SEQ ID No. 4) 和原生基因的DNA序列（SEQ ID No. 5)是已知的。
[0074] 備選地，可以從構巢曲霉針對3-脫氫莽草酸脫水酶構建表達盒。來自構巢曲霉 的QutC酶的編碼序列可以通過數種已知方法中的任一者獲得，例如全基因 DNA合成、cDNA 克隆或通過基因組DNA克隆與PCR或合成DNA接頭合成的組合。QutC的蛋白序列（SEQ ID No.6)和不含內含子的原生基因的DNA序列是已知的（SEQ ID No.7;GenBank檢索號 M77665. 1)。表達盒可以通過DNA合成，或通過基因組克隆與PCR的組合得到，從而使QutC 酶能在大腸桿菌中準確產生。通過在大腸桿菌中從強組成型啟動子表達QutC的編碼序列， 可以從整合到染色體中的一個或兩個拷貝的基因獲得充分表達，省去了可能導致不穩定性 的并且如現有技術中所公開的在多拷貝質粒上維持多于兩個拷貝的表達盒的需求（Niu等 人，2002)。上述方法通常可以用于獲得編碼期望的酶的DNA序列，并且該編碼序列隨后可 用于構建設計為在大腸桿菌中或另一合適的微生物宿主生物體中發揮功能的表達盒。
[0075] AroZ的比活也可以通過利用現有技術的蛋白序列（Niu等人，2002)但構建改進的 表達盒來加以改進，例如，其中在編碼區之前已安置更強的啟動子和/或核糖體結合位點 (RBS)，如實施例4中所描述的。
[0076] 來自肺炎克雷伯桿菌菌株A170-40的編碼AroZ(3_脫氫莽草酸脫水酶）的aroZ 基因可以按現有技術中所描述的來獲得。該基因的DNA序列和周圍的DNA可以通過領域 內熟知的方法確定。可利用原生的DNA序列將本發明的異源基因例如aroZ建立到表達盒 中，或者其可用針對預定宿主生物體密碼子優化的序列合成。可以按記載的（Draths和 Frost，1995)從任何其它含有活性aroZ基因的微生物克隆aroZ基因，其中所述微生物例如 肺炎克雷伯桿菌菌株342、不動桿菌屬物種ADPl (貝氏不動桿菌ADPl)、蘇云金芽孢桿菌、構 巢裸胞殼、解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora)、惡臭假單胞菌W619和許多其它菌。
[0077] 中間體兒茶酚的生物合成需要原兒茶酸脫羧酶（AroY ;EC4. I. 1. 63)這種酶。在本 說明書中，"AroY"應指任何催化原兒茶酸脫羧酶反應的酶。在現有技術中，該酶從在多拷 貝質粒上的肺炎克雷伯桿菌菌株A170-40 (ATCC25597)的aroY基因表達（Niu等人，2002)。 然而，再一次地，可以通過從整合到宿主生物體的染色體中的一個或兩個拷貝的表達盒產 生充足的酶來獲得方法改進。這可以通過從以下的生物體獲得aroY基因來實現，所述生物 體天然產生較之現有技術的肺炎克雷伯桿菌AroY酶具有更高比活的AroY酶,或通過提高 肺炎克雷伯桿菌AroY的表達水平而實現，所述提高表達水平是通過構建例如利用強組成 型啟動子和/或強RBS的表達盒而進行，如以上對實施例4描述的。來自肺炎克雷伯桿菌 菌株A170-40的AroY的蛋白序列在SEQ ID No. 8中給出。對應的基因 aroY可以如上所述 進行克隆（Draths和Frost, 1995)，或者基于蛋白序列，其可以用針對預定宿主生物體優化 的密碼子合成。
[0078] aroY基因可以從含有同源物或類似物的任何其它微生物獲得，例如肺炎克雷伯桿 菌菌株 NCTC418 (ATCC15380)、肺炎克雷伯桿菌 342 和 Arxula adeninivorans (Sietmann 等 人，2010)。來自肺炎克雷伯桿菌342的aroY基因的DNA序列和周圍的DNA在SEQ ID No. 9 中給出。
[0079] 順，順-黏康酸生物合成的最后步驟需要兒茶酚1，2-雙加氧酶（CatA ; ECL 13. 11. 1)這種酶。在本說明書中，"CatA"應指任何催化兒茶酚1，2-雙加氧酶反應 的酶。在現有技術中，該酶從多拷貝質粒上的乙酸鈣不動桿菌菌株ADPl的catA基因表達 (Niu等人，2002)。來源菌株，乙酸鈣不動桿菌菌株ADPl顯然已重命名為不動桿菌屬物種 ADPl 和貝氏不動桿菌 ADPl (Neidle 和 Ornston, 1986 ;Barbe 等人，2004 ;de Berardinis 等人，2008)。在該現有技術實例中，catA基因從Pta。啟動子表達，該啟動子需要乳糖或 IPTG(異丙基硫代半乳糖苷）作為誘導物。這些化合物對于用于商業發酵而言太過昂貴，因 此再一次地，需要通過將表達盒整合到染色體中對方法進行顯著改進，既為了消除對昂貴 誘導物的需求，也為了產生更穩定的菌株。這可以通過構建利用強組成型啟動子、強RBSjP /或更穩定的mRNA的catA基因的表達盒而實現，如以上其他實施例中所述。
[0080] 來自貝氏不動桿菌ADPl的catA基因的DNA序列和周圍序列在SEQ ID No. 10中給 出。來自相同菌株的CatA的蛋白序列在SEQ ID No. 11中給出。在優選的實施方案中，catA 的表達盒含有一個或兩個額外的天然存在于catA下游的開放閱讀框，以提高catA基因的 表達水平（Schirmer和Hillen，1998)。許多其它生物體可以是catA基因的來源，例如小田 假單胞菌（Pseudomonas arvi 11a)、突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens) (Nakazawa 等人，1967 ;Kojima 等人，1967)、鏈霉菌屬物種菌株 2065 (Streptomyces Sp. Strain2065) (Iwagami 等人，2000)、鉤蟲貪銅菌 335T (Cupriavidus necator335T)和許多其它菌 (Perez-Panto ja 等人，2008)。
[0081] 為了提高朝向順，順-黏康酸的碳流，除了通過利用滲漏aroE突變體減小從DHS 到莽草酸鹽（SHK)的碳流，還有必要阻斷從芳族氨基酸通路分支出的某些其它通路。一 些細菌，例如不動桿菌屬和假單胞桿菌屬中的一些細菌，含有名為PobA的基因，其編碼 將DHS轉化成沒食子酸的對羥基苯甲酸水解酶這種酶。盡管大腸桿菌中未曾發現PobA 同源物或類似物，但經改造以生產DHS的大腸桿菌菌株分泌可測量量的沒食子酸（Li和 Frost, 1999)，因此有可能這種酶確實存在于大腸桿菌中。此外，源自DHS的PCA可以通過 由pobA基因所編碼的對羥基苯甲酸水解酶（PobA)酶的作用轉化成沒食子酸。由此產生的 沒食子酸可以在隨后被轉化成焦性沒食子酸。阻斷所選的生物催化劑中通向沒食子酸和焦 性沒食子酸的碳流以提高順，順-黏康酸的一種方式是通過基因操縱而阻斷或減小對羥基 苯甲酸水解酶（PobA)蛋白的活性。相似地，DHS的前體--DHQ也可以受aroE所編碼的莽 草酸脫氫酶的作用，導致奎寧酸的產生。在本發明的實施方案中，對滲漏AroE突變體酶額 外選擇或篩選其在將DHQ轉化成奎寧酸方面的失能或降低的能力。
[0082] 生產反，反-黏康酸代替順，順-黏康酸有數個優點。在使用乙烯用于生產對苯二 甲酸的狄爾斯-阿爾德反應（Diels Alder reaction)中對反，反-黏康酸的偏好高于順， 順-黏康酸。具有經基因操縱的芳族通路的生物催化劑產生順，順-黏康酸，所述順，順-黏 康酸可以在細胞外利用化學轉化方法轉化成反，反-黏康酸。另一方面，通過將馬來酰乙酰 乙酸異構酶或相似的異構酶引入到生物催化劑中，可以在細菌生物催化劑中將順，順-黏 康酸轉化成反，反-黏康酸。
[0083] 本專利申請的說明書提供了與構建足以生產黏康酸的微生物菌株相關的本發明 的數個不同方面。本領域技術人員能夠匯編本發明的數個不同方面以構建具有極高效率的 用于生產黏康酸的生物催化劑。
[0084] 實驗部分
[0085] 總論
[0086] 菌株和接種體制備：本發明中所用的細菌菌株和質粒的清單提供于表1中。本文 公開的菌株構建體的所有具體實例衍生自野生型大腸桿菌C菌株（ATCC8739)或大腸桿菌 K-12菌株（YMC9或MM294)，但本文公開的遺傳元件可以組裝到任何其它合適的大腸桿菌菌 株中，且本文公開的表達盒或遺傳元件的適當類似物和同源物可以組裝到任何其它的合適 微生物中，如可通過發酵方法用于商業生產順，順-黏康酸的其它種類的細菌、古生菌、酵 母、藻類和絲狀真菌。
[0087] 大腸桿菌C能在AMl礦物培養基中發酵10 %葡萄糖。AMl培養基含有2. 63g/ L(NH4)2HP04、0. 87g/L NH4H2P04、1. 5mM MgS04、l. OmM甜菜堿、和 I. 5ml/L痕量元素。痕量元素 制備成 1000X 儲液并且含有以下組分：1. 6g/L FeCl3、0. 2g/L CoCl2 ? 6H20、0. lg/L CuCl2、 0? 2g/LZnCl2 WH2CKO. 2g/L NaMo04、0. 05g/L H3B03、和 0? 33g/L MnCl2 .4H20。用 I. 0 ?10. OM KOH或I. 0?9. OM氫氧化銨使發酵液的pH維持在7. 0。
[0088] 發酵：通過從經基因改造的并存儲于_80°C冰箱中的大腸桿菌菌株的40%甘油儲 液在新鮮的NBS-2%葡萄糖（Jantama等人，2008a)平板上劃線接種而開始發酵。通過在瓊 脂板和液體培養基中包含合適的（一種或多種）抗生素而保留質粒（如果存在的話）。氨 芐青霉素（鈉鹽）以150mg/L使用，壯觀霉素 HCL以100mg/L使用，四環素 HCl以15mg/l 使用，且硫酸卡那霉素以50mg/l使用。在24至48小時（37°C)后，將單克隆挑選到搖瓶中 25ml的相同培養基中。在于37°C 200rpm震蕩直至細胞生長至約I. 0的OD6tltl后，在冰上冷 卻培養物并添加等體積的無菌80%甘油。然后將2ml的等分物在-80°C凍存以用作發酵用 的接種物。
[0089] 細胞生長：通過使用Thermo Electronic Spectronic20分光光度計測量 550nm(0D55CI)或600nm(0D_)下的光密度來估算細胞質量。
[0090] 對莽草酸通路和黏康酸通路中的中間體的分析：利用購自Sigma-Aldrich的標準 物，通過HPLC和Waters Alliance儀器并監測2IOnm下的吸光度或45°C下的折射率來測 定發酵液中所產生的全部黏康酸（包括順，順-黏康酸和順，反-黏康酸以及其它生化中 間體）。柱子是BioRad Aminex HPX-87H，以8mM硫酸作為流動相在0. 6ml/min的流速下在 50°C運行40分鐘。購買的標準物（Sigma-Aldrich)的色譜圖示于圖3。為準備用于HPLC， 將發酵樣品在〇. 05M磷酸鉀緩沖液（pH7. 0)中稀釋10或100倍，以防止順，順-形式的黏 康酸異構化為順，反-形式。
[0091] 為分離黏康酸的異構體，將如上制備的樣品在第二HPLC體系中運行。儀器是 Agilentl200HPLC，柱子是Agilent Eclipse XDB-C18, 4. 6x150mm，以用憐酸調節至pH3. 0 的 50mM KH2PO4于30%甲醇中的流動相在30攝氏度運行。流速為lml/min，持續4分鐘，進行 278nm下的吸光度檢測。通過將順，順-黏康酸溶解于水中并允許其在室溫下經歷約2小時 的自發的酸催化的異構化來產生順，反-黏康酸標準物，直至HPLC峰已經完全移動至新位 置。其它標準物購自Sigma-Aldrich。顯示標準物的色譜圖示于圖4中。
[0092] 用于發酵方法的黏康酸生產培養基的組成：每升的發酵培養基含有50ml/L的IM 腿2卩04、10!111的20(^/1檸檬酸+258/1檸檬酸鐵、1.21111的98%硫酸和一滴411衍作 &111204。將 這些組分與足量的水混合以允許有添加以下其它組分的空間。在高壓滅菌后，添加以下組 分：10、20、30或40ml的50%葡萄糖（以得到5、10、15或20g/l終濃度）、2ml的IM MgS04、 Iml 的 0? IM CaCl2UOml 的 1000X 痕量元素 （Jantama 等人，2008a)、1、2、4 或 8ml 的 50g/L 苯丙氨酸+50g/L酪氨酸+50g/L色氨酸（以得到0.5、0. 1、0.2或0.4g/l終濃度）、10ml的 lg/L對輕基苯甲酸+lg/1對氨基苯甲酸+lg/L2, 3-二輕基苯甲酸和必要時的Iml的150mg/ ml氨芐青霉素（鈉鹽）和/或Iml的lOOmg/ml壯觀霉素 HC1。
[0093] 對于補料分批發酵，給料瓶含有600g/L的無水葡萄糖和32ml/L的50g/L苯丙氨 酸+50g/L酪氨酸+50g/L色氨酸。9M NH4OH用作堿以維持發酵培養基的pH。
[0094] 對于搖瓶，用NBS鹽（Jantama等人2008a)加0. 2M MOPS緩沖液（pH7. 4)替代如 上所述的高壓滅菌前的混合物，但葡萄糖和其它添加物相同。
[0095] 補料分批發酵在7L New Brunswick Scientific發酵罐中進行，pH、DO、溫度、葡萄 糖和進料速度通過D⑶控制器或Biocommand軟件來加以控制。溫度維持在37°C，pH通過 9N氨水維持在7.0,溶解氧（DO)維持在30%空氣飽和同時將葉輪速度從750rpm升高至 1200rpm。期望的培養基中的初始葡萄糖濃度為約5至25g/L。當葡萄糖濃度降至低于5g/ L時，將葡萄糖溶液添加至發酵罐中，并通過溶解氧水平來控制葡萄糖的進料速度。總發酵 時間為48小時，最終滴度為16g/L的黏康酸。
[0096] 表達黏康酸通路基因的質粒的構建：將DHS轉化成黏康酸所需的三種異源基因單 獨或組合克隆到低拷貝質粒PCL1921中（Lerner和Inouye, 1990)。pCL1921的DNA序列 在表3SEQ ID No. 20中給出。簡言之，catAX、aroY和aroZ類似物或同源物的編碼序列經 密碼子優化用于在大腸桿菌中表達并商業合成（GeneArt, Invitrogen)。然后利用攜帶獨 特的核糖體結合位點的正向引物和攜帶各基因獨特的終止子序列的反向引物將這些序列 經PCR擴增。將所得的PCR片段經限制性酶消化并通過標準分子克隆方法克隆到獨特的 組成型啟動子序列的下游。通過從之前描述過的來源DNA序列進行PCR擴增（美國專利申 請20090191610 ;美國專利7244593)，之后是限制性消化和標準分子克隆，來克隆啟動子序 列。啟動子-RBS-編碼序列-終止子序列在一起組成表達盒。接著將單獨的表達盒組合以 產生表達一個、兩個或所有三個黏康酸通路基因的質粒。
[0097] 實施例1
[0098] 增加 aroG和aroF的表達
[0099] 大腸桿菌的tyrR基因可通過數種熟知方法中的任一種來突變，例如化學或輻射 誘變和篩選（例如通過PCR和DNA測序）或選擇類似物抗性（例如，對4-氟酪氨酸的抗性）、 轉座子誘變、細菌噬菌體Mu誘變或轉化。在優選的實施方案中，tyrR基因中的突變是無效 突變（導致沒有可檢測的活性的突變），而在更優選的實施方案中，至少部分tyrR基因缺 失。這可以通過例如利用使用線性DNA分子的兩步轉化法（Jantama等人，2008a ;Jantama 等人，2008b)來實現。在第一步中，通過雙重組和選擇氯霉素抗性將camK、sacB盒在tyrR 基因座處整合以取代大部分的或所有的tyrR開放閱讀框。在第二步中，通過雙重組、在豐 富營養基如LB中選擇對5%蔗糖的抗性將包括缺失型的tyrR基因的線性DNA整合。通過 診斷性聚合酶鏈式反應（PCR)來鑒定和確定正確的缺失。將tyrR缺失的目的是增加 aroG 和aroF的表達。實現相似結果的可選方法是用強組成型啟動子取代aroG和/或aroF之 前的原生啟動子和（如果必要的話），添加轉錄終止子。關于總體如何實現的更多細節在以 下實施例4中給出。
[0100] 以上描述的用于克服TyrR蛋白對AroG和AroF活性的抑制的兩種途徑中后 者是優選的，因為tyrR缺失會引起不希望的基因如aroLM的過表達（Neidhardt和 Curtiss, 1996)。關于總體如何實現的更多細節在以下實施例4中給出。
[0101] 實施例2
[0102] 反饋抗性的AroG和AroF
[0103] 導致反饋抗性的AroG酶（3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶或DAHPS)的 aroG基因中的突變是領域內已知的（Shumilin等人，1999 ;Kikuchi等人，1997 ;Shumilin 等人，2002)。還已知的是產生、鑒定和表征這些突變的方法（Ger等人，1994, Hu等 人，2003)。優選的突變是引起對苯丙氨酸抑制完全抗性的突變。可以通過數種已知方法中 的任一種將任何已知的已公開的反饋抗性突變引入到染色體中或質粒上所包含的aroG基 因中，其中一個方法實例是誘變PCR，其中期望的突變作為PCR引發寡核苷酸的部分被合成 (Hu等人，2003)。通過DNA測序來證實突變的正確置入。來自大腸桿菌C的野生型aroG 基因的序列在SEQ ID No. 18中給出。優選的突變是將AroG的氨基酸150從脯氨酸變成亮 氨酸的點突變，例如通過將密碼子150從CCA變成CTA (Hu等人，2003)。在更優選的實施方 案中，密碼子150從CCA變成CTG，其是大腸桿菌中的優選密碼子。該特別的aroG等位基因 是優選的，因為所編碼的DAHP合酶對高達3mM的苯丙氨酸抑制完全抵抗，并且其具有與野 生型酶相似的比活（Hu等人，2003)。
[0104] 可以通過誘變和選擇對一種或多種苯丙氨酸類似物（如P -2-噻吩丙氨酸、P-氟 代苯丙氨酸、P-氯代苯丙氨酸、〇-氟代苯丙氨酸和〇-氯代苯丙氨酸）的抗性、接著證明導 致抗性的突變與aroG基因關聯，來得到另外的反饋抗性aroG等位基因（Ger等人，1994 ;US 專利4, 681，852)。與aroG的關聯可以通過DNA測序或苯丙氨酸存在和不存在情況下的酶 測定來直接證明（Ger等人，1994)，或通過噬菌體介導的轉導和對aroG基因座處或其附近 的可供陽性或陰性選擇的遺傳標記物的選擇而間接證明（US專利4, 681，852)。這樣的遺 傳標記物可以是aroG基因自身中的缺失或點突變，或者是任何合適的緊密關聯的基因（如 大腸桿菌情況下的nadA)中的突變。例如，在大腸桿菌中，在誘變和選擇苯丙氨酸類似物抗 性后，單個突變體或突變體集合可被用作供體用于經Pl介導轉導至缺失所有三種DAHP合 酶基因 aroG、aroF和aroH的原生受體中，并選擇在合適的基本培養基上的生長。然后轉導 子將富集（一個或多個）期望的基因中的突變。備選地，在誘變和選擇類似物抗性后，單個 突變體或突變體集合可被用作供體用于經Pl介導轉導至包含nadA基因中的無效突變的原 生受體菌株中，再次選擇在缺乏煙酰胺的基本培養基上的生長。另一方法是在這樣的菌株 背景中選擇抗性突變體，所述菌株背景在aroG基因附近（如在nadA基因中）含有轉座子 (如TnlO)插入。從類似物抗性突變體Pl轉導到不包含所述轉座子的菌株背景中和選擇四 環素或其它合適的抗生素抗性將富集期望的aroG突變。在所有這些方法中，反饋抗性最終 通過酶測定和對基因的DNA測序而得以證實。我們將對反饋抑制具有抗性的aroG的等位 基因稱為aroG*。
[0105] 菌株WM191(AtyrR，AaroF)衍生自YMC9(ATCC33927)。利用兩步基因取代法 (Jantama等人，2008a)置入tyrR和aroF的完全缺失（clean deletion)，以得到菌株 WM191。接著，從 CAG12147(CGSC7351，Coli Genetic Stock Center, Yale University) 轉導入 nadA: : TnlO 等位基因，以得到菌株 WM189 ( A tyrR, A aroF, nadA: : TnlO)。在 LB+ 四環素 HCl (15mg/l)上進行選擇。菌株RY890 ( A tyrR: : kan, aroF363)通過Pl轉導 以三步從 MM294(ATCC33625)得到。供體菌依次為 JW1316-1(CGSC9179, Coli Genetic Stock Center, Yale University)、NK6024(CGSC6178, Coli Genetic Stock Center, Yale University)和 AB3257(CGSC3257, Coli Genetic Stock Center, Yale University),并且 三次選擇依次為LB+硫酸卡那霉素（50mg/l)、LB+鹽酸四環素（15mg/l)和NBS最低限葡萄 糖（Jantama 等人，2008a)及硫胺素 HCl (5mg/l)。
[0106] 用UV光對麗189誘變至約20%存活，并鋪板于含有〇-氟代苯丙氨酸（ImM)、硫胺 素（5mg/l)和煙酰胺（ImM)的NBS最低限葡萄糖培養基中（Jantama等人，2008a)。將從數 個板各自得到的菌落收集到單獨的池中，并在各個池上制備Plvir溶菌物。使用這些溶菌 物在LB培養基上將麗191轉導成四環素抗性（15mg/l)，并將得到的菌落復制鋪板到含有 ImM 〇-氟代苯丙氨酸、硫胺素（5mg/l)和煙酰胺（ImM)的NBS最低限葡萄糖培養基上。假 定在四環素和類似物上均存活的菌落復制物在aroG中含有反饋抗性突變。從5個獨立的 池中選擇八個單獨的菌落用于DNA測序。通過聚合酶鏈式反應將aroG編碼區擴增并測序。 示于圖4的結果顯示，八個菌株各自在其aroG基因中包含點突變。一些等位基因與已公開 的等位基因相同，但一些是新的。
[0107] 使用來自以上描述的池之一的Plvir溶菌物將RY890 (其具有aroG野生型等位基 因）轉導成四環素抗性并通過如上所述的復制鋪板轉導成對0-氟代苯丙氨酸（〇.3mM)抗 性。挑取四個克隆，命名為RY893、RY897、RY899和RY901，用于DNA測序（表4)，再次地，兩 個等位基因與已公開的等位基因相同，但兩個是新的。與后四個菌株同基因但卻含有野生 型aroG基因的菌株RY890通過從CAG12147轉導被構建為對照。這五株菌在搖瓶中在25ml NBS最低限葡萄糖（15g/l) +硫胺素 HCl (5mg/l)和煙酰胺（ImM)中過夜生長。所得的細胞 通過離心收集,重懸以用IOml水漂洗，再離心，并重懸于0. 5ml的50mM磷酸鉀（pH7. 0)中。 重懸的細胞通過與三滴氯仿一起渦旋而裂解，并使用與文獻中所描述的方法類似的方法測 定粗溶菌物的DAHP合酶活性（Hu等人，2003)，有以下改動。磷酸鹽緩沖液是50mM(終濃 度），pH7. 0,最終的赤蘚糖-4-磷酸濃度為2mM，最終的磷酸烯醇丙酮酸濃度為5mM，孵育溫 度為30°C，反應在10分鐘時終止。我們將ImU定義為每分鐘每毫克蛋白產生InM DAHP的 活性。為測試反饋抗性，在有或沒有終濃度ISmM的苯丙氨酸的存在下對各個粗溶菌物進行 測定。測定結果示于表5。酶顯示出不同的比活和對苯丙氨酸的抗性，但所有選擇的進行測 試的突變體形式顯著比野生型對照具有更高抗性。
[0108] 將來自如上所述的RY893、RY899、RY901和RY902的aroG等位基因按如下引入黏 康酸生產菌株背景中。將來自aroG*和aroGwt供體菌株的Plvir溶菌物用于將MYR219(大 腸桿菌C, A aroE, A ack: :P15-aroB, pMG37)轉導成四環素 HCl抗性（15mg/l),以分別得 到新菌株RY903、RY909、RY911和RY912。然后使用JW1316-1的Plvir溶菌物以引入 A tyrR: : kan等位基因，將這些菌各自轉導成硫酸卡那霉素抗性（50mg/l)，，分別得到菌株 RY913、RY919、RY921和RY922。始終維持壯觀霉素選擇以維持黏康酸質粒。所得的四株菌 在37°C在搖瓶中在含有20g/l葡萄糖、0. 2M MOPS緩沖液（pH7. 4)、煙酰胺（ImM)、苯丙氨 酸（100mg/l)、酪氨酸（100mg/l)、色氨酸（100mg/l)、對輕基苯甲酸（lmg/1)、對氨基苯甲酸 (lmg/l)、2,3-二輕基苯甲酸（lmg/1)、酚紅（10mg/l)和硫酸銨（lg/1)的補充物的NBS基 本培養基（Jantama等人，2008a)中生長48小時。通過針對pH7. 0標準物目視酚紅顏色估 計，通過按要求對搖瓶人工添加 Iml的I. OM KOH等分物，將pH保持在接近7。產生的黏康 酸如上所述通過HPLC進行檢測，結果顯示在表6中。所有三株含有反饋抗性的aroG*等位 基因的菌株較之含有野生型aroG等位基因的同基因菌株產生更多的黏康酸。在本文公開 的單獨實驗中，在多拷貝質粒PCP32AMP上含有aroG的菌株MYR205在搖瓶中產生I. 5g/l 黏康酸。因此，發明人已經顯示，較之含有同基因的aroG質粒的菌株，AtyrR和單拷貝染 色體aroG*的組合可以表現良好地在搖瓶中產生黏康酸。染色體等位基因相較于質粒等位 基因的固有的優異遺傳穩定性，加之減弱了對于為了維持質粒的選擇性培養基的需求，使 得本文描述的新菌株更加適合于大規模商業發酵。而且，不需要化學誘導物用于黏康酸通 路基因的表達。因此，上述的本發明菌株較之全部在不理想的多拷貝質粒上包含用于過表 達DAHP合酶的基因的現有技術（Niu等人，2002)而言有改進。
[0109] 按與以上針對AroG描述內容相似的方式，可以在質粒上或在染色體中置入產生 抵抗由酪氨酸的反饋抑制的AroF或AroH同工酶的突變。優選的突變是將AroF的氨基 酸148從脯氨酸變為亮氨酸的點突變，例如通過將密碼子148從CCG變為CTG(Weaver等 人，1990)，得到命名為aroF*的基因。可以按與以上針對aroG*等位基因描述內容類似 的方式通過對酪氨酸類似物（例如〇-氟代酪氨酸、m-氟代酪氨酸、P-氟代苯丙氨酸等） 的抗性來分離其它aroF*等位基因。可以通過與轉座子或卡那霉素抗性插入物關聯而選 擇、富集以及轉導aroF*等位基因，例如，在諸如JW2584(CGSC10051，Coli Genetic Stock Center, Yale University)的菌株中在緊密連接的AyfiR::kan中。
[0110] 實施例3
[0111] 從染色體DNA缺失aroE和黏康酸生產
[0112] 在該實施例中研究了過表達多拷貝質粒上的aroB和aroG以及表達在黏康酸通 路中有功能的蛋白的編碼基因的作用。在編碼莽草酸脫氫酶的aroE基因中含有缺失的菌 株MYR34被用作這些研究中的親本菌株。以與上述實施例1中所描述內容相似的方式完 成aroE的染色體拷貝的缺失。當用過表達編碼在莽草酸通路中有功能的DAHP合酶蛋白的 aroG基因的質粒pCP32AMP轉化MYR34時，DHS的積累有顯著提高。當用從組成型啟動子表 達aroB基因的質粒轉化MYR34時，沒有注意到DHS積累的顯著提高。然而，當用表達aroB 和aroG基因二者的質粒轉化大腸桿菌菌株MYR34時，相比使用僅轉化有aroG的MYR34時 所觀察的情況，DHS的積累有增加，因此表明aroB是DHS生產中的第二瓶頸（圖5)。
[0113] 在圖6呈現的實驗中，檢視了整合到宿主染色體DNA中的aroB基因的額外的拷貝 的效果。在衍生自MYR34的大腸桿菌菌株MYR170中，將處于P15啟動子控制下的aroB基 因的額外拷貝在ack基因座處整合到宿主染色體中。當用pCP32AMP質粒轉化MYR170菌 株時，與用相同質粒轉化MYR34菌株時所檢測到的DHS積累相比，DHS積累有輕微的增加。 MYR170中DHS積累的輕微增加可以歸因于整合到宿主染色體DNA中的aroB基因的額外拷 貝。當用表達aroB和aroG基因二者的pCP54轉化MYR170菌株時，DHS積累有進一步的增 力口，意味著aroB是DHS生產中的第二瓶頸。
[0114] 圖7提供了使用大腸桿菌菌株MYR34和MYR170的黏康酸生產結果。在建立了在 aroE缺失菌株MYR34和MYRl70中在aroB和aroG基因的過表達下有DHS積累后，工作致力 于觀察編碼在黏康酸生產通路中有功能的蛋白的"黏康酸通路"基因的表達是否會導致DHS 轉變成順，順-黏康酸。在這些實驗中，單獨用質粒PMG37或用質粒pMG37和pCP32AMP二 者轉化大腸桿菌菌株MYR34和MYR170。質粒pMG37表達編碼在黏康酸通路中有功能的蛋白 的aroZ、aroY和catAX基因。當用質粒pMG37和pCP32AMP二者轉化這些細菌菌株時，與僅 用PMG37質粒轉化的這兩種菌株中的黏康酸產量相比，MYR34和MYR170二者中的黏康酸產 量增加,這提示在這些菌株中，aroB表達是順，順-黏康酸生產的瓶頸。
[0115] 實施例4
[0116] tktA的過表達
[0117] 由tktA編碼的轉酮醇酶是戊糖磷酸通路中的關鍵酶，并被認為對于黏康酸生產 中的關鍵中間體之一--赤蘚糖-4-磷酸的生產是限制性的。已知通過將基因及其原生啟 動子置于多拷貝質粒上來過表達編碼轉酮醇酶的tktA(Sprenger等人，1995, 1995a)能提 高進入芳族通路中的流量（Draths等人，1992)。然而，這樣的質粒不穩定，并且往往需要抗 生素選擇以維持。現有技術中的另一方法是向宿主菌株的染色體中添加 tktA基因的一個 額外拷貝（Niu等人，1992)。然而，tktA的一個額外拷貝及其原生啟動子并不足以用赤蘚 糖-4-磷酸飽和芳族通路，因為其原生啟動子并非完全接近于理想。這樣，該方法需要實質 的改進。
[0118] 可以例如，通過用強組成型啟動子例如來自枯草芽孢桿菌噬菌體SPOl的P15或P 26 啟動子（分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，或來自細菌噬菌體入的Pk啟動子（SEQ ID No. 3)來替代染色體中的原生tktA啟動子，來獲得改進的tktA過表達。這通過如實施例1 中描述的兩步而實現，不同在于在第一步驟中使用cam K，sacB盒來取代原生染色體tktA啟 動子。在第二步中，通過轉化線性DNA并進行蔗糖抗性選擇而置入強組成型啟動子，所述線 性DNA包含強組成型啟動子，其側翼是在強組成型啟動子下游側的tktA編碼區5'端的至少 50個堿基和在強組成型啟動子上游側的就在原生tktA啟動子上游的同源的至少50個堿基 對。自這樣的表達盒的改進的表達還通過增加從表達盒轉錄的mRNA的穩定性而實現。mRNA 穩定性的提高通過在mRNA的5'端、mRNA的3'端或兩端增加莖環結構而實現。莖-環結 構往往存在于mRNA的末端，其由rho-非依賴性的轉錄終止子自然終止，但如果不是這樣， 則可以通過遺傳工程的公知方法（連接、PCR等）向DNA序列中添加 rho-非依賴性的轉錄 終止子。這樣的終止子可以由在各重復序列中的4至20個堿基的反向重復序列組成，所述 反向重復序列由3個或更多個堿基的"環"隔開，后接富含T (脫氧胸苷）的一個或多個堿 基的區域。反向重復序列富含G和C(脫氧鳥苷和脫氧胞苷）。類似地，可以通過就在轉錄 起始點的下游但在核糖體結合位點之前插入含有如上所述的莖-環但沒有T-富集的區的 DNA序列，將莖-環構建到mRNA的5'端中。對于此的實例結合P15啟動子（SEQ ID No. 1) 給出。
[0119] 在過表達tktA基因對經由莽草酸通路的碳流的作用的分析中，大腸桿菌菌株 MYR170被用作親本菌株。MYR170在編碼莽草酸脫氫酶的aroE基因中有缺失并在ack基因 座處具有aroB基因的額外拷貝。
[0120] 在圖8、9和10所描繪的實驗中，使用兩種不同質粒，即pCP32AMP和pCP50。質粒 PCP32AMP僅從其原生啟動子表達DAHP合酶aroG基因，質粒pCP50從其原生啟動子表達轉 酮醇酶基因 tktA連同aroG基因。用pCP32AMP和pCP50質粒單獨轉化具有aroE缺失和在 染色體DNA的ack基因座處整合的在P 15啟動子控制下的aroB基因的額外拷貝的MYR170。 如圖8所示，與僅表達aroG基因的大腸桿菌細胞相比，aroG基因連同tktA基因的表達使 DHS積累進一步增加。
[0121] 圖9提供了用質粒pCP32AMP或pCP50轉化的兩種不同菌株即MYR34、MYR170中的 DHS產率的數據。具有aroE基因缺失的MYR34菌株每消耗1克葡萄糖產生0. 1克DHS。當 用具有aroG基因過表達的pCP32AMP質粒轉化MYR34菌株時，該菌株中的DHS產率增至每 消耗1克葡萄糖產生〇. 15克DHS。MYR170具有在ack基因座處插入的aroB基因的額外拷 貝。由于存在aroB基因的該額外拷貝，用pCP32AMP轉化的MYR170菌株中的DHS生產的產 率稍高于用PCP32AMP轉化的MYR34菌株中所觀察到的DHS產率。因此，MYR170中aroB的 額外拷貝的存在引起增加的經由莽草酸通路的碳流。當用表達aroG和tktA基因二者的質 粒PCP50轉化MYR170菌株時，觀察到DHS產率的進一步提高。因此，tktA的額外拷貝的存 在導致經由莽草酸通路的碳流的增加。更具體而言，存在額外的aroB和tktA基因的作用 引起對DHS產率的累加效應。
[0122] 圖10中描繪的實驗中所使用的MYR261被改造為在poxB基因座處將tktA基因的 額外拷貝整合到MYR170的染色體DNA中。MYR261菌株中期望的基因取代（poxB ::tktA) 通過PCR驗證。用pCP32AMP (aroG過表達）質粒或pCP50 (aroG和tktA過表達）質粒轉化 MYR261。作為對照，用pCP32AMP質粒轉化MYR170。如圖10所示的結果所顯示的，與在用 相同質粒轉化的MYR170菌株中所觀察到的DHS生產的滴度相比，MYR261的染色體DNA中 tktA基因的額外拷貝的存在增加了 pCP32AMP質粒的DHS生產滴度。當用過表達轉酮醇酶 的質粒PCP50轉化菌株時，MYR261中轉酮醇酶水平的進一步增加導致DHS生產滴度的進一 步提高。由PoxB編碼的酶PoxB，或丙酮酸氧化酶，產生乙酸鹽作為反應產物。這樣，如本 文描述的因 tktA插入引起的poxB缺失去除了乙酸鹽生產的潛在活性通路。類似地，同時 插入P15ar〇B并刪除編碼AckA或乙酸激酶的ackA，如在以下實施例12中所描述的，去除 了通向乙酸鹽的另一潛在活性通路。乙酸鹽產生在發酵中通常是不合人意的（Jantama等 人，2008b)。這樣，這些缺失可以用于減少乙酸鹽生產。
[0123] 圖11提供了在用質粒pCP32AMP和pMG37轉化后大腸桿菌MYR170、MYR261和 MYR305菌株中的黏康酸和乙酸生產的滴度。通過從染色體DNA中缺失poxB基因從MYR170 得到MYR305,而MYR261是MYR170衍生菌，其中poxB基因已經通過插入tktA基因的額外拷 貝而失活。如上所述，質粒PCP32AMP表達編碼在莽草酸生物合成通路中起作用的DAHP合 酶蛋白的aroG基因，導致由于大腸桿菌菌株MYR170、MYR261和MYR305中aroE基因的缺失 的DHS的積累。由于質粒pMG37上黏康酸通路基因即aroZ、aroY和catAX的表達，DHS被 轉化成順，順-黏康酸，如圖2所示。在MYR261菌株中aroB基因和tktA基因的額外拷貝 的存在下，黏康酸生產稍有增加，伴隨著乙酸積累的降低。
[0124] 實施例5
[0125] talA或talB的過表達
[0126] talB基因編碼大腸桿菌中主要的轉醛醇酶，但talA基因也編碼小部分的轉醛醇 酶。已知轉醛醇酶的過表達提高進入芳族通路的流量（Lu和Liao, 1997 ;Sprenger，1995 ; Sprenger等人，1995b)。在現有技術中，這是通過在多拷貝質粒上從原生啟動子過表達tal 基因（現在稱為talB基因）而實現的（Lu等人，1997, Sprenger等人，1995b)。然而，這樣 的質粒并不穩定，并且需要抗生素篩選以維持。因此，需要有改進的方法。可以例如通過用 強組成型啟動子例如來自枯草芽孢桿菌噬菌體SPOl的P15或P26啟動子（分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，或來自細菌噬菌體入的PR啟動子（SEQ ID No. 3)來替代染色體中 的原生talB啟動子來獲得改進的talB表達。這通過如實施例1中描述的兩步而實現，不同 在于在第一步驟中使用cam K，sacB盒來取代原生染色體talB啟動子。在第二步中，通過用 線性DNA轉化并進行蔗糖抗性選擇而置入強組成型啟動子，所述線性DNA包含強組成型啟 動子，其側翼是在強組成型啟動子下游側的talB編碼區5'端的至少50個堿基和在強組成 型啟動子上游側的就在原生talB啟動子上游的同源的至少50個堿基對。也可以通過相似 方法來過表達talA基因，但優選過表達talB基因，因為其編碼主要活性（Sprenger，1995 ; Sprenger等人，1995b)。對于有關設計為用于過表達的表達盒的構建的更多細節,參見實 施例4。
[0127] 實施例6
[0128] aroZ、aroY 和 catAX 基因的表達
[0129] 為證實大腸桿菌所產生的內源性DHS轉化成黏康酸，將來自不動桿菌屬物種 ADPl的異源基因 catAX、來自肺炎克雷伯桿菌的aroY、和來自不動桿菌屬物種ADPl的 quiC克隆到低拷貝質粒pCL1921中強組成型啟動子（分別為P15、Pk和P26)下（Lerner和 Inouye, 1990)，以生成"黏康酸質粒"pMG37。攜帶空載體（pCL1921)或pMG37的MYR34衍 生菌在含有2%葡萄糖的搖瓶培養基（補充有芳族氨基酸和維生素的NBS基本培養基）中 在37°C生長17小時。收集上清液并通過HPLC分析。與顯示DHS積累的MYR34/pCL1921成 對比，MYR34/pMG37顯示黏康酸的產生（圖12)。從后一菌株中沒有檢測到顯著量的DHS或 中間體產物如PCA和兒茶酚，提示從pMG37表達的異源基因是有功能并且足夠的。
[0130] 實施例7
[0131] aroZ同源物的比較
[0132] 比較三種不同的aroZ同源物和類似物（圖13)將DHS轉入黏康酸生產通路的 能力。來自不動桿菌屬物種ADPl的quiC、來自蘇云金芽孢桿菌的asbF和來自粗糙脈 孢菌的qa_4被報告為編碼具有AroZ樣活性的蛋白（Elsemore和Ornston, 1995 ;Fox等 人，1995 ;RUtledge，1984)。這些基因各自經密碼子優化以用于在大腸桿菌中表達且通過 GeneArt (Invitrogen)合成，并克隆到還分別從P15和Pk啟動子表達catAX和aroY基因的低 拷貝"黏康酸質粒"中強組成型P 26啟動子下。MYR34/pCL1921、MYR34/pMG37 (以quiC作為 aroZ的黏康酸質粒）、MYR34/pMG47 (以asbF作為aroZ的黏康酸質粒）和MYR34/pMG70 (以 asbF作為aroZ的黏康酸質粒）在具有含2%葡萄糖、芳族氨基酸和芳族維生素的基本培 養基的搖瓶中在37°C生長48小時。收集上清液并通過HPLC分析。如所預期的，轉化空載 體的MYR34積累DHS且不產生黏康酸。檢查的兩種aroZ同源物和一種類似物在將DHS轉 向黏康酸生產中是有功能的，但程度不同。表達quiC基因的MYR34衍生菌最為強烈，顯示 近乎100%的DHS向黏康酸的轉化和微乎其微的DHS存留量。表達真菌aroZ同源物qa-4 的MYR34衍生菌以約80 %的DHS向黏康酸的轉化和20 %的DHS存留緊接其后。最后，表達 asbF基因的MYR34衍生菌顯示僅50%的DHS向黏康酸的轉化和50%的DHS存留。匯總而 言，在我們的搖瓶測定條件下，與其它aroZ同源物相比，quiC基因的表達和/或活性看起 來是最1?的。
[0133] 實施例8
[0134] catAX、aroY和quiC的染色體整合
[0135] 可以通過含有僅在adhE基因座處染色體整合的從組成型啟動子表達的catA-X、 aroY和quiC的單拷貝的菌株來生產黏康酸。
[0136] 高 DHS 生產菌-MYR170( AaroE, Aack: :P15_aroB)，是用于在染色體中 adhE 基 因座處整合黏康酸通路基因的宿主菌（SEQ ID No. 41)。對所得的菌株MYR352轉化質粒 YEp24 (中拷貝，空載體）、pCP32AMP (中拷貝，aroG從原生啟動子表達）或pCP50 (中拷貝， aroG和tktA從其各自的原生啟動子表達），以生成衍生菌株。后兩種質粒用于增加 DHS產 量。菌株在37°C在如上所述的含2%葡萄糖的搖瓶培養基中生長72小時。在72小時收集 上清液并通過HPLC分析。如所預期的，與空載體對照相比，轉化有aroG和aroG/tktA的 MYR352衍生菌顯示出總產物形成的整體提高（圖14)。所有的MYR352轉化子生產可測量 滴度的黏康酸，首次證明黏康酸可以由僅含有整合的"黏康酸通路"基因的菌株生產且不需 要補料基因表達的化學誘導物。
[0137] 任何這些MYR352衍生菌中產生的DHS并非全被轉化成終產物黏康酸。相反，有顯 著量的兒茶酚積累（圖14)，提示當catAX在染色體上從單拷貝表達時，其表達或活性是限 制性的。由于主要的積累中間體是兒茶酚，可能在用于黏康酸合成的MYR352菌株背景中 quiC和aroY基因表達和/或活性是充足的。
[0138] 將MYR352衍生菌與類似的MYR219衍生菌平行比較。MYR219菌株與MYR170菌株 相同，但含有表達黏康酸通路基因的低拷貝質粒PMG37。因此，MYR352與MYR219菌株的主 要區別涉及到黏康酸通路基因的劑量（分別為1個拷貝vs.約5個拷貝）。與MYR352衍生 菌相反，MYR219衍生菌顯示出極少的兒茶酚或其它中間體的積累，并成功地生產終產物黏 康酸。總的來說，這些結果表明需要提高菌株例如MYR352中的catAX活性。
[0139] 實施例9
[0140] catAX 的表達
[0141] MYR352菌株中兒茶酚的積累和不足的黏康酸生產是由于catAX基因產物的有限 劑量和/或活性。如上所述，MYR352含有AaroE，Aack ::P15-aroB和強組成型啟動子下的 染色體整合的catAX、ar〇Y和quiC基因的單拷貝。用中拷貝的空載體對照（YEp24)或aroG/ tktA表達質粒（pCP50)轉化該菌株以增加進入芳族氨基酸合成通路的碳流并生產大量的 DHS。轉化的菌株在如上所述的補充有2%葡萄糖的搖瓶培養基中在37°C生長72小時，導 致兒茶酚中間體的積累。該結果提示catAX活性在MYR352中可能不足。為驗證該假設，測 試一種或多種從低拷貝質粒表達的黏康酸通路基因減弱MYR352/pCP50中兒茶酚積累的能 力（圖15)。具體而言，還用低拷貝的空載體對照（pCL1921)或表達黏康酸生產通路的所有 三種基因、兩種基因或一種基因的質粒轉化MYR352/pCP50。在如上所述的搖瓶實驗中測定 衍生菌。盡管單獨增加 aroY (來自pMG27)或單獨增加 quiC (來自pMG39)的劑量并未減少 兒茶酚積累，但所有的黏康酸通路基因（來自PMG37)的表達或catAX和aroY(來自pMG33) 共同的表達導致成功地將兒茶酚轉化成黏康酸。此外，單獨表達catAX(來自pMG31)足以 生產黏康酸和防止兒茶酚積累。
[0142] 實施例10
[0143] 構建滲漏aroE突變
[0144] 在用于生產順，順-黏康酸的現有技術方法中，宿主菌株含有名為aroE353的aroE 基因突變，其是無效突變。結果，該菌株需要補料從莽草酸通路制備的芳族氨基酸（苯丙氨 酸、酪氨酸和色氨酸）和芳族維生素（對羥基苯甲酸、對氨基苯甲酸，和2, 3-二羥基苯甲 酸）。在商業上有吸引力的方法中補料芳族氨基酸太過昂貴。這樣，現有技術方法需要實質 的改進。這可以通過置入滲漏aroE基因（我們會將其稱為aroE*)而實現。滲漏突變通過 首先產生使aroE編碼序列中的一個氨基酸改變引起無效表型的錯義突變而獲得。這可以 通過任何形式的誘變和篩選對于以上列出的六種芳族化合物的同時營養缺陷型而實現。優 選方法是利用Taq DNA聚合酶，使用野生型大腸桿菌C基因組DNA作為模板，并使用與aroE 編碼區上游的約1000個堿基對和下游的1000個堿基對雜交的PCR寡核苷酸引物，通過易 錯PCR誘變來產生突變體aroE基因池。所得的線性DNA分子池用于轉化產生順，順-黏 康酸并且含有已經取代aroE編碼區的整合的camR, sacB盒（對于相關實例參見實施例4) 的大腸桿菌C衍生菌，并進行蔗糖抗性選擇。然后對轉化子篩選已經失去氯霉素抗性并且 需要以上列出的六種芳族化合物的營養缺陷型。挑取數個獨立的營養缺陷型并通過在沒有 六種芳族化合物的基本葡萄糖板上鋪板約1〇 7、1〇8、或IO9細胞（在基本葡萄糖培養基中漂 洗）來測試可復原力（revertability)。挑取在板上產生菌落的復原體并進行順，順-黏康 酸產生但沒有實質性水平的芳族氨基酸產生的測試。在這些復原體中將有這樣的菌株，所 述菌株攜帶aroE基因中的一個或多個突變，從而使AroE酶提供充足的芳族氨基酸和維生 素用于生長、但又沒有這些芳族化合物的剩余。獲得滲漏aroE突變體的另一方法是向順， 順-黏康酸生產菌中置入經典的可回復的aroE突變體如aroE353和aroE24(均可從Yale University 的 Coli Genetic Stock Center, New Haven, CT, USA得到）之一，并如上所述選 擇復原體。
[0145] 實施例11
[0146] 通過易化擴散的葡萄糖輸入
[0147] 芳族通路的第一個關鍵步驟中的底物之一是磷酸烯醇丙酮酸（PEP)。PEP也是用 于通過細菌磷酸轉移酶體系（PTS)輸入葡萄糖和一些其它糖類的磷酸鹽和能量的來源。因 此，當細菌在PTS-依賴性的糖上生長時，在PTS和芳族通路之間存在對PEP的競爭。這樣， 可以通過刪除PTS并提供可選的糖攝取通路來實現增加芳族通路流量的顯著改進。該問題 的一個解決方案是用大腸桿菌GalP通透酶，對于葡萄糖攝取起相當好作用的質子同向轉 運蛋白（US專利6, 692, 794)取代PTS。然而，質子同向轉運蛋白仍然耗用能量以維持驅動 通透酶所必需的質子梯度。這樣，對于方法的進一步改進存在需求。
[0148] 一些糖，例如木糖，可以由從ATP(三磷酸腺苷）的水解獲得能量的轉運蛋白運輸。 再一次地，如果可以用需要較少能量的轉運蛋白來取代能量依賴性的轉運蛋白，那么可以 獲得改進，因為ATP中固有的能量得以保存用于其它有益用途。
[0149] 可以通過利用在糖輸入中不耗用能量的易化擴散轉運蛋白來獲得顯著改進 (Parker等人，1995 ;Snoep等人，1994)。例如，由gif基因編碼的來自運動發酵單孢菌 (Zymomonas mobilis)的葡萄糖易化蛋白可以用于代替或額外加至3-脫氫莽草酸鹽（DHS) 生產菌株中的PTS (Yi等人，2003)。然而，這些菌株仍然至少部分依賴于GalP進行葡萄糖 輸入。由于GalP需要質子梯度形式的能量用于葡萄糖輸入，有需求提高黏康酸生產菌株的 葡萄糖輸入效率。
[0150] 用于gif加上葡糖激酶基因 glk(也來自運動發酵單孢菌）的表達的盒可以與強 組成型啟動子如P26組裝。然后可以將該盒在不妨礙期望的化合物（在這種情況下為順， 順-黏康酸）的生產的位置處整合到宿主菌株的基因組中。大腸桿菌染色體中這樣的位置 的實例是蘇氨酸降解操縱子，tdcABCDEFG。如果生長培養基不含蘇氨酸，則不需要操縱子或 該操縱子不表達，由此在該操縱子中插入表達盒不會妨礙代謝。
[0151] 為實現上述的改進，利用與實施例1中所公開內容相似的方法將一個或多個編碼 PTS功能的基因缺失。例如可以缺失ptsH、ptsI、err或ptsG中的一個或多個。接著缺失 galP。然后可以在兩步步驟中置入P26_glf，glk盒，與實施例1中所描述內容相似。在第一 步中，利用源自PAC21 (SEQ ID No. 15)的線性DNA在tdc操縱子處整合camK，sacB盒，并進 行氯霉素（30mg/l)抗性選擇。在第二步驟中，利用源自pAC19(SEQ ID No. 15)的線性DNA 在tdc操縱子處整合P26-glf，glk盒，進行蔗糖抗性選擇并進行氯霉素敏感度篩選，在這種 情況下是在基本葡萄糖培養基上的改進生長。
[0152] 為測試葡萄糖的易化擴散是否能替代大腸桿菌中常規的葡萄糖輸入體系，從 MYR34 (AaroE)中缺失ptsHI基因和galP基因，然后利用源自pAC19(SEQ ID No. 14)的線 性DNA在tdc操縱子處整合P26-glf，glk盒，得到菌株MYR217。MYR217在補充有所需的三 種芳族氨基酸和三種芳族維生素樣化合物的基本葡萄糖培養基上生長相當好（圖16)。然 而，含有PtsHI和galP缺失但不含有glf，glk盒的菌株MYR31并未顯示出任何可測量的生 長（圖16)。因此，易化擴散足以取代我們的菌株背景中的兩種常規葡萄糖輸入體系。
[0153] 為測試易化擴散是否可用于生產源自芳族通路的化合物，用pCP54(ar〇G，aroB) 和pCP55(aroG，aroB，tktA)轉化MYR34和MYR217。對這兩種菌株比較搖瓶中芳族中間體 3_脫氫莽草酸鹽（DHS)的生產（圖17)。在pCP54或pCP55的情況下，利用易化擴散的菌 株產生與利用常規葡萄糖輸入體系的菌株相比同樣多或更多的DHS。DHS生產是經改造的 大腸桿菌菌株中黏康酸生產的良好代表，因此我們可以得出結論，葡萄糖的易化擴散對于 黏康酸生產是有用的改進。
[0154] 實施例12
[0155] aroB基因的過表達
[0156] 據報道aroB基因的表達對于順，順-黏康酸生產是限速性的（Niu等人，2002)。 在現有技術中，據稱這是通過整合aroB基因的第二拷貝與其原生啟動子而解決的。然而， 這并不足以緩解aroB限制，因為aroB基因的原生啟動子和核糖體結合位點還遠不夠理想。 這樣，該方法需要實質的改進。
[0157] 可以例如通過用強組成型啟動子例如來自枯草芽孢桿菌噬菌體SPOl的P15或P 26 啟動子（分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，或來自細菌噬菌體入的Pk啟動子（SEQ ID No. 3)來替代染色體中的原生aroB啟動子來獲得改進的aroB過表達。這通過如實施例4 中描述的兩步而實現，不同在于在第一步驟中使用cam K, sacB盒來取代原生染色體aroB啟 動子和/或核糖體結合位點。在第二步中，通過用線性DNA轉化并進行蔗糖抗性選擇而置 入強組成型啟動子，所述線性DNA包含強組成型啟動子，后接核糖體結合位點和在強組成 型啟動子的下游側的自aroB編碼序列5'端的至少50個堿基（包括ATG起始密碼子），以 及在強組成型啟動子上游側的就在原生aroB啟動子上游的同源的至少50個堿基對。除了 置入更強啟動子外或代替置入更強啟動子，利用相似方法，可以在aroB的ATG翻譯起始密 碼子上游的約4至10個堿基對處置入更強的核糖體結合位點例如AGGAGG。這樣的合成盒 例如P 15-aroB盒的拷貝可以在不同于原生aroB基因座的基因座處例如在ack基因座處整 合到染色體中。如實施例4中同時缺失ack基因并缺失poxB基因可幫助減少發酵過程中 不希望的乙酸鹽形成。
[0158] 實施例13
[0159] 降低經由戊糖磷酸通路的氧化分支的流量
[0160] 芳族通路中第一關鍵步驟所需的赤蘚糖-4-磷酸來源于戊糖磷酸通路（PPP)的非 氧化部分。存在兩種不同的通路可讓碳進入PPP。第一種是從葡萄糖-6-磷酸通過酶葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶（由zwf基因編碼）、6_磷酸葡糖酸內酯酶（由pgl基因編碼）和6-磷 酸葡糖酸脫氫酶（由gnd基因編碼），得到核酮糖-5-磷酸。在這三個步驟的最后，一個碳 作為CO 2損失。這種進入PPP的通路稱為PPP的氧化分支。核酮糖-5-磷酸然后通過異構 酶、差向異構酶、轉酮醇酶和轉醛醇酶的作用被轉化成多種其它糖磷酸鹽。這組起始于核 酮糖-5-磷酸的可逆反應被稱為PPP的非氧化分支。第二種碳進入PPP的通路是通過果 糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸（二者都來自Embden-Myerhoff通路，也稱為糖酵解），它們 可經轉醛醇酶和轉酮醇酶組合和重排而得到多種其它糖磷酸鹽，其中之一是赤蘚糖-4-磷 酸。如果碳是通過該第二途徑進入PPP，則沒有CO 2損失。為了提高自葡萄糖的順，順-黏康 酸產率，通過阻斷PPP的氧化分支從而使所有進入PPP的碳必須經歷自果糖-6-磷酸和甘 油醛-3-磷酸的非氧化途徑，可以防止CO 2損失。利用與實施例1所公開的用于缺失tyrR 基因的內容相似的兩步法，通過缺失zwf基因來完成PPP氧化分支的阻斷。
[0161] 實施例14
[0162] 增加通向芳族通路和經由PEP通向芳族通路的流量
[0163] 理想的是確保PEP不是順，順-黏康酸通路上的限速中間體。這是例如，通過增 加丙酮酸通過酶PEP合成酶向PEP的再循環而實現的，這是通過如以上在其它實施例中 所描述的整合pps基因的過表達盒而實現的。另一方法是限制丙酮酸激酶的PEP消耗，丙 酮酸激酶在大腸桿菌中由PykA和pykF基因編碼。在這種情況下，方法是降低（一種或 多種）酶的活性。這是通過缺失一種或多種編碼丙酮酸激酶的基因（如實施例1中對于 tyrR所描述的），或降低這些基因中的一種或多種的表達強度，如通過突變啟動子、核糖體 結合位點或編碼序列從而使丙酮酸激酶活性的水平降低而實現的。例如，大腸桿菌PykA基 因之前的RBS是5' CGGAGTATTACMS。ATG翻譯起始密碼子加下劃線。該序列可以突變成 CaGAGTATTACATG. CaaAGTATTACATG. CaatGTATTACATG. CaataTATTACATG 等等，從而通過一次 一個堿基變化使RBS序列變得與AGGAGG的共有RBS更加不同。然后將各個突變的形式引 入到染色體中PykA基因座處，取代野生型，并測量黏康酸生產水平的改進。
[0164] 實施例15
[0165] 賦予蔗糖上的生長
[0166] 源自大腸桿菌C的菌株不能以蔗糖作為唯一碳源生長。然而，如PCT專利申請PCT/ US11/064598中（在此整體地并入本文以作參考）所公開的，它們可經基因改造而如此生 長。這樣，可以改造順，順-黏康酸生產菌株使其在蔗糖上生長，如以上提及的申請中所公 開的那樣。
[0167] 實施例16
[0168] 改進的順，順-黏康酸生產者
[0169] 可以通過一個接一個地安置特征將實施例1-15中所描述的所有特征組合到一株 大腸桿菌菌株中。所得的菌株包含改進的順，順-黏康酸生產者。隨后可通過在與第一拷貝 的位置隔開的位置，一次一個地整合各個上述過表達盒的第二拷貝，對所得菌株進行再進 一步的改進。方便且安全的位置的實例是在就在rrfF(其編碼核糖體RNA)的終止子下游的 BsrBl限制性位點。期望的盒作為平端線性DNA連接到質粒pMH17F(SEQ ID No. 17)中唯一 的BsrBl位點。實例是catAX表達盒連接以得到名為pcatAX的質粒。平行地，camK，sacB 盒作為平端片段連接到PMH17F中以得到pMH28F(SEQ ID No. 19)。使用通過PCR或通過限 制性酶切從PMH28得到的線性DNA在rrfF位點處保存camK，sacB盒。接著，利用在蔗糖 上選擇，使用通過PCR或通過限制性酶切從pcatAX得到的線性DNA在rrfF基因座處安置 catAX盒的第二拷貝。然后將所得的菌株與祖代親本菌株比較順，順-黏康酸生產，以確定 catAX是限制性步驟。通過相似的方法，對來自實施例2-15的各個盒測試限速步驟。如果 發現步驟是限速性的，則在染色體的另外其它合適位置處整合相關盒的一個或多個額外的 拷貝，引起順，順-黏康酸生產的更進一步改善，而不需要質粒或可誘導的啟動子。
[0170] 實施例17
[0171] 通過發酵生產順，順-黏康酸
[0172] 可以通過以上實施例1-15中所公開的經基因改造的微生物來生產順，順-黏康 酸。生長培養基可以廣泛地不同，并且可以是任何支持微生物充分生長的培養基。優選的 培養基是含有礦物鹽和非芳族碳源例如葡萄糖、木糖、乳糖、甘油、乙酸、阿拉伯糖、半乳糖、 甘露糖、麥芽糖或蔗糖的基本培養基（關于優選基本生長培養基的實例參見上文）。對于 經改造的微生物和生長培養基的各個組合，通過常規實驗來確定生產順，順-黏康酸的合 適條件，在所述常規實驗中，發酵參數系統性地變化，例如溫度、pH、通氣速率和用于維持pH 的化合物。隨著順，順-黏康酸產生，必須向發酵罐中補料一種或多種化合物以防止pH變 得太低。用來中和酸的優選化合物包括堿性鹽，如銨、鈉、鉀、鈣、鎂的氧化物、氫氧化物、碳 酸鹽和碳酸氫鹽，或者兩種或更多種的這類堿鹽的組合。
[0173] 大腸桿菌MYR428菌株在7升發酵罐中的黏康酸生產示于圖18。對具有基因 型 A aroE A ackA: :P15_aroB A p〇xB: : tktA 的大腸桿菌 MYR261 菌株轉化質粒 pCP32AMP 和 PMG37以產生MYR428。MYR428在如上所述的7升發酵罐中以葡萄糖補料生長48小時。最 終黏康酸滴度為16g/l (參見圖18)。
[0174] 在發酵完成后，通過絮凝、離心和/或過濾來移除細胞，然后通過一個或多個后續 步驟例如沉淀、結晶、電滲析、層析（離子交換型、疏水親和性、和/或基于尺寸的）、微濾、納 濾、反滲透和蒸發的組合從澄清發酵液中純化順，順-黏康酸。
[0175]
【權利要求】
1. 從非芳族碳源開始生產順，順-黏康酸的經基因改造的微生物，其中將所有編碼在 黏康酸通路中起作用的蛋白質的基因整合到所述微生物的染色體DNA中。
2. 權利要求1的經基因改造的微生物，其中所述編碼在黏康酸通路中起作用的蛋白質 的基因選自由aroZ、qa_4、asbF、quiC、aroY、和catAX組成的組。
3. 權利要求1的經基因改造的微生物生物體，其包含編碼不動桿菌屬 (Acinetobacter)細菌的QuiC酶或所述QuiC酶的同源物的基因。
4. 權利要求1的經基因改造的微生物，其包含一種或多種編碼在莽草酸通路中起作用 的蛋白質的外源基因。
5. 權利要求4的經基因改造的微生物，其中將所述編碼在莽草酸通路中起作用的蛋白 質的外源基因中的一種或多種整合到所述生物體的染色體DNA中。
6. 權利要求4的經基因改造的微生物，其中所述編碼在莽草酸通路中起作用的蛋白質 的外源基因選自由 aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe 和 rpi 組成的組。
7. 權利要求4的經基因改造的生物體，其中所述編碼在黏康酸通路或莽草酸通路中起 作用的蛋白質的基因無一從需要補料化學品用于誘導的啟動子表達。
8. 權利要求1的經基因改造的宿主細菌，其中芳族氨基酸生物合成的負調節蛋白的活 性實質上降低或消除。
9. 權利要求8的經基因改造的微生物，其中芳族氨基酸生物合成的負調節蛋白是TyrR 蛋白或TyrR蛋白的同源物。
10. 權利要求8的經基因改造的微生物，其中編碼芳族氨基酸生物合成的負調節蛋白 的基因已被突變。
11. 權利要求1的經基因改造的生物體，其包含編碼滲漏AroE酶的aroE基因。
12. 權利要求1的經基因改造的微生物生物體，其中至少一種在莽草酸通路中有活性 的酶實質上抵抗所述微生物的代謝物的抑制。
13. 權利要求12的經基因改造的生物體，其包含aroG*基因，所述aroG*基因編碼實質 上抵抗苯丙氨酸抑制的DAHP合酶。
14. 權利要求12的經基因改造的生物體，其包含編碼DAHP合酶的aroG*基因，所述 aroG* 基因選自由 aroG*20-893、aroG*20-897、aroG*20-899、aroG*20-901、aroG* 111、 aroG*211、aroG*212、aroG*311、aroG*312、aroG*411、aroG*412 和 aroG*511 組成的組。
15. 權利要求I的經基因改造的微生物，其中所述微生物是細菌。
16. 權利要求1的經基因改造的微生物，其中所述微生物衍生自大腸桿菌 (Escherichia coli)C〇
17. 經基因改造的細菌，其在PEP依賴性磷酸轉移酶體系中有缺陷、在用于葡萄糖輸入 的基于GalP蛋白的體系中有缺陷，且包含編碼功能性的葡萄糖易化擴散蛋白的外源基因。
18. 如權利要求17中的經基因改造的細菌，其中功能性的葡萄糖易化擴散蛋白是由 gif?基因編碼的Glf蛋白。
19. 如權利要求17中的經基因改造的細菌，還包含編碼葡糖激酶的外源基因。
20. 如權利要求17中的經基因改造的細菌，還包含一種或多種外源基因，所述外源基 因編碼在從非芳族碳源開始生產順，順-黏康酸的黏康酸通路中起作用的蛋白質。
21. 權利要求20的經基因改造的細菌，其中所述編碼在黏康酸通路中起作用的蛋白質 的基因選自由aroZ、qa_4、asbF、quiC、aroY和catAX組成的組。
22. 如權利要求17中的經基因改造的細菌，還包含一種或多種在染色體上整合的外源 基因，所述外源基因編碼在莽草酸通路中起作用的蛋白質。
23. 如權利要求22中的經基因改造的細菌，其中所述編碼在莽草酸通路中起作用的蛋 白質的外源基因選自由aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe和rpi組成的組。
24. 權利要求17的經基因改造的細菌，其中芳族氨基酸生物合成的負調節蛋白的活性 被實質上降低或消除。
25. 權利要求17的經基因改造的細菌，其中芳族氨基酸生物合成的負調節蛋白是TyrR 蛋白或TyrR蛋白的同源物。
26. 權利要求17的經基因改造的細菌，其中編碼芳族氨基酸生物合成的負調節蛋白的 基因已被缺失或突變。
27. 權利要求17的經基因改造的細菌，其中至少一種在莽草酸通路中有活性的酶實質 上抵抗所述微生物的代謝物的抑制。
28. 權利要求17的經基因改造的細菌，其中所述微生物衍生自大腸桿菌C。
29. 從非芳族碳源開始生產順，順-黏康酸的經基因改造的微生物，其中編碼在黏康酸 通路和莽草酸通路中起作用的蛋白質的外源基因不從需要補料化學品用于誘導的啟動子 表達。
30. 如權利要求29中的經基因改造的微生物，其中所述微生物是細菌。
31. 如權利要求29中的經基因改造的微生物，其中所述微生物是大腸桿菌。
32. 從非芳族碳源開始產生順，順-黏康酸的經基因改造的微生物，所述微生物包含編 碼滲漏AroE酶的aroE基因。
33. 如權利要求32中的經基因改造的微生物，其中所述微生物是細菌。
34. 如權利要求32中的經基因改造的微生物，其中所述微生物是大腸桿菌。
【文檔編號】C12P7/40GK104220587SQ201380017560
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年1月29日 優先權日:2012年1月30日
【發明者】R·R·約卡姆龔巍, S·多勒, R·西勒斯, M·甘地, J·G·佩羅 申請人:麥蘭特公司