植物細胞堆疊的產生和培養方法

植物細胞堆疊的產生和培養方法
【專利摘要】本發明涉及非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞材料的產生和培養，及其積累或收獲所期望的產物的用途。特別地，本發明提供去除了培養基且多孔結構的、非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞材料的產生方法，和所述細胞堆疊的后續維持方法，該方法包括下述步驟：(i)通過從植物細胞懸浮培養物中分離細胞而提供細胞堆疊，其中，使細胞堆疊所包含的液體的含量降低并調整為相當于0.1g～0.9g濕細胞重量/cm3的細胞堆疊密度，從而建立所述細胞堆疊的去除了培養基且多孔結構的性質，以及(ii)將所述去除了培養基且多孔結構的細胞堆疊在非液體環境中以50～100％的相對濕度進行培養。
【專利說明】植物細胞堆疊的產生和培養方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物生物【技術領域】。特別地，本發明涉及非組織多層細胞堆疊形式的 植物細胞材料的產生和培養，及其積累或收獲所期望的產物的用途。

【背景技術】
[0002] 在過去的十年里，一直致力于建立和培養用于積累和收獲天然或異源蛋白質和次 生代謝物的以植物為基礎的系統。文獻提供了大量的證據材料，證明利用以植物為基礎的 系統產生各種所期望的物質，該所期望的物質或是被分泌到培養基中，或是從生產的細胞、 組織、細胞器、甚至整個植物或植物的一部分中被分離出來。同樣存在大量的轉化方案，以 確保建立穩定轉化或瞬時轉化的植物材料。然而，仍需要可靠、相對合算且快速的技術以從 植物細胞高收率地獲得所期望的產物。
[0003] 因此，本發明提供一種以植物為基礎的系統，以產生高水平的所期望的天然或重 組產物，該系統利用來自植物細胞懸浮培養物的細胞并克服了現有技術中的問題，特別是 對于培養和后續處理中處理大量培養基的需要，該系統包括產品的去除、提取和純化。
[0004] 相應地，本發明涉及天然或重組蛋白質和代謝物的表達或產生，并且使用由通常 建立的植物細胞懸浮培養物作為生產宿主而得到的特定植物細胞材料。
[0005] 與目前使用和開發的以使用完整植物或至少完整的分化植物組織為基礎的眾多 系統不同，利用懸浮細胞具有能夠在可控（controlled)、無菌的受控（contained)條件下 可重復地產生均質材料的優點。
[0006] 目前，在植物中表達重組蛋白有兩種主要的策略，即，（i)生產穩定的轉基因植物 或懸浮細胞株，或（ii)在用細菌（例如農桿菌）、病毒（例如煙草花葉病毒、馬鈴薯病毒X/ Y、5[豆花葉病毒等等）或二者組合（例如侵染（magnifection))感染植物表達宿主（植物、 組織或細胞）使宿主能夠表達異源遺傳信息（DNA或RNA)后，瞬時表達異源基因。
[0007] 雖然本發明也包括穩定轉化的植物細胞材料的用途，但是用于瞬時表達的系統具 有速度優勢（基因到產品、搶占市場、緊急應對）以及有可能達到比通常穩定轉化的轉基因 植物或其部分（如細胞）能夠獲得的高得多的積累水平。
[0008] 根據優選實施方式，本發明結合了植物懸浮培養物的固有優點和瞬時表達系統的 優點。
[0009] 已經嘗試并公開了將農桿菌加入到植物懸浮培養物中，接著在懸浮物中進一步培 養植物細胞和細菌的方案（參見US 6740526B1)，但所述方法的轉化效率低。此外，除非采 取有效的措施，例如使用抗生素殺滅細菌或使用營養缺陷型菌株抑制生長，農桿菌會迅速 地長得超過植物懸浮細胞。其他人描述了共培養的細菌對植物懸浮細胞的直接有害作用 (細胞死亡，過敏性反應）。結果，目前尚不存在以植物為基礎的生產系統，其結合完整植物 或組織的瞬時農桿菌滲入/病毒感染的效率和植物懸浮培養物的優點，使得能夠優選在無 菌可控條件下生產均質的生物質，這是建立符合GMP標準的生產的巨大優勢。如上所述，US 6740526B1中公開的共同發酵方法存在轉化效率低和伴隨細菌過度生長的問題，盡管以葉 為基礎的系統實現高轉化效率，但是，在擴大規模方面遭遇問題，存在初始生物質生產的時 空產率低、且依賴于在可控但并非無菌的條件下生產植物生物質的問題。與微生物系統相 比生產成本高是這些系統沒有得到廣泛關注和作為生物制品的生產系統使用的主要原因。 因此，研究和開發著眼于速度和生產魯棒性（production robustness)的綜合優勢是很重 要的更專業應用，即緊急應對（如流感疫苗，新出現的疾病，個體化用藥等）。本發明處理并 解決了這些問題，并且提供用于操縱任何指定植物宿主材料的遺傳背景的改進手段。


【發明內容】

[0010] 根據本發明，提供用于去除了培養基且多孔結構的非組織多層細胞堆疊形式的植 物細胞材料的產生以及所述細胞堆疊的后續維持的方法，該方法包括下述步驟：（i)通過 從植物細胞懸浮培養物中分離細胞而提供具有多孔結構的細胞堆疊，其中，使細胞堆疊所 包含的液體的含量降低并調整為相當于〇. lg?〇. 9g濕細胞重量/cm3、優選0. 2g?0. 85g 濕細胞重量/cm3、更優選0. 4g?0. 8g濕細胞重量/cm3的細胞堆疊密度，從而建立所述細胞 堆疊的去除了培養基且多孔結構的性質；以及（ii)在提供足夠的濕度（例如50?100% 的相對濕度）以防植物材料嚴重脫水的同時，在非液體環境中于維持或恢復所述細胞堆疊 的多孔結構的條件下培育或培養所述去除了培養基且多孔結構的細胞堆疊。
[0011] 本領域技術人員已知，組織內的細胞通常緊密相連，通常分化并經常呈現出特定 形態和極性的細胞。此外，組織內的細胞通常具有相對于彼此的特征定位。
[0012] 相反，本發明的細胞堆疊是由植物細胞懸浮培養物產生的。植物細胞懸浮培養物 的特有性能是單個細胞或一些細胞的聚集體相對于彼此移動或可移動，并沒有表現出更高 的組織水平。
[0013] 因此，本發明的細胞堆疊包括彼此間沒有特定的相對定位的單個細胞和細胞簇。 這些細胞按所得集合體堆疊成具有大量氣隙的三維多孔結構的方式鑄型（cast)。在細胞堆 疊密度和氣隙存在之間有明顯的相關性。氣隙因為以下幾個原因而非常重要。首先，能夠 進行有效率的氣體交換，從而可以容易地將足夠量的氧氣提供給細胞。其次，氣隙可以暫時 性且容易地再次被液體（處理）充滿。這種暫時的處理可用于使各種試劑與細胞堆疊的所 有細胞緊密接觸，從而提供有效率的遺傳轉化方法、生物轉化方法、通過洗脫或清洗細胞堆 疊而回收產物的方法，以及為診斷目的利用底物或分解物（例如以細胞堆疊為基礎的免疫 測定）。重要的是這些處理都只是暫時的，以及重新構筑細胞堆疊的多孔結構，并確定細胞 堆疊的密度以確保在后續培育步驟中的高生存能力。由于細胞堆疊的多孔性，在某些應用 中更重要的是濕度足夠高，以防止細胞堆疊因為在細胞/氣隙的界面與氣相接觸的表面積 大而變干。
[0014] 特別是本發明方法的優選實施例包括（i)第一培養步驟，優選在受控和/或無 菌的條件下，對植物細胞懸浮物進行培養，以提供均勻的植物生物質，（ii)分離步驟，將液 體培養基從植物細胞中分離出來，生成密度在0. 1?〇.9g濕細胞重量/cm3之間、優選在 0. 2?0. 85g濕細胞重量/cm3之間、最優選在0. 4?0. 8g濕細胞重量/cm3之間的多孔細胞 堆疊，以及（iii)第二培養步驟，在非液體環境中受控條件下將細胞堆疊進一步再培育（見 上文）至少一天。根據實際情況和實際操作者的意圖，可以將第二培養步驟進行幾天。第 二培養步驟通常進行2?7天，優選3?5天。
[0015] 在當前最先進的所有培養方法中，植物細胞材料都是連續不斷地（亦即大部分時 間）與含有培養基的營養物直接或間接（多孔載體或膜介導）接觸。連續的培養基接觸僅 在細胞從一個培養基轉移到另一個培養基時才會短暫（即短時間）地中斷。可以對細胞進 行過濾或清洗以移除"舊的"培養基，但隨后迅速轉移到新的培養基中。
[0016] 與現有技術相比，培養步驟是在保持細胞的生存能力、并以降低的或最小的細胞 生長和分裂促進產物積累的條件下進行的。通過在潮濕的環境中、優選不接觸成分或營養 物從其中擴散到細胞堆疊的液體或凝膠化的生長培養基地培育良好地通氣的堆疊細胞而 實現的（US2002/092037A1，W02005/103271A1)。在現有技術中，細胞薄層被鋪板或點樣在 放置于培養基中的支持（supportive)膜以給細胞提供營養物。然而，在生長培養基中培養 細胞層具有因為需要接觸該培養基，所以只有少量的生物質能夠被處理的缺點。與此相反， 本發明的細胞堆疊方法不依賴于支持培養基，是可擴展的，因此適合于工業應用。因此，上 述培育或培養步驟（ii)在非液體環境中進行，優選不將去除了培養基的多孔結構細胞堆 疊置于（液體或凝膠固化的）維持或生長培養基或與之有任何接觸。
[0017] 根據本發明方法的優選實施例，第二培養步驟進行數周或數月。在這樣的情況下， 可能必須調整培養條件以維持細胞的生存能力。可以通過例如短暫地（即，至多3小時、優 選至多1小時的一段時間）給細胞堆疊提供營養物質和/或降低培育溫度而實現。
[0018] 在現有技術中，懸浮培養物用于積累所期望的產物，該所期望的產物保留在由培 養物組成的細胞內或被分泌到培養基中。當生產周期結束后，細胞被破壞以收獲積累的產 物或被丟棄。懸浮物（例如浸沒在液體培養基）中的穩定轉化的植物細胞已被用于生產廣 泛的不同的治療性重組蛋白（S.Hellwig等，"用于生產重組蛋白的植物細胞培養物"，自然 生物技術 22 :1415 ?1422, 2004 年（S.Hellwig et al·，"Plant cell cultures for the production of recombinant proteins"，Nature Biotechnol22:1415-1422,2004))〇
[0019] 根據本發明，包含懸浮培養物的細胞被用于產生由具有上述特定密度進一步限定 的多孔結構細胞堆疊形式的培養基被去除的非組織植物細胞材料。可任選地以使用者定義 的形狀來提供的細胞堆疊可被看作是由已經生長在液體培養基中的未分化的植物細胞構 成的人工生成的多層細胞集合體或細胞餅。源細胞可以是能夠積累所期望的產物的、穩定 和/或瞬時轉化的轉基因細胞、突變細胞或野生型（原生）細胞。通過在移除大部分周圍 的液體培養基的同時，將細胞懸浮物鑄型成細胞堆疊結構，產生三維多孔植物細胞材料。雖 然優選通過過濾器的真空過濾、壓濾、離心分離之類過濾技術，但是只要確保上述細胞堆疊 密度，就也可以通過本領域已知的其他方式（例如，在食品工業中使用的分離器，連續離心 分離）移除液體培養基。建立、維持和/或重建細胞堆疊所包含的單個細胞或細胞簇之間 的氣隙提供了確保良好通氣（氣體交換）的細胞堆疊的多孔結構，對堆疊的植物細胞材料 在第二培養階段的生存能力和生產率來說，這是關鍵因素。在本發明的上下文中，該培養條 件不包括在固化（凝膠化）或液體的培養基中、在懸浮物中或與可能妨礙上述必需的通氣 的任何液體環境接觸的下培養細胞堆疊。因為所述培養實質上是在沒有任何包圍所述細胞 堆疊所包含的每個細胞的培養基或液體的條件下進行的，所以必須確保足夠的相對濕度。 本領域技術人員可以理解，細胞堆疊的密度（g濕細胞重量/cm 3)、液體含量與通氣（由足夠 量和足夠體積的氣隙的結構決定）之間存在嚴格的相關性。然而，如將在下面更詳細地解 釋，通氣的細胞堆疊可（暫時地）通過與小體積的轉化載體或物質、包括但不限于營養物、 底物、激素、酶、代謝物和前體接觸而處理。在上下文中，"暫時地"意味著，在長期（即數周 或數月）培育過程中包括提供營養物質的處理僅在短期內（最多3小時，優選最多1小時） 進行，隨后再次撤掉該液體培養基并重建多孔細胞堆疊的氣隙，得到本文所定義的細胞堆 疊密度。
[0020] 因此，根據本發明的方法任選包括在分別包括或代表生物體、化學物質和/或生 物物質或分子的氣體、蒸汽、薄霧、粉塵和/或氣霧劑等的存在下培養細胞堆疊，。
[0021] 根據優選的實施方式，包含細胞懸浮培養物的細胞是原生（例如野生型）細胞或 者非轉基因細胞，在進行第二培養步驟之前，該細胞與至少一種表達載體轉化，該表達載體 包含至少一種異源核酸序列，該異源核酸序列優選被可操作地連接到功能性啟動子，其中， 所述至少一種異源核酸序列對在本發明方法的步驟（ii)中積累和收獲的所期望的產物進 行編碼。
[0022] 本文所用的術語"轉化"是指將任何核酸或核酸類似物傳遞到植物細胞中。在轉 化后，核酸可以穩定地整合到宿主細胞的基因組中。或者，被傳遞的核酸可以不被整合到基 因組中，并可以對細胞溶質或細胞核或任何細胞器發揮其作用。
[0023] 核酸可以是自主復制要素（element)，諸如類病毒、病毒或解構病毒，或者由一個 以上病毒得到的必需要素組合。或者，傳遞的核酸可以僅是自主復制要素、諸如類病毒，病 毒或解構病毒的一個組成部分。其他組成部分可以由宿主細胞或轉基因宿主細胞提供/補 充。
[0024] 本文所用的術語"異源"是指所討論的核苷酸的基因/序列已通過基因工程被引 入到植物細胞中。異源基因可以增強內源性等效基因、即通常發揮相同或類似功能的基因 向目標蛋白質的表達，或插入的序列可以對內源基因或其他序列進行補充。另一種可能性 得到被放置在天然存在該核酸序列或其同源物的培養靶細胞內的核酸序列，在其中核酸序 列被連接和/或鄰接到不會在細胞或者該類型或物種或品種的植物的細胞內自然產生的 核酸以控制表達，如可操作地連接到一個或多個調控序列，如啟動子序列。另一種可能性是 得到通過反義和/或沉默（作為要實現的結果的所期望的產物）誘導現有基因沉默的核酸 序列。另一種可能性得到具有調節功能的核酸，如miRNA(期望的產物）。另一種可能性是 得到為核酶或適體（所期望的產品）的核酸。
[0025] "載體"被定義為包括雙鏈或單鏈線型或環型的任何質粒、粘粒、噬菌體或病毒載 體及其他，它們能或不能自我傳播或移動，可以轉化原核或真核宿主，并存在于染色體外 (如帶復制原點的自主復制質粒）。
[0026] "表達載體"是指核酸處于控制之下并且被可操作地連接于用以轉錄到宿主細胞 (例如微生物或植物細胞）中的適當的啟動子或其他調節元件的載體。載體可以是在多個 宿主中發揮功能的雙功能表達載體。在基因組或亞基因組DNA的情況下，可能包含它自己 的啟動子或其它調控元件，在cDNA的情況下，可以處于用以在該宿主細胞中表達的適當的 啟動子或其他調控元件的控制之下。"可操作地連接"是指作為同一核酸分子的一部分加 入、適當地定位和定向，以使轉錄從啟動子開始。
[0027] "生物載體"是能夠轉化植物宿主細胞、即能夠將核酸傳遞進植物細胞的任何微生 物或病毒。"生物載體"的例子是感染性微生物（例如屬于放射形農桿菌和根瘤菌的微生 物）或病毒（例如煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒和豇豆花葉病毒）。更具體地，農桿菌是"生 物載體"。
[0028] 對于細胞轉化，將生物載體的懸浮物或含有遺傳信息的不同的生物載體的混合物 施加到如上文所述地產生的細胞堆疊中。該載體感染植物細胞，并傳遞遺傳信息。由于細 胞堆疊形式的植物細胞材料的海綿結構，載體僅通過毛細管力即可進入各個靶細胞，無需 必須將細胞送達所需的完整葉片或植物的注射或真空浸潤之類特別的處理。而且，該細胞 堆疊的松散多孔結構可獲得載體能夠進入的大表面積，因此可實現高轉化效率。這一點不 同于細胞具有更緊密的細胞間接觸而限制載體接觸細胞表面、導致較低的轉化效率和產物 積累的愈傷組織材料和分化的植物組織。通常情況下，細胞堆疊內的50%以上的細胞被轉 化，遠高于現有技術。雖然U.S. Pat. 6, 740, 526 B1中沒有報道詳細的轉化效率數據，但是 已經發現該專利所公開的方法比本發明的細胞堆疊方法差（例如參見實施例1，圖6C，6D)。 這一發現還可以被能獲得10?100倍的抗體產量這一觀察結果支持（參見例如實施例1)。 該載體懸浮物可以容易地應用，例如通過簡單的滴加或噴霧。然而，更大和/或更厚的細胞 堆疊和某些使用者定義形狀可能需要真空或壓力輔助應用并移除生物載體懸浮物以達到 此處定義的所期望的細胞堆疊密度。與葉片組織的真空輔助浸潤相比，所述方法的優點是 過量的生物載體懸浮物可被移除并再利用，并且可以立即重新建立細胞堆疊的多孔性。被 浸潤的葉片的生存能力顯著依賴于過量液體的攝取和/或移除以恢復細胞間隙中的氣相。 因為這是很難控制的，所以使得葉片組織的真空輔助浸潤的易變性和失敗率高。考慮到具 有操作、自動操作、限控、擴大規模以及廢物的產生和移除這幾個實際的優點，優選的實施 方式是將載體懸浮物施用于細胞堆疊。或者，可以在形成細胞堆疊之前，將植物細胞的懸浮 物與載體懸浮物混合。氣隙的恢復和滲入了農桿菌之類生物載體的細胞堆疊的培養基被去 除的培養確保微生物載體不會因它們的過度生長而破壞植物細胞。
[0029] 可以代替生物載體懸浮物，使用含有核酸或核酸類似物的溶液、或顆粒的懸浮物、 或被覆有或含有核酸的乳液。
[0030] 應用生物載體后，在受控條件下，將細胞堆疊培育或培養一定時間，使該植物細胞 堆疊通過恢復各個細胞或細胞簇之間的氣隙而重建其多孔結構，并允許植物細胞表達重組 蛋白，從而積累所期望的產物。培養條件（如時間、溫度、濕度、光強度）可以容易地調整為 有利于特定的所期望的產物的合成。無需特殊的設備來支撐細胞堆疊，廉價的一次性塑料 托盤就足以對它們進行保持。在培養的第一個周期，通過蒸發和吸收施加有生物載體的液 體進行氣隙重構。或者，通過真空或壓力輔助的方法移除過量的液體而進行氣隙重構。培養 完成后，收獲該細胞堆疊，并通過應用本領域已知的適當的純化方法從生物質中分離/隔 離產物。在分析或診斷結果顯示就是所期望的產品的情況下，也可在培育/培養期間進行 收獲。整個過程可以自動操作，并且可以很容易地擴大規模或縮小規模。這個易于設置且 不復雜的方法使得設計高度可控的工藝以滿足GMP要求和/或高流通量的應用和/或工業 規模生產是可行的。
[0031] 該方法特別適用于對人體、動物和/或環境有害的產品，因為整個過程可以在完 全封閉的條件下進行，因此提供高生物安全性。還適用于在生產工藝中所用的化合物、載體 和/或核酸。
[0032] 本文所用的"收獲"一詞應理解為包括基于所期望的產物的表達和積累的任何行 動。除了包括上述所期望的產物的分離/隔離的收獲，收獲一般還涉及獲得基于天然或重 組積累的所期望的產物的任何診斷或分析結果。本領域技術人員清楚在這些情況下，可以 排除所期望的產物本身的分離/隔離。
[0033] 或者，也可以由含有轉基因細胞的懸浮培養物生產細胞堆疊，以增加所期望的產 物（例如重組蛋白質，代謝物）的生產，例如，通過提供復制系統或代謝途徑的一個元件或 通過下調某宿主因子來實施。
[0034] 進一步地本發明提供去除培養基、多孔結構非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞 材料，密度在〇. lg?〇. 9g濕細胞重量/cm3之間、優選在0. 2g?0. 85g濕細胞重量/cm3之 間、最優選在〇. 4g?0. 8g濕細胞重量/cm3之間，是由本發明公開的方法獲得的或可由本 發明公開的方法獲得的。換言之，本發明提供培養基被去除的、多孔結構非組織多層細胞堆 疊形式的植物細胞材料，密度在0. lg?0. 9g濕細胞重量/cm3之間、優選0. 2g?0. 85g濕 細胞重量/cm3之間、最優選0. 4g?0. 8g濕細胞重量/cm3之間。
[0035] 細胞堆疊還可以作為載體懸浮物的補充或代替載體懸浮物，用前體、誘導劑、激 素、穩定劑（例如相容性溶質）、抑制劑、RNAi/siRNA分子、信號化合物、酶（例如果膠酶）和 /或激發子處理，或在前體、誘導劑、激素、穩定劑（例如相容性溶質）、抑制劑、RNAi/siRNA 分子、信號化合物、酶（例如果膠酶）和/或激發子的存在下培養，以生產重組和/或內源 (天然）蛋白質或代謝物。
[0036] 在本發明的【具體實施方式】中，所采用的物質誘導包含在細胞堆疊中的未分化細胞 分化。可以通過例如應用激素或特定的激素組合，或通過轉化帶轉錄因子的細胞而實現。
[0037] 細胞堆疊可以反復使用任何系列的載體懸浮物、核酸溶液或前述物質和/或載體 懸浮物、核酸溶液或前述物質的組合進行處理。這意味著基本上只要在每次處理后細胞堆 疊的多孔性被維持且氣隙得到恢復，本發明的方法就能夠反復實施。尤其是還包括使用不 同載體懸浮物的混合物來同時共轉化具有不同核酸的細胞堆疊的細胞。
[0038] 細胞堆疊還可以包含不只一個不同種類的細胞和/或不同的克隆和/或不同的轉 基因細胞株和/或非轉基因細胞株。此外，異質性細胞堆疊還可以包含來自不同物種甚至 生物界（kingdoms)的細胞，基本上使用植物細胞作為共培養的其它細胞（例如酵母、真菌、 動物和人類細胞）的多孔支撐。
[0039] 在本發明的另一個優選實施方式中，多孔細胞堆疊被用作可繁殖性高且評價共培 養生物體的生長和/或生存能力的均勻分析支撐，其中，所述評價用于表征所期望的產物。 優選該細胞堆疊用于測試和/或篩選由細胞堆疊產生的分子（代謝物、肽和/或蛋白質） 對共培養生物體的活性。此類分析通常包括以下步驟：（1)產生本發明的多孔性細胞堆疊， (2)將化合物、載體和/或核酸添加到細胞堆疊中，可選地將所述細胞堆疊培養適當的期 間，（3)對所述多孔細胞堆疊的選擇區域接種第二生物體，（4)在使第二生物體生長的條件 下培養被接種的多孔細胞堆疊，（5)在合適的培養時間后評價在細胞堆疊中合成的產物對 第二生物體、例如對生長和/或生存能力的作用（所希望的產物）。如果使用例如轉基因懸 浮細胞株，則第二工序可以省略。
[0040] 因此，本發明提供了通過本文所公開的方法獲得或可獲得的、和/或具有上述定 義的密度的植物細胞材料在分析或診斷目的方面的應用。例如，可以在待分析或診斷的生 物體或物質的存在下培養細胞堆疊所包含的細胞。因此，本發明還提供了包含如本文所公 開的培養基被去除的多孔結構非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞材料的診斷或分析工 具。
[0041] 相應地本領域技術人員容易理解本發明的細胞堆疊也可用于檢測與細胞堆疊 接觸的樣品中的分析物（"處理"）。另外，用含有感興趣的分析物的樣品處理細胞堆疊 只是短暫地、即在短時間（最多3個小時）內進行。處理后，氣隙已經再次被重建，S卩，必 須恢復細胞堆疊的相應密度和孔隙率。然后，在沒有與任何液體或凝膠化/凝固的培養 基（供給營養物）連續接觸的情況下對細胞堆疊進行培養。存在于樣品中的分析物可 能誘發信號轉導、基因表達或導致細胞堆疊的可測量性變化或細胞堆疊所含的細胞的操 控（manipulation)的任何其他事件。可測量的變化或操控包括但不限于熒光報告蛋白 (fluorescent reporter protein)、突光報告分子（fluorescent reporter molecules)、 酶、導致細胞死亡、產生自發熒光的改變、可以通過用另外的試劑分析該細胞堆疊或培育該 細胞堆疊揭示的生理學或形態學變化，該試劑直接在細胞堆疊或洗出液、提取物或由細胞 堆疊衍生的其他樣品中產生可檢測的信號。應當理解的是，野生型和基因重組植物細胞都 可以使用，包括穩定的轉基因細胞和瞬時轉化細胞。特別是后者可以通過對由野生型細胞 產生的細胞堆疊的前一個轉化處理而得到。
[0042] 本發明的細胞堆疊非常適合于不同類型的操控。與懸浮物中的細胞或原生質體細 胞相比，細胞堆疊中的細胞的密度高。因此，可以更經濟地以獲得相同的有效濃度所需的較 低值施用化合物（例如生產代謝物的誘導子）。此外，可施用高度濃縮的物質，這對生物轉 化極其有用。與完整的植物相比，植物組織和/或愈傷組織的一個優點是較大的可進出細 胞表面積，這得自于細胞堆疊的多孔疏松結構及其松散的細胞接觸。相比懸浮培養物和完 整的植物組織，物質可以更容易且有效地施用于細胞堆疊并從細胞堆疊中移除。例如，前體 或有毒的化合物可以僅短期施用，并進行脈沖追蹤實驗。誘導劑可以以更可控且適時地定 義的方式施用，從而允許最優基因表達和其它產品積累條件的進一步細化。一系列的前體 和底物可以順序地施用以實現完整轉化，并闡明代謝途徑。進而，所積累的分泌產物可以通 過用合適的緩沖溶液簡單地清洗細胞堆疊而收獲。有趣的是，這能夠實現產品的重復移除 ("榨取")，以避免產物降解和/或反饋抑制。這種策略也可用以避免和/或減少對宿主細 胞的不利影響，從而將工作效率最大化。
[0043] 向細胞堆疊提供揮發性物質、包括營養物（例如氨、羧酸、二氧化硫、硫化氫、膦類 和有機胺）與現有系統相比也有幾個優點。以氣態形式向懸浮細胞培養物傳遞這類物質 是難以實現的。首先需要將該氣體溶解在溶液中，工藝受到溶解度和運輸的限制。當使用 完整的植物和植物組織時，運輸再次構成問題，但更重要的是，需要使用和控制更大的培育 量。雖然已經為了研究目的而小規模地進行了實施，但是大規模的工業應用通常過于昂貴。 此外，如果產品本身是揮發性化合物，可以利用控制氣壓來積累和/或收獲產品。在此，t匕 懸浮細胞培養物更高的細胞密度（即每單位體積的細胞）和使用者定義形狀的可行性和幾 何形狀提供了唯一的工藝設計可能性，例如低壓培養，這在任何現有生產系統中都是不可 能的。因此，本發明為這些類型的應用提供了經濟且可擴展的方法。
[0044] 或者，溶解的化合物可以被傳遞到氣溶膠和/或霧和/或蒸汽形式的多孔細胞堆 疊中。這種傳遞模式對懸浮細胞來說是不可能的。該模式被用于完整植物，但是，大部分被 施加的化合物并沒有到達其目標，需要更高的劑量、體積和處理次數。化合物透過角質層的 吸收非常有限，要通過氣孔傳遞。因此，這種應用被限制為高效的化合物。在此，本發明提 供了將顯著數量的幾乎任何化合物有效率地傳遞給細胞堆疊的途徑。
[0045] 擴大規模可以通過并行化容易地實現，S卩，通過簡單地生成所需數量的細胞堆疊。 或者，擴大規模也可以通過使用適當尺寸的大細胞堆疊或片材、細胞柱（columns)或類似 的三維結構而實現。
[0046] 細胞堆疊的垂直尺寸僅受到在堆疊的底部作用于細胞的力和所獲得的孔隙的壓 實程度的限制。但是，這個問題可以通過使用中間支撐體得到解決。因此，本發明細胞堆疊 的典型垂直尺寸范圍為幾毫米（即3?5_)到幾厘米（即3?15cm)或更大。橫向尺寸 沒有限制。尺寸可為1〇_ 3?10m3。必須確保充分的通氣/氣體交換，以便例如維持適當 的氧氣和二氧化碳的含量。揮發性的初級和次級代謝物的積累也必須被控制，因為例如高 含量的乙烯可能對細胞是有害的。對于厚度小的細胞堆疊（約3?5cm)，通過擴散進行氣 體交換通常是足夠的。較厚的細胞堆疊可能需要積極的通氣和/或整合額外的空氣通道。 在這方面，本發明提供了獨特的解決方案，因為該懸浮物細胞可以被鑄型成幾乎任何使用 者定義的形狀。
[0047] 根據優選的實施方式，所期望的產物選自內源性（即天然）和異源蛋白質或多肽、 次生代謝物、標記物和分析/診斷結果。
[0048] 感興趣的基因包括編碼本身是天然藥物（例如藥品或獸藥產品）的蛋白質的基 因。
[0049] 異源核酸可以編碼細菌、真菌、植物、非植物或動物來源的基因及其他。可以在本 發明的工藝中制備的蛋白質包括異二聚體（例如FSH)、免疫球蛋白、融合抗體、單鏈抗體和 其他抗體形式或衍生物。
[0050] 這樣的蛋白質包括但不限于視網膜母細胞瘤蛋白、p53、血管抑素和瘦蛋白。同樣 地，本發明的方法可用于生產哺乳動物調節蛋白。其它感興趣的序列包括蛋白質、激素（例 如促卵泡激素）、生長因子、細胞因子、血清白蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白、索馬甜、索馬甜樣 蛋白、表皮生長因子（例如VEGF)、胰島素、單體或二聚體或分泌型免疫球蛋白A、轉鐵蛋白 或轉鐵蛋白融合蛋白，以及受體（例如⑶16、⑶32、⑶64、⑶89、新生兒Fc受體）。
[0051] 本領域技術人員可以理解本發明能夠生產多種所期望的產品，例如蛋白質和多 肽，包括藥物相關的（重組）蛋白（例如疫苗、抗體、治療性酶、變應原和低變應原、抗菌 肽、結構蛋白（例如用作生物相容性涂層材料的彈性蛋白和膠原蛋白）、病毒樣顆粒、蛋白 體等），有營養價值的（重組）蛋白（食品和飼料添加劑），用于診斷用途的（重組）蛋白 (例如酶、抗體和工程抗體、其他酶或熒光融合蛋白、被用作陽性對照的抗原、蛋白質陣列的 結合配體），以及技術相關性（重組）蛋白（例如親和吸附劑的結合配體、高值酶、生物催化 劑）。
[0052] 因此，本發明還提供用于生產優選選自天然或異源蛋白質或多肽、次生代謝物、標 記物和分析/診斷結果的至少一種所期望的產品的方法。該方法包括：從植物細胞懸浮培 養物中生成培養基被去除的多孔結構非組織多層細胞堆疊，其密度為〇. 1?〇. 9g濕細胞重 量/cm3,優選為0. 2?0. 85g濕細胞重量/cm3,最優選為0. 4?0. 8g濕細胞重量/cm3,向細 胞堆疊施加適合于誘導或調整所期望產物的生成的溶液、懸浮物和/或氣體，將細胞堆疊 密度調整到上述范圍內，根據需要，將該細胞堆疊在50?100%的相對濕度下培養，使細胞 堆疊產生并積累所期望的產物。任選地，該方法還包括從細胞堆疊所包含的生成細胞中收 獲或隔離積累的所期望產物。
[0053] 本發明的基于細胞堆疊的系統也適合作為用于分子進化、蛋白質工程、代謝工程 和合成生物學應用的篩選平臺，其中包括將使用或將要使用的基因表達盒、質粒等優化。進 而，通過使用本文所述的細胞堆疊，本發明提供用于以高通量、高重現性和自動化的方式評 價基因表達構建體和工程化靶蛋白的分析方法。根據本發明和前面提到的內容，這些應用 的目標是收集代表例如在第二培養期"收獲"的所期望的產品的信息和結果。
[0054] 另一方面，本發明提供通過所涉及的酶的瞬時表達操控蛋白質翻譯后修飾的方 法，可以實現例如糖蛋白的糖基化模式的修飾。進而，可以通過沉默（例如糖基轉移酶、蛋 白酶、泛素連接酶）使內源酶發生基因沉默，以影響產品的質量和數量。
[0055] 此外，本發明提供一種通過所涉及的途徑酶和/或它們的轉錄因子的瞬時表達生 產次級代謝物作為所期望的產物的方法。生化途徑也可以通過經由相應的酶的沉默而阻斷 競爭途徑和/或分解代謝以實現操控。同樣地，本發明的系統非常適于通過如本文所述地 生成及培養細胞堆疊對由未做基因性修飾的（天然）細胞培養物生產代謝物加以改進。最 后，本發明也可用于在相應誘導劑的存在下培養由內含組成型啟動子和/或誘導型啟動子 的轉基因懸浮細胞株產生的細胞堆疊。
[0056] -般來說，異源核酸可以通過本領域中使用的任何合適的工藝表達，或者它們也 可以被如下地轉錄或表達：
[0057] ⑴例如含有被可操作地連接到感興趣的異源序列的啟動子的"裸"DNA的瞬時表 達；
[0058] (ii)由表達載體、例如復制載體表達。一般來說，本領域技術人員完全能夠 構建重組基因瞬時表達的載體和設計方案。可以選擇或構建合適的載體，該載體含有 合適的調節序列，包括啟動子序列、終止子片段、多聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記 物基因和其它合適的序列。更多詳情請參見例如Molecular Cloning:a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. , John ffiley&Sons, 1992 ；
[0059] (iii)由非整合載體表達；
[0060] (iv)由被傳遞的T-DNA表達。
[0061] 應當理解這些分類并不相互排斥，例如，非整合載體也可以是表達載體等。
[0062] 用于實現這樣的表達的方法在本文的其他部分討論。
[0063] 構建體可以被引入相對高拷貝數的強啟動子，并不發生在選擇構建體被整合進基 因組的穩定轉化體時可能發生的固有的慢化效應（moderating effect)。結果，生成的蛋白 質的含量和濃度遠超過通過使用現有技術（轉基因懸浮培養物或懸浮物中的瞬時表達）中 的基于植物細胞的系統的蛋白生產方法能夠獲得的蛋白質的含量和濃度。
[0064] 因此，本發明的一個實施方式中公開了能夠產生編碼靶蛋白的mRNA的瞬時轉化 植物細胞，該靶蛋白由所引入的核酸構建體轉錄得到，該核酸構建體包含被可操作地連接 到啟動子的靶核苷酸序列。
[0065] 因此，"被引入的核酸"作為DNA序列包括以構建體形式提供的異源核酸序列，其能 夠相對于通常與所述DNA序列的穩定的轉基因表達相關聯的蛋白質生廣水平，以提商了的 水平，增加胞外蛋白的生產。
[0066] 因此，在本發明的優選實施方式中，公開了一種在植物細胞堆疊中實現異源核苷 酸序列的表達的方法，該方法包括至少將包含異源核苷酸序列的第一核酸序列引入靶細胞 的步驟。
[0067] 在一個實施例中，提供了產生至少胞外異源蛋白質的方法，該方法包括以下步 驟：
[0068] (i)將包含編碼異源蛋白質的核苷酸序列的第一核酸瞬時導入細胞堆疊所包含的 靶細胞，
[0069] (ii)通過提供適當的培養條件，使得或允許核酸在一段時間內表達異源蛋白質，
[0070] (iii)從產生的細胞中收獲積累的異源蛋白質。
[0071] 可以通過完全傳統的方法隔離，并且進行或不進行部分或完全純化。
[0072] 細胞堆疊的培養時間可以是達到甚至超過細胞材料保持活力的任何期間，或直至 產物飽和；一般優選為約1?10天，更優選為約1?6天。
[0073] 本領域技術人員當然能夠認識到可以將一個以上的基因用在該構建體或每個構 建體中。多個載體（每個都包括編碼所選擇的異源蛋白質的一個或多個核苷酸序列）可以 被引入到此處或本文其他部分描述的靶細胞中。這會有助于生產例如酶的例如多個亞基、 或例如生化途徑的多種酶。這也會有助于例如同時敲除內源基因，例如通過siRNA介導的 基因沉默和/或敲入異源酶對產品進行翻譯后修飾和/或標記物的表達和/或相同或不同 類型的多種產物的生產。
[0074] 如下面的例子所示，以這種方式引入的異源序列的瞬時表達可在第二次培養期的 整個過程中提供高水平的靶多肽，第二次培養期通常是幾天，取決于所使用的精確的方法 和材料。通過使用如本文中所述的本發明方法，獲得異源多肽的積累。
[0075] 因此，在細胞堆疊所包含的細胞中的瞬時表達代表在很多情況下都有用的工具， 它在以前可能被認為是不合適的，例如不穩定的可靠表達，也就是細胞內積累的瞬時表達 的異源蛋白質或多肽序列。
[0076] 該方法在需要高水平的表達、但不希望有病毒構建體（對植物而言是"感染"）或 穩定的轉基因植物的應用中是特別優選的，例如快速檢測是非常重要的或者有問題的序列 意味著致命的或不希望的表型的應用。
[0077] 報告子可以是任何可檢測的蛋白，例如本領域中常用的標記物基因（例如GUS)、 熒光蛋白（例如GFP或DsRed(紅色熒光蛋白）、熒光素酶）等等。優選報告子是非侵入性 標記物，例如DsRed或熒光素酶。根據本發明的另一實施方式，由本文所述的本發明方法得 到的或能夠得到的、培養基被去除的非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞材料被用于分析 目的。例如，可以將細胞堆疊所包含的細胞在待分析物質的存在下培養。例如，由含有篩選 標記物基因（GFP(綠色熒光蛋白）、DsRed、熒光素酶、GUS、分泌型堿性磷酸酶或能夠在細胞 內產生可檢測的化合物的酶）被可操作地連接于誘導型啟動子的轉基因懸浮細胞株生成 的細胞堆疊可用于檢測試樣中的誘導劑。可選地，可誘導報道基因表達構建體也可以換成 由野生型（非轉基因）懸浮細胞株在第一步驟中生成的細胞堆疊和然后在第二步驟中分析 的測試樣品。優選在兩個步驟之間有1?5天的培養時間。然后，將合適體積的液體試樣 或非液體檢驗樣品的液體提取物施加于細胞堆疊。重要的是確保在該步驟中細胞堆疊的多 孔結構通過使用適當的測試樣品體積比和適當的細胞堆疊重量，或通過在適當的接觸時間 后移除測試樣品的多余液體而得以維持。適當的接觸時間為1分鐘?2小時，優選為5分 鐘?1小時，更優選為10?30分鐘。液體試樣的合適的體積最多為0. 75ml/g細胞堆疊， 優選為0. 5ml/g細胞堆疊，更優選為0. 4ml/g細胞堆疊。
[0078] 誘導型啟動子的實例包括但不限于雌激素誘導型啟動子、乙醇誘導型啟動子、糖 誘導型啟動子。本領域技術人員也理解使用阻遏物和抑制物的基因電路同樣可以使用。例 如，將四環素結合于tet-阻遏物導致四環素啟動子去阻遏。
[0079] 根據優選的實施方式，因為操作方便、轉化效率高和將核酸和/或化合物傳遞進 入細胞堆疊的細胞的眾多可能性，所以本發明提供非常有助于研究和優化重組活動的方 法。
[0080] 本領域技術人員應當理解，本發明的細胞堆疊優于基于葉片的瞬時系統、液體培 養物中的瞬時系統、野生型和/或穩定的轉基因懸浮培養物和野生型和/或轉基因的整株 植物或部分植物的應用。
[0081] 與本發明相比，基于葉片的瞬時表達系統采用分化的植物組織，該分化的植物組 織包含不同的細胞類型（異源），而已知懸浮細胞是去分化的。相比基于葉片的系統，本發 明提供以下優點：
[0082] ?生物質生產所需的生長設備不占空間；
[0083] ?不依賴于外部氣候條件；
[0084] ?沒有感染植物病原體的危險；
[0085] ?快速提供大量高度均勻的生物質，這對醫藥產品尤其重要（降低調整方面的擔 憂）；
[0086] ?生物質的收獲更容易（無需專用收獲機具）；
[0087] ?因更低的生物質比例而更容易通過冷凍和/或干燥加以保存；
[0088] ?生物質更容易處理，產物更容易純化（木質素少，纖維少，宿主蛋白質少，顏料 少）；
[0089] ?生物質是在高度控制的無菌條件下生產的（降低調整方面的擔憂）；
[0090] ?與整株植物相比有速度優勢，容易擴大生物質的規模（0. 1升初始培養物可以 在15天內按比例擴大在1000升懸浮培養物中獲得100kg生物質；5d2. 5升一5d50升 -5dl000 升）；
[0091] ?更好的時空收率/空間利用率（每平方米生物質；生產和培育通常無需照明，使 得細胞堆疊致密堆積）；
[0092] ?感染相同量的生物質需要更少體積的生物載體懸浮物（與罐浸潤相比更少"浪 費；
[0093] ?全面密封比基于葉片和植物的方法容易實施；
[0094] ?用"細胞堆疊"方法更容易施用細菌或病毒；
[0095] ?在單個細胞中觸發的意外的轉錄后基因沉默僅限于通過胞間連絲連接的少數相 鄰細胞，不會影響全身；
[0096] ?能夠更容易且更經濟地施用其他化學化合物（例如用于代謝物生產的誘導子、 誘導物、激素或前體）；
[0097] ?可以從堆疊的細胞（宿主蛋白少，只能進入完全處理的分泌蛋白）中只洗脫分泌 蛋白；
[0098] ?因封閉也能夠生產危險產品（高生物安全水平）；
[0099] ?能夠高通量篩選（多孔過濾板）；
[0100] ?可實現更靈活的使用者自定義的大小和形狀；
[0101] ?更易控制自動化；
[0102] ?可用于植物病原體或其他微生物的標準化生長試驗的高度均質的植物細胞材料 使高通量篩選和實驗方法設計成為可能；
[0103] ?能同時和/或順序地以單一格式容易地對不同的方法、技術和操控步驟進行組 合。
[0104] 與液體培養物中的瞬時系統相比，優點可以總結如下：
[0105] ?與在生物反應器（搖瓶或發酵罐）中的懸浮培養物或固體培養基上的愈傷組織 生長相比，瞬時傳遞的轉基因的表達增加；
[0106] ?無需控制或抑制細菌生長以避免植物細胞（抗生素、營養缺陷型菌株）的過度生 長；
[0107] ?與生物反應器懸浮物相比，使用"細胞堆疊"得到較高的農桿菌對植物細胞的比 例；
[0108] ?由于細胞堆疊中的細胞沒有被攪動，所以得到更親密的載體細胞接觸，無切斷；
[0109] ?由于在第二培養階段或時期的高濃縮生物質，所以只需較少量的昂貴化合物 (例如用于代謝物生產的誘導劑（乙酰丁香酮）、激素、前體等）；
[0110] ?第二培養階段在用于生產植物細胞的生物反應器外發生。使得能夠例如在第一 培養階段應用連續的發酵策略，以確保懸浮物細胞的持續供給。結果實現對相對昂貴的生 物反應器的更理想且更經濟的使用，并能夠實現更高的生產能力；
[0111] ?由于細胞堆疊的多孔結構，氧供應的限制并不太重要。
[0112] 與使用轉基因植物相比，根據本發明的系統能夠更迅速地恢復所期望的產物，并 提供沒有環境問題或風險的完全封閉體系，確保不與食物鏈混雜。
[0113] 與使用穩定的轉基因懸浮細胞相比，本發明能夠更快速地從基因得到產品，具有 更高的生產率，并能生產可能妨礙穩定轉化的細胞株的再生的有毒產品。
[0114] 將進一步參照以下非限制性的附圖和實施例說明本發明。本領域技術人員可據此 實施本發明的其它實施方式。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0115] 圖1不出由基于pTRA、pUTA和含有帶有不同的革巴信號的不同突光蛋白的序列的 TRB0系列的表達載體得到的T-DNAs。（A)用于分泌型DsRed的表達的pTRAc rfp-AH，（B) 用于ER-保留的DsRed的表達的pTRAc rfp_ERH，（C)用于胞楽DsRed表達的pTRAc rfp-H, (D)用于質體革巴向DsRed表達的pTRAc rTPrfp-H，（E)用于蛋白體革巴向DsRed表達的pTRAkc glyDS-zenH，（F)用于質體祀向GFP表達的pTRAc rTPgfp，（G)用于質體祀向DsRed表達的 pUTA TPrfp，（H)使用煙草花葉病毒復制子使胞漿GFP表達的TRBO-GopTRA的載體骨架基于 pPAM(GenBankAY027531)。pUTA的載體骨架包含來自RK2ori的宿主菌株獨立質粒復制用的 復制起始蛋白trfA。TRBO的骨架來源于pCB301 (GenBank AF139061)。LB和RB表示T-DNA 的左右邊界；SAR表示核基質結合區（scaffold attachment region) ;P和PA表示帶有重 復的增強子和花椰菜花葉病毒（CaMV)的35S基因的終止子的35S-啟動子；CHS表示來自查 爾酮合成酶基因（P.hortense)的5'-UTR;TL表示煙草蝕紋病毒（TEV)的5'-UTR;SP表示 小鼠mAb24的密碼子優化信號肽；TP表示來自H. vulgare的GBSSI的轉運肽；rTP表示來自 S. tuberosum的GBSSI的轉運肽；DsRed表示來自Discosoma sp.的紅色突光蛋白；glyDs 表示帶N-糖基化位點的DsRed變異體；zen表示來自玉米的γ -玉米蛋白的N-末端；GFP 表示來自Aequorea victoria的綠色突光蛋白（S65C突變體，cycle3突變體）；RK2ori表 示復制的廣宿主范圍ori ;bla表示β -內酰胺酶基因；ColElori表示復制的ori (E. coli); His6表示組氨酸標簽；KDEL表示ER-保留標簽；RBS表示核糖體結合位點；Pnos和pAnos表 示胭脂堿合成酶的啟動子和終止子；npt II表示新霉素磷酸轉移酶基因；Replicase表示 煙草花葉病毒（TMV) 126K/183K蛋白；MP表示TMV運動蛋白；Rib表示核酶。
[0116] 圖2示出含有不同抗體的序列的pTRA系列的表達載體的T-DNA區域。⑷共表 達2G12抗體重鏈、2G12抗體輕鏈和質體靶向DsRed的pTRAp2G12F-Ds ; (B)共表達ER-保 留2G12抗體重鏈、ER-保留2G12抗體輕鏈和質體靶向DsRed的pTRAp2G12F-Ds ; (C)共表 達M12抗體重鏈、M12抗體輕鏈和ER-保留DsRed的pTRAk MTAD。SPg表示Ig γ -鏈的信號 肽；2G12HC表示人抗-HIV-lgpl20Ig2G12 γ -重鏈；SPk表示人Ig κ -鏈的信號肽；2G12LCF 表示人抗-HIV-lgpl20Ig2G12 κ -輕鏈；pat表示草胺膦乙酰轉移酶（phosphinothricin acetyltranferase) ;M12HC 表示人 Ig M12 γ -重鏈；M12LC 表示人 Ig M12 λ -輕鏈。（參見 圖1)
[0117] 圖3示出基于含有帶不同靶信號的色氨酸脫羧酶序列的pSS系列的表 達載體 的 T-DNA (S. Di Fiore et al.，''Targeting tryptophan decarboxylase to selected subcellular compartments of tobacco plants affects enzyme stability and in vivo function and leads to a lesion-mimic phenotype"，Plant Physiol 129:1160 - 1169, 2002)。載體骨架來源于pPCV002。（A)用于表達胞漿色氨酸脫羧 酶（TDC)的ρΤ-ΡΥΤ ; (B)用于表達質體靶向TDC的pT-CHL。Ω表示煙草花葉病毒的5'-UTR ; tags表示c-myc/His6標簽；pAocs表示章魚堿合成酶的終止子。（參見圖1、圖2)
[0118] 圖4給出表達含有惡性痕原蟲（plasmodium falciparum)3D7裂殖子表面蛋白 1 (GenBank XM_0013 52134)的片段的 pTRAkc Mspl (383319) ERH-Ds 的 T-DNA。
[0119] 圖5示出用農桿菌感染5天后的BY-2細胞的肉眼觀察照片，在白光下（A)和用于 使DsRed的熒光可視化的綠色激發光下（B)，包括用于人抗體（2G12)的重鏈和輕鏈的表達 框和用于質體靶向紅色熒光蛋白（DsRed)的表達框。上：浸潤的"細胞堆疊"。下：從與農 桿菌的共培養物中收獲的細胞懸浮物，最終0D為0. 05 (左），最終0D為0. 1 (右）。
[0120] 圖6示出用農桿菌感染5天后的BY-2細胞的代表性顯微鏡照片，在白光下（A，B) 和用于使DsRed的熒光可視化的綠色激發光下（C，D)，包括用于人抗體（2G12)的重鏈和輕 鏈的表達框和用于質體靶向紅色熒光蛋白（DsRed)的表達框。得自農桿菌感染"細胞堆疊 "的細胞（A，C)。與農桿菌共培養得到的懸浮細胞的最終0D為0. 1 (B，D)。
[0121] 圖7示出用農桿菌感染6天后的BY-2細胞堆疊的照片，在白光下（A)和用于使 DsRed的熒光可視化的綠色激發光下（B)，包括用于惡性瘧原蟲Mspl片段（p38-p33-pl9) 的表達框和用于質體祀向DsRed的表達框。在培養皿（A)中顯不不同的光密度（1，0.5， 0. 25,0. 125,0. 0625)。（C)表示通過斑點印跡對來自惡性瘧原蟲的Mspl-P19的免疫檢測。
[0122] 圖8示出在不同的農桿菌株被點在細胞上4天后扁平的BY-2細胞堆疊的照片，分 別是：在白光下（A)、帶有GFP過濾器組（B)、帶有DsRed過濾器組（C)。（1-3)用pTRB〇-G 轉化的EHA105農桿菌的3個克隆，（4-6)用pTRB〇-G轉化的GV2260農桿菌的3個克隆，（7) 含 pUTA-TPrfp 的 EHA105，（8)含有 pUTA-TPrfp 的 GV3101::pMP90RK 和（+)陽性對照含有 pTRA-rTPgfp 的 GV3101::pMP90RK。
[0123] 圖9示出在農桿菌感染5天后不同靶向的熒光蛋白在細胞堆疊中的積累。在微 柱中0. 3g鮮重的細胞堆疊（A)和14ml柱中3克細胞堆疊（B)被瞬時轉化。（1)質體靶向 GFP，（2)未轉化的細胞，（3)分泌型DsRed，（4) ER-保留DsRed，（5)胞漿DsRed，（6)質體靶 向DsRed，（7)蛋白體靶向DsRed，（8)與ER-保留DsRed共轉化且質體靶向的GFP。這些照 片是在白光下（左）、設置有DsRed過濾器（中）和設置有GFP過濾器（右）的條件下拍攝 的。DsRed的提取量示于（C)。
[0124] 圖10示出在不同尺寸的柱中瞬時表達DsRed的BY-2細胞堆疊的照片。（A)在白 光下，（B)設置有DsRed過濾器。
[0125] 圖11示出通氣條件對瞬時表達的DsRed和2G12的表達的影響。（A，B)示出在柱 中不同地通氣的細胞堆疊的照片，（A)在白光下，（B)設置有DsRed過濾器。（C)示出在農 桿菌感染140小時后DsRed和2G12在柱狀堆疊的BY-2細胞中的積累。細胞堆疊的重量減 輕示于下方的圖表。
[0126] 圖12示出在用轉基因農桿菌浸潤5天后柱狀堆疊的細胞的總提取物和洗脫物的 經考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。（A)用分泌M12抗體或蛋白體形成DsRed(對照組）的表 達構建體感染。（B)用分泌或ER-保留的DsRed的表達構建體感染。凝膠上的提取物樣品 相當于約l〇mg新鮮細胞重量（FCW)，凝膠上的洗脫物樣品相當于約20mgFCW的洗脫物。
[0127] 圖13示出在用不同靶向的色氨酸脫羧酶或GFP進行農桿菌感染后的不同時間點 瞬時轉化的堆疊細胞中的色胺積累。在農桿菌感染18小時后追加額外的色氨酸（trp)。
[0128] 圖14示出在用含有分泌DsRed (rAH)或ER-保留DsRed (rERH)的植物表達載體的 農桿菌浸潤4天后由不同地預培養的懸浮培養物產生的長春花細胞堆疊的照片。這些照片 是在白光下（A)和設置DsRed過濾器（B)的條件下拍攝的。懸浮細胞分別在MS67培養基 或BY-2培養基中培養。
[0129] 圖15示出將不同的曲霉菌點在堆疊上11天后BY-2細胞堆疊的照片。（A)黑曲 霉，（B)構巢曲霉，（C)黃曲霉，（D)寄生曲霉。
[0130] 圖16示出從5日齡BY-2野生型懸浮培養物產生的4日齡柱狀堆疊細胞的洗脫物 (1)和相應于9日齡BY-2野生型懸浮培養物的培養基（2)的經考馬斯染色的SDS-PAGE凝 膠。

【具體實施方式】
[0131] 實施例1
[0132] 懸浮物中的瞬時表達與細胞堆疊中的瞬時表達的比較
[0133] 為了評價在本發明的細胞堆疊中生產瞬時重組蛋白，將DsRed和抗體2G12在農桿 菌浸潤細胞堆疊中的瞬時表達與在液體培養物中將細胞懸浮物與農桿菌共培養的現有技 術方法進行比較。
[0134] 使用重組農桿菌（菌株6￥3101::?1^90服），其攜帶在同一個1'-0嫩上含有用于人 抗體（2G12)的重鏈和輕鏈的表達框以及用于質體靶向紅色熒光蛋白（DsRed)的表達框的 二元載體pTRAp-2G12FER-Ds。兩種2G12基因都包含ER-保留抗體的KDEL序列（圖2B)。 該KDEL序列被刻意用來避免抗體分泌，以便直接比較細胞堆疊和懸浮細胞的生產率。
[0135] 用于瞬時轉化的農桿菌菌株如下制備。通過將50 μ 1接種于5ml YEB培養基（5g/ 1牛肉提取物，lg/1酵母提取物，5g/l蛋白胨，0· 5g/l MgS04, ρΗ7· 4,輔以50mg/l羧芐青霉 素和25mg/l卡那霉素）由甘油儲存液引發培養物。細菌培養物在26°C生長3天至光密度 (0D)約為5。將細菌通過離心沉淀而顆粒化，再用浸潤培養基（50g/l蔗糖，2g/l葡萄糖， 〇.5g/l FertyK 2Mega(Planta Diingemittel，德國），ρΗ5·3,輔以 200μΜ 乙酰丁香酮），按 〇D = 1進行懸浮。然后，在應用前，將該細菌懸浮物在22°C培育1小時，。
[0136] 將煙草（Nicotiana tabacum L. cv. bright yellow，BY-2)細胞在液體培養基（3% 鹿糖，4. 3g/L 的 Murashige&Skoog 鹽，100mg/L 肌醇，lmg/L 硫胺素，0· 2mg/L2, 4-二氯苯氧 基乙酸，200mg/L ΚΗ2Ρ04, ρΗ5·6)中，在黑暗中、旋轉振蕩儀（180rpm)上于26°C進行培養。 將細胞每周在新鮮培養基中用4%的接種物繼代培養，。
[0137] 植物細胞和農桿菌用消毒設備在無菌條件下進行處理。將50ml分裝的4日齡 400ml BY-2懸浮培養物倒入75ml帶有5. 5cm直徑的纖維素過濾器（MN615)的布氏漏斗， 通過抽真空（約500mbar，lmin)完全移除培養基。將得到的細胞堆疊轉移到培養皿中，測 定新鮮細胞重量（FCW)(重量=4. 5g，直徑=5. 5cm，高度=0· 3cm，密度=0· 63g/cm3)。然 后，將2. 5ml 0D1的農桿菌懸浮物（0. 55ml/g細胞堆疊）均勻地滴到細胞堆疊上，形成完全 浸潤。調整施加的液體量，使得細胞堆疊被均勻地潤濕，但沒有被完全淹沒，以允許氣隙快 速恢復。將農桿菌浸潤的細胞堆疊在黑暗中于26°C、以95%的相對濕度（RH)培養5天。
[0138] 為了進行共培養，將2. 5ml和5ml 0D1的農桿菌懸浮物以與在細胞堆疊中相同和 加倍的農桿菌與植物細胞的比率加入至50ml BY-2懸浮培養物。
[0139] 將共培養培養物在黑暗中于26°C在旋轉搖床上以180rpm進行培養。在5天后通 過真空過濾從共培養培養物中收獲BY-2細胞，將所得細胞堆疊轉移到培養皿中。在通過用 于DsRed表達的紅色發光過濾器的綠色激發光下對從兩個實驗中得到的細胞進行肉眼觀 察（圖5)。在根據本發明制備的農桿菌感染細胞堆疊中可清晰地觀察到紅色熒光。引人注 目的是，在懸浮物中與農桿菌共培養的細胞中沒有觀察到紅色熒光。細胞的顯微分析清楚 地表明，相比在懸浮物中共培養的現有技術方法（圖6)，根據本發明的細胞堆疊方法能夠 得到更高的感染率以及每個細胞的高DsRed表達。
[0140] 這兩種方法都提取可溶性蛋白，并且對DsRed和抗體的積累進行定量。簡言之，將 細胞通過超聲處理（Bandelin，Sonopuls，間隔0. 9s，40W，2X30s)在2個體積（w/v)的提取 緩沖液（50mM磷酸鉀，500mM氯化鈉，10mM硫酸氫鈉，pH7. 5)中均化。將細胞碎片通過離心 過濾（15min, 13000g,4°C )顆粒化，將清澈的上清液用于進一步分析。通過測量提取的可溶 性蛋白的熒光（激發530±12. 5nm，發射590±17. 5nm)對DsRed進行定量。抗體的定量是 使用蛋白A被偶聯至CM5傳感芯片的BIAC0RE? T200儀器進行表面等離子體共振光譜而實 施的（例如參見 T. Holland et al.，''Optimal nitrogen supply as a key to increased and sustained production of a monoclonal full-size antibody in BY-2 suspension culture〃，Biotechnol Bioeng 107:278-289,2010)。
[0141] 在由共培養懸浮細胞得到的提取物中既沒有檢測到DsRed，也沒有檢測到2G12抗 體。與此相反，從農桿菌感染細胞堆疊得到的提取物每克FCW含有55 μ g DsRed和47 μ g 2G12抗體。
[0142] 這個例子表明通過使用本發明的細胞堆疊，與懸浮培養物相比，在細胞堆疊中與 重組農桿菌共培養后可以通過瞬時表達得到實質上更高收率的重組蛋白質。此外，這個例 子清楚地表明，細胞堆疊的高生產率是由于相當高的轉化效率（通常為50%?80%)以及 在細胞內的更多的產物積累。
[0143] 實施例2
[0144] 惡性瘧原蟲抗原在細胞堆疊中的瞬時表達
[0145] 為了測試細胞堆疊是否可用于生產瘧疾抗原，瞬時生產惡性瘧原蟲的不同蛋白 質。
[0146] 含二元載體的重組農桿菌菌株，該二元載體帶有用于來自惡性瘧原蟲的 Mspl (p38，p33和pl9)的ER-保留羧基末端片段的表達框和用于質體靶向DsRed的第二表 達框（圖4)。如實施例1所述地生長并準備細菌。在感染植物細胞前，將農桿菌浸潤懸浮 物從0D1連續稀釋至0D0. 0625。
[0147] 如實施例1所述地將3日齡的BY-2懸浮培養物用于生長細胞堆疊。將該細胞堆疊 切成大約5mmX5mmX10mm的片（圖7A)。將六片轉移到培養皿中，并以不同光密度的農桿 菌懸浮物滴加浸潤至飽和（約150 μ 1/細胞堆疊）。陰性對照僅用浸潤培養基浸潤（圖7)。 在20°C、95% RH的條件下培育6天后，對堆疊片進行DsRed熒光和抗原表達分析。DsRed 是在通過紅色發光過濾器的綠色激發光下進行肉眼觀察（圖7B)。為了檢測瘧原蟲蛋白，如 實施例1所述地提取可溶性蛋白，將每個提取物的等分試樣點到硝酸纖維素膜上。瘧原蟲 蛋白的存在通過在用NBT/BCIP (硝基藍四唑/5-溴-4-氯-3' -吲哚基磷酸酯）培養后對 P19域和AP偶聯第二抗體使用單克隆抗體5. 2進行免疫檢測而可視化。
[0148] 所有受感染的細胞堆疊都檢測到強烈的DsRed熒光（圖7B)。在以0D1的農桿菌 濃度浸潤的細胞堆疊和以超過10倍稀釋的0D0. 0625的農桿菌懸浮物浸潤的細胞堆疊之間 僅檢測到熒光強度的微弱差異。所有浸潤的細胞堆疊中共轉化的瘧原蟲蛋白的清澈的免疫 檢測物也都沒反映出農桿菌的10倍稀釋物（圖7C)。用0D1的農桿菌懸浮物浸潤得到最高 的積累水平。
[0149] 在另外的實驗中，來自惡性瘧原蟲的其他蛋白質（Pfsp25單獨和與DsRed融合；和 由來自幾種不同的瘧疾蛋白的域構成的另一融合蛋白）被成功地表達于不同的BY-2細胞 堆疊形式（數據未顯示）。本例顯示，重組蛋白積累甚至在細胞堆疊被較低量的農桿菌浸潤 時也高。因此，本發明提供一種更經濟的生產方法，該方法對大規模的工業應用特別重要。 也表明不同的瘧疾蛋白可以有效地表達和生產，并且所公開的方法通常適合于瘧疾疫苗和 針對其他感染性疾病的疫苗的開發和生產。
[0150] 實施例3
[0151] 為篩選應用而使用細胞堆疊
[0152] 由于細胞堆疊是高度均質化的，所以它們用于篩分目的也很理想。因此，在本例中 通過評價所采用的農桿菌菌株和不同的表達載體對瞬時產物積累的影響而表明。使用兩種 不同的表達載體：含有35S-啟動子驅動的質體靶向DsRed的二元載體pUTA-TPrfp (圖1G); 包含外殼蛋白序列被GFP替換的煙草花葉病毒（TMV)的35S啟動子驅動的cDNA序列的二 兀載體 pTRB〇-G(圖 lH)(J.A.Lindbo，"TRB0:a high-efficiency tobaco mosaic virus RNA-based overexpression vector"，Plant Physl45:1232-1240, 2007)。每個載體被引入 到兩個不同的農桿菌菌株中。標準載體pUTA-TPrfp被引入到GV3101: : pMP90RK和EHA105 中；病毒載體 pTRBO-G 被引入到 GV2260 和 EHA105 中（R.Helens et al·，"A guide to Agrobacterium binary Ti vectors"，TIBS5:446-451, 2000)。
[0153] 在 GV3101: : pMP90RK 中的 pTRA-rTPgfp 被用作陽性對照（圖 IF)。GV-pUTA-TPrfp、 EHA-pUTA-TPrfp 和 GV-pTRA-rTPgfp 的液體培養物被甘油儲存液（glycerol stock) 引發。對于GV-pTRB〇-G和EHA-pTRBO-G培養物，每一個菌株接種由新制備的帶質粒 DNA的電轉化物獲得的三個未檢查菌落。在標準條件（GV-pUTA-TPrfp、GV-pTRB〇-G和 GV-pTRA-rTPgfp :50mg/l 羧芐青霉素和 25mg/l 卡那霉素，EHA-pUTA-TPrfp :50mg/l 羧芐青 霉素，EHA-pTRBO-G :25mg/l卡那霉素）下，生長農桿菌菌株（實施例1)。3天后，將細菌通 過離心沉淀顆粒化，并用浸潤培養基重新懸浮成0D1。在應用前，將細菌懸浮物在22°C培育 3小時。用25ml在標準條件下成長的5日齡BY-2培養物使細胞堆疊（重量=4g，直徑= 5. 5cm，高度=0· 3cm，密度=0· 56g/cm3)生長（實施例1)。將細胞堆疊倒置于培養皿中， 然后將40 μ 1的各農桿菌懸浮物點于光滑的表面。將浸潤的細胞堆疊在26°C、95% RH的條 件下培育。4天后，在通過用于GFP表達的綠色濾光片的藍色激發光下（圖8B)和通過用于 DsRed表達的紅色濾光片的綠色激發光下（圖8C)對細胞堆疊進行觀察。在使用EHA105將 表達構建體傳遞進入植物細胞時，病毒載體以及標準二元載體的熒光蛋白表達明顯效率較 低。這個結果通過以相同的農桿菌懸浮物感染3g柱狀細胞堆疊和使本氏煙草（Nicotiana benthamiana)葉片瞬時轉化得到證實（數據未顯示）。這種容易處理小規模"農業試點"的 方法也可以用來評價能夠影響目標蛋白表達的其他參數（例如，農桿菌的生長條件和預處 理，浸潤細胞堆疊的浸潤培養基組合物或培養條件）。無需使用高技術設備就可以并行分析 數百個樣品，裝有400mlBY-2培養物的1L搖瓶將在5天內提供16次4g細胞堆疊的材料， 由400mlll日齡的培養物，能夠生產30個細胞堆疊。
[0154] 實施例4
[0155] 在柱狀細胞堆疊中的瞬時表達
[0156] 為了測試是否能夠生產、浸潤和保持柱狀細胞堆疊，進行幾個實驗。在這個例子 中，不同靶向版本的紅色熒光蛋白DsRed和綠色熒光蛋白GFP被瞬時表達在柱狀形式的堆 疊細胞中。
[0157] 使用攜帶用于分泌型DsRed(圖1A)、ER_保留DsRed(圖1B)、胞漿DsRed(圖1C)、 質體靶向DsRed(圖1D)、蛋白體靶向DsRed(圖1E)和質體靶向GFP(圖1F)的二元表達載 體的不同農桿菌菌株。如實施例1所述地制備用于農桿菌感染的農桿菌懸浮物。在應用前， 將細菌懸浮物在22°C下培育5小時。為了共感染實驗，混合2個0D1的農桿菌菌株（分別 含有ER-保留DsRed和質體靶向GFP)，使各菌株的0D為0. 5。
[0158] 將在標準條件下生長的11日齡BY-2懸浮細胞（實施例1)用于在兩種不同類型 的無菌聚丙烯柱中生產細胞堆疊。使用體積0. 7ml的微型旋轉柱（Receiver Column20ym， MACHEREY-NAGEL，德國，圖 8A)和體積 14ml 的中長柱（QIAGEN-tiplOOcolumn，QIAGEN，德國， 圖9B)，二者都配備有20 μ m聚乙烯玻璃過濾器（filter frit)。通過將懸浮培養物注入連 接到真空的柱內而生成細胞堆疊。將培養基通過真空過濾完全移除之后，對所得細胞堆疊 的尺寸進行測定。將lml懸浮培養物用于微柱，得到直徑為0. 68cm、高度為1. 5cm、密度為 0. 54g/cm3的重量0. 3g的細胞堆疊。由10ml懸浮物在中長柱中生成的細胞堆疊的重量為 3g，直徑為1. 4cm，高度為3. 6cm，密度為0· 54g/cm3。
[0159] 通過將農桿菌懸浮物移液到細胞堆疊（lml/g細胞堆疊）上而將該細胞堆疊浸潤 在柱中。為了實現完全浸潤，施加短暫真空直到第一滴液滴離開柱，但細胞堆疊的頂部仍被 懸浮物覆蓋。在22°C培育該浸潤的細胞堆疊30分鐘后，通過對柱施加真空將剩余的液體完 全移除以恢復氣隙。所施加液體的移除通過測定處理過的柱狀堆積細胞的重量進行控制。 為確保在后續培育期細胞的高存活能力，因細胞堆疊或細胞吸收液體而導致的重量增加優 選不超過例如堆疊的原始新鮮細胞重量（FCW)的15%。該細胞堆疊均在26°C和92%相對 濕度下于柱中進行培養。農桿菌感染5天后，如實施例1所述地從細胞堆疊中提取全部可 溶性蛋白。
[0160] 在所有浸潤的細胞堆疊中均可肉眼觀察到熒光蛋白的表達（圖9)，這表明細胞堆 疊中不同的細胞隔室可用于生產重組蛋白。該細胞堆疊表現出均勻的熒光，意味著農桿菌 被有效地傳遞到細胞堆疊的各個區域。根據目標隔室，積累水平方面觀察到明顯的差異，范 圍為約40 μ g/gFCW(質體靶向DsRed)?約160 μ g/g FCW(胞漿DsRed)(圖9C)。靶向到蛋 白體的DsRed在體內顯示出高熒光，但由于蛋白體的不溶性而無法提取。DsRed和GFP (圖 9A8和圖9B8)的同時表達表明能夠用兩個分開的農桿菌菌株進行共感染。細胞堆疊的大 小（微柱：〇. 3g或14ml柱：3g)對表達水平沒有影響。因此，可以設想微細胞堆疊對篩選和 分析目的非常有用，例如，確定大規模生產（例如預培養、感染和共培養條件）的最優參數， 評價不同的表達構建體或者開發和研究代謝途徑。由于細胞堆疊的高均勻性，所以對統計 設計和多元實驗特別有用。為了高通量分析，可使用與自動系統兼容的96孔過濾板（例如 Receiver plate20 μ m，ChlOmaborid.A.MULTigGfilter plate，均為 MACHEREY-NAGEL，德 國）。這些過濾板的孔類似于本實施例中用于生成和浸潤細胞堆疊的微柱。與96孔板中懸 浮培養物內的高通量分析相比，微細胞堆疊具有瞬時表達更有效的優點（見實施例1)，并 且能夠將更多的生物質用于分析。除了上面所用的柱，也對更大的柱進行了測試（圖10)。 在 70ml 柱（GenElute? HP Plasmid Midiprep Kit filter syringe，US Sigma 公司）中 12g 細胞堆疊（2. 8cm直徑，3. 5cm高度）內、和在150ml柱（Chromabond?聚丙烯柱150ml， MACHEREY-NAGEL，德國）中87g細胞堆疊（3·7cm直徑，llcm高度）內，農桿菌感染4天后 觀察DsRed的表達。該12g細胞堆疊由4日齡的BY-2懸浮培養物產生并用攜帶質體靶向 DsRed的表達構建體的農桿菌浸潤（圖2B)。87g細胞堆疊由11日齡的培養物產生并用攜 帶ER-保留DsRed的表達構建體的農桿菌浸潤（圖1B)。與上述標準方法的唯一差別是87g 細胞堆疊用0D0. 25的農桿菌懸浮物浸潤。通過稱重確定細胞堆疊的密度，并確認移除了足 夠的液體以還原氣隙。不同的實驗還表明不同年齡（即繼代培養后幾天）的細胞適合于產 生本發明的細胞堆疊。而且，不同形狀和尺寸的細胞堆疊也是可以的。這個例子表明在無 菌可控條件下改變和培育較大的細胞堆疊也是可行的。區別于通常不是無菌的基于葉片的 體系。
[0161] 實施例5
[0162] 增加通氣對瞬時蛋白生產的影響
[0163] 為調查通氣對轉化的堆疊細胞性能的影響，對不同設置進行了測試：（1)主動通 氣的細胞堆疊，（2)被動通氣的細胞堆疊，（3)帶中央通風道的細胞堆疊，（4)在穿孔柱中的 細胞堆疊（圖11A)。
[0164] 如實施例1所述，在標準條件下生長并準備攜帶二元載體pTRAp-2G12FER_Ds的農 桿菌菌株（圖2B)。
[0165] 在標準條件下生長的4. 5日齡的BY-2懸浮細胞被用于在14ml的細長柱中生成 細胞堆疊（實施例4)。在實驗1、2、4中，生成固體細胞堆疊，穿孔柱用parafilm?密封。 在實驗3中，直徑2. 5mm的塑料棒被放置在柱的中心。該細胞堆疊的直徑為1. 4cm，重量為 2. 1?2. 5g，高度為2. 5?2. 7cm，密度約為0. 57g/cm3。在用農桿菌懸浮物浸潤并移除液 體（實施例4)后，從柱3移除棒，從柱4移除parafilm?，以提供帶中央空氣通道的細胞 堆疊和從側方額外供給空氣的細胞堆疊。這些柱在恒溫箱中于26°C、92%RH進行培養。柱 1被連接于抽氣泵，該抽氣泵被放置在培養箱內以供給26°C、92% RH的空氣。泵的容量為 501/小時，并設定為周期性抽吸（開啟15分鐘，關閉45分鐘）。農桿菌感染6天后，測定 該細胞堆疊的重量，并從細胞堆疊中提取可溶性蛋白，對DsRed和2G12抗體的表達進行分 析（如實施例1所述）。因為細胞堆疊的不同重量損失，基于在培養箱中開始培養的FCW 計算DsRed和抗體2G12的量（圖11C)。結果表明，由強制通氣（圖11C1)或增加的表面 (圖11C4)引起的蒸發所致水分損失，對堆疊細胞的生產率產生不利影響。在重量損失超過 20 %的細胞中，質體靶向DsRed的積累以及ER-保留抗體的積累都降低。因此，應當使用最 大限度地減少了細胞堆疊的干燥（例如通過增加相對濕度或對細胞堆疊進行加濕）的培養 條件。另一方面，結果顯示，在該范圍內，通氣是充足的，且不需要用于改善氧氣供應和氣體 交換的措施。
[0166] 實施例6
[0167] 從堆疊的細胞中無損地收獲分泌的產品
[0168] 為確定是否可以不破壞細胞地洗脫重組分泌蛋白，將BY-2懸浮細胞堆疊在柱中， 并通過農桿菌感染瞬時轉化。包含用于分泌型單克隆抗體M12的表達構建體以及ER-保留 DsRed(圖2C)、分泌型DsRed(圖1A)、ER-保留DsRed(圖1B)和蛋白體形成DsRed(圖IE) 的不同農桿菌菌株被分別用于實驗。M12抗體（150kDa)和DsRed(108kDa)是大分泌蛋白的 例子。因為ER-保留DsRed是細胞內的，所以適合控制以檢查是否植物細胞在培育或洗脫 時被破壞。不溶性蛋白體形成DsRed用作全細胞提取物的對照。
[0169] 在標準條件下生長的11日齡的BY-2懸浮細胞（實施例1)被用于在柱中產生細 胞堆疊。將10ml懸浮培養物倒入裝備有20μπι聚乙烯玻璃過濾器的14ml聚丙烯柱（直徑 1. 4cm，高度9cm)中。將培養基通過真空過濾完全移除，通過將農桿菌懸浮物移液到細胞堆 疊上（lml/g細胞堆疊）在柱內將得到的細胞堆疊（重量=3g,直徑=1. 4cm,高度=3. 6cm, 密度=0.54g/cm3)浸潤。為了實現完全浸潤，施加短時真空直到第一滴液滴離開柱，但細 胞堆疊的頂部仍然覆蓋著懸浮物。在22°C培育該浸潤的細胞堆疊30分鐘，然后通過對柱施 加真空將剩余的液體完全移除以恢復氣隙。該細胞堆疊在柱中以26°C、92%相對濕度進行 培養。農桿菌感染5天后，用2倍體積的提取緩沖液（50mM磷酸鉀，500mM NaCl，10mM亞硫 酸氫鈉，pH7. 5)從堆疊的細胞的200mg FCW樣品中提取總可溶性蛋白。為了只回收分泌的 蛋白質，如下所述地對剩余的柱堆積細胞進行清洗。對柱施加3ml緩沖液，并通過短時真空 將其吸入細胞堆疊。培養30分鐘后，通過真空收集緩沖液，并再次施加到細胞上。在連續 的三次清洗步驟后，回收到2. 7ml洗脫液，隨后實施離心澄清。對總提取蛋白制劑和可洗提 的蛋白質在考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上進行重組蛋白質的含量分析（圖12)。凝膠上 承載的蛋白量對應于來自l〇mg細胞堆疊的總提取蛋白和來自20mg細胞堆疊的可洗提蛋白 質。抗體（圖12A)和DsRed(圖12B)的提取物和洗脫物中，該重組蛋白條帶的強度幾乎相 同。這意味著，在這兩種情況下，總共生產的重組蛋白的約50%可以被洗脫。但是在洗脫樣 品中，污染的宿主蛋白的量較低。
[0170] M12抗體的量通過表面等離子共振譜、用偶聯至傳感器芯片的蛋白A進行定量，通 過熒光測定DsRed的量。約55% (96yg/g FCW)的總共生產的分泌型M12(175yg/g FCW) 和40 % (28 μ g/g FCW)分泌型DsRed (70 μ g/g FCW)被洗脫。洗脫樣品中總共生成的ER-保 留DSRed(120l·! g/g FCW)的只一小部分（小于1% )的存在表明該細胞在分泌蛋白的培養 過程中或洗脫過程中沒有損壞（也見圖12B)。
[0171] 當使用植物葉片或整株植物瞬時轉化的現有技術方法時，分泌產物的選擇性制備 通過收集細胞間的清洗液在分析規模是可行的，但更大規模是不切實際的。因此，在大規模 下，必須從整個生物質提取物中回收分泌的產品。因而，所期望的產物必須從宿主化合物 (例如蛋白質、代謝物、木質素、纖維素）的復雜混合物中進行純化。特別是酚類化合物在 下游加工和純化方面是有問題的。就這方面而言，本發明克服了這些問題，因為分泌的產品 可直接從細胞堆疊洗脫而不會破壞植物細胞，并且宿主化合物的污染最小。此外，由于可擴 展性，細胞堆疊方法可以在大的產業規模下實施。可以想象的是，在優化的洗脫和培養條件 下，從堆疊的細胞重復洗脫分泌的產物將獲得所期望產物的更高產率。
[0172] 實施例7
[0173] 通過代謝工程生產新的次級代謝物
[0174] 為了在細胞堆疊中建立一個新的生物合成途徑，普通煙草（N. tabacum)中不存在 的酶、即色氨酸脫羧酶（TDC ;EC 4. 1. 1. 28)在BY-2細胞堆疊中被瞬時表達。
[0175] TDC是催化通過1-色氨酸脫羧而生產原生物堿色胺的萜類吲哚生物堿生物合成 途徑中的早期步驟的胞質酶。色胺是一組與治療相關的次生代謝物（例如來自長春花的抗 癌藥物長春堿和長春新堿）的共同前體。為了進一步提高所希望的代謝物的產率，前體色 氨酸在第二步驟中轉化后提供給細胞堆疊。
[0176] 例如實施例4所述，4日齡的BY-2懸浮細胞被裝填在14ml柱中，提供2g FCW細胞 堆疊，密度為〇.58g/cm3。該細胞堆疊通過農桿菌感染而瞬時轉化成兩份（in duplicate)。 與用于質體靶向綠色熒光蛋白（GFP)(圖IF)、質體靶向TDC (圖3A)或用于胞漿TDC (圖3B) 的植物表達構建體轉化的根癌農桿菌菌株GV3101: :pMP90RK在標準條件下生長（實施例 1)。
[0177] 將農桿菌菌株離心沉淀而顆粒化，重新懸浮并由浸潤培養基調整至0D1。在應用到 植物細胞堆疊之前，將該細菌懸浮物在22°C培育4小時。
[0178] 每個細胞堆疊用2ml農桿菌懸浮物浸潤，在22°C培育30分鐘，抽真空干燥，再在 26°C、92%相對濕度條件下培養。在農桿菌感染18小時后，將細胞堆疊再次用2ml色氨酸 溶液（50mM半濃縮浸潤培養基）或用2ml半濃縮浸潤培養基浸潤。在26°C將浸潤的細胞 堆疊培育30分鐘后，將溶液再次通過抽真空而完全移除，將柱狀填充的細胞放回培養倉。 在農桿菌感染后69小時、91小時和112小時取樣約250mg FCW，并在-80°C儲存。根據 RS Sangwan 等人的方法（''Direct f luorometry of phase-extracted tryptamine-based fast quantitative assay of 1-tryptophan decarboxylase from Catharanthus roseus leaf〃，Anal Biochem255:39 - 46,（1998))，稍作修改，提取和檢測色胺。
[0179] 簡言之，通過在2體積（v/w)提取緩沖液（50mM磷酸鉀，500mM NaCl，10mM硫酸氫 鈉，pH7. 5)(參見實施例1)中實施超聲處理，從細胞樣品中提取水溶性化合物。將0. 9ml蒸 餾水加入到0. lml清澈提取物中后，加入2ml5M NaOH和3. 5ml乙酸乙酯。將該乳液通過渦 旋10秒進行混合，并于4°C放置16小時使其相分離。通過使用Aminco Bowman AB2突光光 譜儀（Spectronic Instruments,羅徹斯特，紐約）對上層有機相進行突光分析。在激發波 長為280nm和發射波長為350nm、激發光和發射光用狹縫寬度為4納米及光電倍增管電壓設 定為575V的條件下，對色胺熒光進行測定。
[0180] 檢測到的色胺水平表明活性TDC被分別表達在質體和胞液中（圖13)。所引入的 酶將內源性色氨酸轉化成新的色胺物質。將額外的色氨酸添加到瞬時TDC表達細胞使得色 胺的生產明顯增加（5倍于質體靶向TDC，接近10倍于胞漿TDC)。
[0181] 這個例子還顯示本發明的方法可用于生產代謝物。此外，表明細胞堆疊不僅可以 被變化成例如產生酶（TDC)，而且在后續步驟中底物和/或前體可以很容易地供給到細胞 中以提高產物產率。因此，本發明還包括通過例如反復轉化、浸潤和培養步驟，將任何感興 趣的物質傳遞到細胞內以優化產物形成（例如，額外的植物營養素、誘導劑、抑制劑）的可 能性。細胞代謝的操控可以在通過施加合適的化合物和基因的任意組合來傳遞遺傳信息的 期間、之前和/或之后進行。
[0182] 本領域技術人員容易認識到由野生型、突變的和/或轉基因的懸浮培養物制備的 細胞堆疊，也可以不進行轉化就實施操控，即通過應用不同的化合物。尤其是，這意味著指 天然存在的化合物的產率可通過使用本發明的細胞堆疊，并加入合適的底物、激素、抑制劑 和/或前體而提高。
[0183] 實施例8
[0184] 來自不同植物物種的懸浮培養物的細胞堆疊
[0185] 除了普通煙草BY-2懸浮細胞，還使用了其他幾種植物細胞懸浮物生產細胞堆疊。
[0186] 長春花
[0187] 將長春花細胞在 MS67 培養基（3%鹿糖，4. 4g/L Murashige&Skoog 鹽，0· 6mg/l 硫 胺素，0· 2mg/l激動素，lmg/L2, 4-二氯苯氧乙酸，ρΗ5· 8)或在BY-2培養基（實施例1)中、 旋轉搖床（180rpm)上、于26°C在暗處進行培養。將細胞每周在新鮮培養基中進行繼代培養 (20:100)。
[0188] 擬南芥
[0189] 將擬南芥細胞在ARA培養基（3%蔗糖，4. 4g/L Murashige&Skoog鹽，0· 5mg/L萘乙 酸，0· lmg/1激動素，ρΗ5· 7)中、旋轉搖床（180rpm)上按16小時亮/8小時暗于26°C進行 培養。將細胞每周在新鮮培養基中進行繼代培養（15:100)。
[0190] 本氏煙
[0191] 將本氏煙草的細胞在BY-2培養基（實施例1)中于26°C、在黑暗中、旋轉搖床 (180rpm)上進行培養。將細胞每周在新鮮培養基中進行繼代培養（20:100)。
[0192] 由各懸浮培養物制備不同形狀的細胞堆疊。實驗使用4?5日齡的培養物。如實 施例1所述，生成不同厚度（〇. 2?0. 5cm)的餅干樣細胞堆疊。如實施例4所述，在14ml 的細長柱中制備高度約2?4cm的細胞堆疊。根據不同的植物物種，得到不同密度的細胞 堆疊。長春花細胞堆疊的密度通常為〇. 65?0. 75g/cm3,擬南芥細胞堆疊具有約0. 55? 0. 67g/cm3的密度，本氏煙草堆疊具有約0. 6?0. 7g/cm3的密度。
[0193] 浸潤了攜帶二元載體pTRAp-2G12FER-Ds的農桿菌的長春花、擬南芥和本氏煙草 的細胞堆疊（圖2B)呈現出肉眼可見的DsRed表達。對于每個被測試的植物物種，也如實 施例1所述地通過表面等離子體共振譜證實了抗體2G12的產生。
[0194] 有趣的是，根據用于長春花懸浮培養物的培養基，表達水平被觀察到有明顯的差 異。通過將由在MS67培養基中或BY-2培養基中與兩種不同的DsRed表達構建體、即pTRAc rfp-AH和pTRAc rfp-ERH(圖ΙΑ、B)生長的細胞產生的長春花細胞堆疊轉化，進行進一步 的分析。分泌的DsRed和ER-保留DsRed在細胞中的積累都高得多，細胞是生長在BY-2培 養基中的細胞（圖14)。這表示預培養條件優化對實現高轉化和/或高產物合成的重要性。 實驗表明，本發明可以應用于來自不同物種的植物細胞。
[0195] 本領域技術人員公知培養條件（例如溫度、通氣、攪拌速度、光組成等）和/或培 養基組成（例如營養物質、激素、pH、電導率、浸潤壓等）是植物懸浮培養物的形態學和生理 特征的決定因素。各因素的變化對后續步驟中植物細胞的性能有影響。這意味著培養條件 和/或培養基組成必須為任何生產而優化。除了初始原料生產的優化，浸潤參數（例如農 桿菌濃度、接觸時間、浸潤培養基組成）和細胞堆疊的培養條件（例如時間、溫度、通氣、送 料、添加劑的應用）必須為任何植物細胞株和任何產品而優化。
[0196] 實施例9
[0197] 使用堆疊細胞作為病原體培養的底物
[0198] 使用在標準條件（實施例1)下成長的50ml4日齡BY-2培養物生成3. 64ml細胞 堆疊（重量=28，直徑=5.5〇11，高度=0.15〇11，密度=0.558/〇11 3)。將細胞堆疊放置在 空培養皿中，并用lml浸潤培養基（50g/l鹿糖，2g/l葡萄糖，0· 5g/l Ferty2Mega(Planta DUngemittel，德國），pH5. 3)浸潤，該浸潤培養基完全被細胞堆疊（細胞堆疊的重量=3g ; 密度= 0.825g/cm3)吸收。發現該體積量（即，小于或等于lml/2g細胞堆疊）有利于在培 養皿中開始細胞堆疊的培育，因為氣隙能夠在幾小時內再生。通過控制測量因蒸發而減少 至小于〇. 6g/cm3的細胞堆疊的密度得到證實。重要的是，更大量的液體（即超過lml/2g細 胞堆疊）是高度不利的，因為過量的液體使得氣隙不能被重新構建，結果使得細胞堆疊的 密度太高以至無法適當地維持細胞的生存能力或防止細胞死亡。
[0199] 下一個處理步驟包括將小體積的四種不同的曲霉種的孢子懸浮物20 μ 1點在細 胞堆疊的表面（圖15, A-D)。將細胞堆疊培養11天，然后拍攝照片（圖15)。
[0200] 這個例子顯示植物細胞堆疊可以被用作不同曲霉種的成長底物。曲霉被選擇作為 植物病原體的代表，也可作為人類和動物病原體的代表。
[0201] 在這個例子中，由野生型BY2懸浮細胞制備細胞堆疊，以便隨后培養真菌。本領域 技術人員理解也可使用轉基因懸浮細胞。特別是，可以使用生產抗真菌肽、蛋白質或化合物 的轉基因細胞堆疊，研究它們對真菌的生長和發育的影響。同樣，由野生型細胞生成的細胞 堆疊可以先經轉化處理，然后用于研究產品對真菌病原體成長的影響。本領域技術人員還 可接受本方法也可用于研究抗細菌化合物的影響。在下述實施例11中描述了細胞堆疊在 高通量篩選應用中的多滴定板中的使用，顯而易見的是這些實施例也可以進行組合。
[0202] 實施例10
[0203] 從由轉基因懸浮細胞株生成的細胞堆疊中非破壞性地收獲分泌產物
[0204] 在用分泌型單克隆抗體M12與ER-保留DsRed的表達構建體轉化后，生成轉基因 BY2懸浮培養物（圖2C)。在含有卡那霉素的板上選擇后，轉基因愈傷組織被轉移到液體培 養基中，以建立高度均勻的懸浮培養物。懸浮培養物通過每周將4 %的懸浮培養物轉移到新 鮮液體培養基中進行繼代培養（實施例1)。
[0205] 將5日齡的懸浮培養物的懸浮細胞收集用于生成本發明公開的細胞堆疊或者將 細胞進一步在懸浮培養物中進行培養。將細胞堆疊和懸浮培養物再培養4天。如實施例6 所述，例如使用14ml聚丙烯柱制備2g FCW(新鮮細胞重量）的細胞堆疊。再次，仔細地監 視氣隙的構建，并通過測量移除了液體培養基的鑄型細胞堆疊的密度，在整個培育/培養 中進行控制。最終，在26°C培育細胞堆疊的過程中始終確保90%的相對濕度，以防止細胞 堆疊內的細胞干燥。
[0206] 細胞堆疊或得自（通過真空過濾從培養基中分離出來的）懸浮培養物的細胞的 400mg FCW樣品的總可溶性蛋白用2倍體積的提取緩沖液（50mM磷酸鉀，500mM NaCl，10mM 亞硫酸氫鈉，pH7. 5)提取。
[0207] 從柱狀堆疊細胞中分泌的抗體通過用提取緩沖液（實施例6)清洗該柱狀堆疊細 胞而回收。簡言之，2ml緩沖液施加到2g柱中，通過短時真空被細胞堆疊吸收。培育30分 鐘后，通過抽真空收集緩沖液,并再次施加到細胞上。在連續三次清洗后，回收到1. 6ml洗 脫液。從原始懸浮培養基中收集到的樣品被用于比較。
[0208] 在（通過胺耦合固定的）蛋白A表面，通過SPR測定抗體濃度，采用在CH0細胞中 產生的純化人抗體H10作為標準。所有樣品均在劑量-反應曲線的線性范圍內進行分析。 DsRed通過使用DsRed標準由突光進行確定。
[0209] 盡管懸浮培養物已達到高細胞生物質，但是在懸浮培養物的上清液中沒有檢測到 抗體。因此，分泌的重組產物的部分為0%。M12抗體的細胞內積累為4.02 μ g/g FCW轉基 因BY2懸浮細胞。因此，總收率（細胞上清液中的抗體加上細胞內的抗體）也是4. 02g/g。
[0210] 相比之下，M12的總收率達到11.4yg/g細胞堆疊，這相當于總收率大幅提高了 284%。重要的是，可以從細胞堆疊中洗脫分泌的抗體。分泌產物的收率是1.4yg M12抗 體/g細胞堆疊，對當于總收率的12%。
[0211] 該實施例表明可以從轉基因懸浮培養物生成的細胞堆疊中得到重組蛋白產物，并 且與對照的懸浮細胞相比，收率顯著提高284%。
[0212] 與在懸浮物（分別為5. 2 μ g/g FCW和3. 0 μ g/g FCW)中的細胞相比，在細胞堆疊 的細胞中ER-保留DsRed的產率提高70%。
[0213] 這個例子還清楚地表明，以細胞堆疊的形式培育轉基因懸浮細胞不僅允許產品以 濃縮的形式被收集（相對于懸浮細胞培養物上清液），該形式對下游加工（包括加工時間和 成本均降低）非常有利。
[0214] 重要的是，細胞堆疊也提供了使用與細胞培養基不同的緩沖液來最大限度洗脫產 品（此處為自細胞分泌的重組靶蛋白）的極好切入點，因此細胞堆疊給懸浮細胞提供了額 外的好處。懸浮培養物的上清液含有比柱狀堆疊細胞洗脫液更大量的多糖。優選多糖量低， 因為凝膠狀多糖阻礙像過濾和超濾這種下游流程。
[0215] 此外，對于根據本發明所產生的細胞堆疊，所收獲的被分泌的重組蛋白的百分比 從〇% (懸浮細胞）顯著增加至12% (。
[0216] 最后，本實施例表明在細胞堆疊中的總收率與作為懸浮細胞培養的相同細胞相比 也顯著增加。
[0217] 本領域技術人員還將容易地理解，這種方法不限定于由轉基因細胞生產和/或分 離重組蛋白質，也同樣適用于在非轉基因或轉基因細胞或其他感興趣的產品中產生次級代 謝物，包括（但不限于）初級代謝物、纖維、寡糖和多糖（纖維素、淀粉、半纖維素、木聚糖、 果聚糖等）、天然肽和蛋白質、色素、維生素、香料、水果酸或植物細胞的任何其他產品。
[0218] 實施例11
[0219] 使用在多滴定板中產生的細胞堆疊
[0220] 使用在板的底部含有液體可滲透性過濾器的多滴定板（Receiver plate20 μ m(No. 740686. 4)，MACHEREY-NAGEL，德國），如上所述地生成細胞堆疊。
[0221] 在接收板（Receiver plate)的每個孔中鑄型1ml野生型（非轉基因）煙草BY2 懸浮培養物，生成96個微小細胞堆疊。使用NucleoVac96真空歧管（MACHEREY-NAGEL，德 國），通過抽真空將液體培養基完全移除。用顯微鏡分析0. 2g所得細胞堆疊是否存在氣隙， 使用獨立的對照實驗，確定所得細胞堆疊的密度小于〇. 7g/cm3。
[0222] 對每個細胞堆疊施加0.8ml攜帶編碼抗體M12(圖2C)或抗體2G12(圖2A)的pTRA 質粒的重組根癌農桿菌懸浮物（0D600nm = 0. 1)。對每個抗體表達構建體，浸潤32微小細 胞堆疊。30分鐘后，移除任何液體，重新構建氣隙并重新建立密度小于0. 7g/cm3的細胞堆 疊。在多滴定板中的細胞堆疊然后在25°C、90%相對濕度下培養4天。然后，收獲細胞堆 疊，并提取重組抗體（實施例1)。在蛋白-A表面，使用Biac 〇reT200儀器（T = 25°C，電泳 緩沖液=HBS-EP)，通過表面等離子體共振測量對32個樣品針對每個抗體測定抗體濃度， 以確定平均抗體濃度和變異系數（CV)。
[0223] 抗體M12的平均收率為117. 8± 14. 4 μ g/g細胞堆疊，變異系數是12. 2%。抗體 2G12的平均收率為32. 3 ±3. 6 μ g/g細胞堆疊，變異系數是11. 1%。
[0224] 這些對生物測定來說都是優良值，并清楚地說明了基于根據本發明制備的細胞堆 疊的分析的優異的再現性和魯棒性。
[0225] 這也說明了細胞堆疊的不同的尺寸和幾何形狀可用于不同的應用，該實驗表明細 胞堆疊可以以多滴定板形式生成，這有利于高分辨率的高通量應用。
[0226] 此外，同樣清楚的是多滴定板形式的細胞堆疊可以以與在柱中鑄型的情況相同或 類似的方式操作或處理，包括分泌的或細胞外的產物的洗脫，以用于后續的定量或分析。
[0227] 本領域技術人員將承認細胞堆疊還可以用于分析目的。例如，可以使由轉基因懸 浮培養物生成的細胞堆疊或與用于重組抗體、包括（但不限于）例如抗體融合蛋白對纖維 素結合蛋白、或連接到或集成到細胞膜（質膜）的重組抗體的基因一同轉化的細胞堆疊與 包含連接到抗體上的物質的溶液（樣品）接觸。此處，細胞堆疊的多孔性又是一個明顯的 優勢，因為大體積可以很容易地使細胞堆疊通過以提高靈敏度。此外，顯而易見的是清洗步 驟、緩沖液交換和酶標抗體的應用或其它檢測試劑可以很容易地應用，并從細胞堆疊中移 除。在最后的步驟中，底物可應用于，然后酶促轉化為可測量的產物，以揭示該物質的存在 和濃度。
[0228] 實施例12
[0229] 從野生型細胞產生的細胞堆疊中回收內源蛋白
[0230] 將5日齡的BY-2野生型懸浮培養物的懸浮細胞收集用于生成細胞堆疊或將細胞 進一步在懸浮培養物中培養。細胞堆疊和懸浮培養物都再培養4天。如實施例6所述，使 用14ml聚丙烯柱制備2. 5g FCW(新鮮細胞重量）的細胞堆疊。移除液體后，將細胞堆疊 在26°C以90%相對濕度進行培育。5日齡的BY-2懸浮培養物進一步在26°C于旋轉搖床上 以180rpm進行培養。4天后，收獲分泌的蛋白。如實施例6所述，通過用2.5ml緩沖液清 洗堆疊而從細胞堆疊中收獲分泌的蛋白質。通過使用真空過濾從培養基中移除細胞，從9 日齡的懸浮培養物中收獲分泌的蛋白。洗脫的或分泌的蛋白的25μ 1樣品在考馬斯染色的 SDS-PAGE凝膠上分析（圖16)。這個例子表明，分泌的天然蛋白質可以從根據本發明生成 和培育的細胞堆疊中回收。凝膠上的各條帶代表不同的天然蛋白質。凝膠分析也顯示，細 胞堆疊中的細胞和懸浮物中的細胞之間，分泌的天然蛋白的數量和種類是不同的。在細胞 堆疊的細胞（圖16,由箭頭表示）中，某些天然蛋白的分泌顯著增加。
[0231] 本領域技術人員也將很容易地理解，該方法不限定于從植物細胞中回收天然蛋白 質，也同樣適用于其它感興趣的內源性產品，包括次級代謝物、初級代謝物、纖維、寡糖和多 糖（纖維素、淀粉、半纖維素、木聚糖、果聚糖等）、天然肽和蛋白質、色素、維生素、香料、水 果酸或植物細胞的任何其它產品。本領域技術人員將認識到可由選自廣泛的植物物種的懸 浮細胞生成該細胞堆疊，包括但不限于長春花、紅豆杉、甜菊和青蒿。
【權利要求】
1. 一種去除了培養基且多孔結構的、非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞材料的產生 和所述細胞堆疊的后續維持的方法，該方法包括下述步驟：（i)通過從植物細胞懸浮培養 物中分離細胞而提供具有多孔結構的細胞堆疊，其中，使細胞堆疊所包含的液體的含量降 低并調整為相當于0. lg?0. 9g濕細胞重量/cm3的細胞堆疊密度，從而建立所述細胞堆疊 的去除了培養基且多孔結構的性質，以及（ii)將去除了培養基且多孔結構的所述細胞堆 疊在非液體環境中以50?100%的相對濕度進行培育。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，使細胞堆疊所包含的液體的含量降低并調整為 相當于在0. 2g?0. 85g濕細胞重量/cm3之間的細胞堆疊密度，優選在0. 4g?0. 8g濕細 胞重量/cm3之間的細胞堆疊密度。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中，培養步驟（ii)是在沒有將去除了培養基且 多孔結構的細胞堆疊放置在維持培養基或生長培養基上或者沒有接觸維持培養基或生長 培養基的情況下實施的。
4. 根據權利要求1至3中的任一項所述的方法，其中，從所述植物細胞懸浮培養物中分 離的細胞是天然的或轉基因的，并且能夠積累所期望的產物。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述轉基因細胞被瞬時轉化或穩定轉化以積累 所述所期望的產物。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中，在進入步驟（ii)前，將步驟（i)所提供的細胞 堆疊所包含的細胞與至少一個表達載體瞬時轉化，所述表達載體包含至少一種異源核酸序 列，所述至少一種異源核酸序列編碼所期望的產物。
7. 根據權利要求1至6中的任一項所述的方法，其中，步驟（ii)包括積累和收獲所期 望的產物。
8. 根據權利要求4至7中的任一項所述的方法，其中，所期望的產物選自天然和異源蛋 白質或多肽、次生代謝物、標記物和分析/診斷結果。
9. 一種去除了培養基且多孔結構的非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞材料，密度在 0. lg?0. 9g濕細胞重量/cm3之間、優選在0. 2g?0. 85g濕細胞重量/cm3之間、最優選在 0. 4g?0. 8g濕細胞重量/cm3之間，是由權利要求1?8中的任一項所述的方法獲得的或 可由權利要求1?8中的任一項所述的方法獲得的。
10. -種去除了培養基且多孔結構的非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞材料，密度 在0. lg?0. 9g濕細胞重量/cm3之間、優選在0. 2g?0. 85g濕細胞重量/cm3之間、最優選 0· 4g?0· 8g濕細胞重量/cm3之間。
11. 由權利要求1?8中的任一項所述的方法獲得的或可由權利要求1?8中的任一 項所述的方法獲得的、去除了培養基且多孔結構的非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞材 料或權利要求9或10所述的植物細胞材料在分析或診斷方面的應用。
12. 根據權利要求11所述的應用，其中，細胞堆疊所包含的細胞在待分析或診斷的生 物或者待分析或診斷的物質的存在下進行。
13. -種診斷工具，包括由權利要求1?8中的任一項所述的方法獲得的或可由權利要 求1?8中的任一項所述的方法獲得的、或權利要求9或10所述的、去除了培養基且多孔 結構的非組織多層細胞堆疊形式的植物細胞材料。
【文檔編號】C12P21/02GK104093845SQ201380007428
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年1月31日 優先權日:2012年1月31日
【發明者】托馬斯·拉德馬赫爾 申請人:弗勞恩霍夫應用研究促進協會