超嗜熱聚合酶可實現的鄰近延伸分析的制作方法

超嗜熱聚合酶可實現的鄰近延伸分析的制作方法
【專利摘要】本發明涉及針對樣品中分析物進行的基于鄰近探針的檢測分析(“鄰近分析”)，特別是鄰近探針延伸分析(PEA)，且尤其是涉及對降低非特異性“背景”信號的方法進行的改進，其中改進包括在這樣的分析中使用超嗜熱聚合酶，所述方法包括：(a)將樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個探針包括分析物結合結構域和核酸結構域，并能夠同時結合至分析物；(b)在鄰近探針與分析物結合時，使鄰近探針的核酸結構域彼此相互作用，其中所述相互作用包括雙鏈體的形成；(c)延伸所述雙鏈體的至少一個核酸結構域的3’端以生成延伸產物，其中，延伸反應包括將分析的溫度提高至超過室溫并使用聚合酶，所述聚合酶的特征在于40℃時其具有小于最大酶活性的20％的活性且25℃時其具有小于最大酶活性的10％的活性，其中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度是高于40℃，且所述聚合酶選自強烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌(Pwo)DNA聚合酶，或者它們的衍生物或突變體，優選地其中所述衍生物是序列-修飾的衍生物；和(d)擴增和檢測延伸產物。
【專利說明】超嗜熱聚合酶可實現的鄰近延伸分析

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種針對樣品中分析物進行的基于鄰近探針的檢測分析（"鄰近分 析"），具體涉及鄰近探針延伸分析（PEA)。特別地，本發明涉及對方法的改進，以便減少非 特異性"背景"信號，所述非特異性"背景"信號出現在所有樣品類型中，并且在復雜的生物 樣品中可能是特別有問題的。本發明的方法還可產生有利于所述分析的自動化和再現性的 簡化方法。所述改進包括在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶，特別是超嗜熱聚合酶， 在上述分析中的使用。本發明還提供了一種試劑盒，包含聚合酶，其是用于本發明方法的、 在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶。

【背景技術】
[0002] 在鄰近探針延伸分析中使用了鄰近探針，所述鄰近探針結合于分析物并具有核酸 結構域（或標記），所述核酸結構域與所述分析物結合以鄰近依賴性方式相互作用。所述相 互作用通常通過一個或多個核酸雙鏈體的形成（通過核酸結構域的雜交）進行，所述相互 作用使得至少一個核酸結構域從其3'端延伸。該延伸產物形成可檢測的，優選可擴增的， 核酸檢測產物或檢測標記，借助其可以檢測到所述分析物。


【發明內容】

[0003] 本發明中，在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶可在所述聚合酶無活性或具 有最小活性的條件下加入，例如，在實驗室條件下。所述聚合酶可以在產生延伸產物所必需 的其它分析組分之前加入，或者與其它分析組分同時加入，或者在其它分析組分之后加入。 因此，人們認為，除非改變反應條件，特別是溫度條件，使聚合酶在該參數條件下是有活性 的，即具有可檢測到的活性或者高于最小聚合物活性，否則在室溫下具有最小活性或無活 性的聚合酶不能夠與樣品中的核酸分子，例如鄰近探針的核酸結構域，發生相互作用產生 延伸產物。
[0004] 本發明中，在室溫具有最小活性或無活性的聚合酶同時包含其它反應組分，可減 少分析方法的步驟數目，即減少了從業者與反應混合物之間相互接觸的次數，所述其它反 應組分例如是靶標分析物的延伸、擴增和檢測所需的組分。這有利于產生一致的分析結果。 在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶不論是在其它分析組分之前加入，還是與其它分 析組分同時加入或在其后加入，所述聚合酶的使用都能夠使從業者不必直接接觸反應混合 物就可控制延伸產物的產生，即封閉管反應。在本發明的方法中，直到反應條件有利于激發 聚合酶活性，才會產生延伸產物。這使得樣品能夠與分析組分一起進行培養足夠的時間，包 括在聚合酶存在下進行培養，以便使鄰近探針的核酸結構域之間的非特異性相互作用最小 化，從而增強了分析的特異性和靈敏性。
[0005] 通常，鄰近分析依賴于"鄰近探測"原理，其中通過多個（即兩個或多個，通常是兩 個或三個）探針的結合來檢測分析物，當所述探針通過結合于分析物（因此是"鄰近探針"） 而進入鄰近時，使得信號生成。一般地，鄰近探針中的至少一個包括連接于探針的分析物結 合結構域（或部分）的核酸結構域（或部分），并且信號的生成涉及核酸部分和/或由其它 探針（或多個探針）攜帶的另外的功能部分之間的相互作用。因此信號生成取決于探針之 間（更具體地由它們攜帶的核酸或其它功能部分/結構域之間）的相互作用，因此僅當兩 個（或多個）必須的探針都結合于分析物時才生成信號，從而向檢測系統提供改善的特異 性。近年來發展了鄰近探測的概念，現在基于該原則的許多分析在本領域是熟知的。例如， "鄰近探針延伸分析"或"鄰近延伸分析"（PEA)是指具體類型的分析，所述分析利用核酸結 構域的延伸，即核苷酸模板化地加入核酸分子的末端，以生成可檢測的信號。
[0006] 基于鄰近探針的檢測分析，特別是鄰近延伸分析使得能夠通過將樣品中的一種或 多種分析物的存在的形式轉化成可以容易地檢測的或者可定量的基于核酸的信號，以靈 敏、快速且方便地檢測或者定量該一種或多種分析物，并且所述的分析可以按照均質或異 質形式進行。
[0007] 本領域的鄰近探針通常成對使用，并且各自地由對靶標分析物具有特異性的分 析物結合結構域和功能結構域所構成，所述功能結構域例如是偶聯在其上的核酸結構域。 所述分析物結合結構域例如可以是核酸"適體"（Fredriksson等人（2002),自然生物技 術 20:473-477) (Fredriksson et al(2002)Nat Biotech20:473-477)或可以是蛋白質 的，諸如單克隆或多克隆抗體（Gullberg等人（2004)，美國科學院院刊101:8420-8424) (Gullberg et al(2004)Proc Natl Acad Sci USA101:8420_8424)。每個鄰近探針對的各 自的分析物結合結構域可以針對分析物上的不同結合位點具有特異性，所述分析物可以由 單一分子或者相互作用的分子復合物構成，或者可以具有相同的特異性，例如在靶標分析 物存在的情況下作為多聚體存在。當鄰近探針對變得彼此緊密鄰近時，這主要當兩個均結 合于相同分析物分子上的其各自的位點時發生，功能結構域（例如，核酸結構域）能夠相互 作用。在本發明的上下文中，例如，核酸結構域可以含有彼此互補的區域，因此鄰近探針對 的核酸結構域可以雜交以形成雙鏈體。一個或多個結構域可以延伸以形成新的核酸序列， 這通常借助由其它鄰近探針的核酸結構域模板化的聚合反應來進行。由此，生成的新核酸 序列用于報告樣品中分析物的存在與否或含量，并且生成的新核酸序列可以被定性或定量 檢測，例如通過實時定量PCR(q-PCR)定量檢測。
[0008] 基于鄰近探針的分析存在許多變化。例如，國際專利W001/61037,美國專利 6, 511，809和國際專利W02006/137932中對鄰近延伸分析進行了描述，并且基于鄰近探針 的分析的異質（即分析物首先借助特異性分析物結合試劑固定在固體基質上）和均質（即 在溶液中）形式在如下文獻中被公開：國際專利W001/61037,國際專利W003/044231，國際 專利 W02005/123963, Fredriksson 等人（2002)自然生物技術 20:473-477 (Fredriksson et al (2002)Nat Biotech20:473-477)和 Gullberg 等人（2004)美國科學院院刊 101:8420-8424(Gullberg et al (2004)Proc Natl Acad Sci USA101:8420-8424)。
[0009] 雖然通常使用鄰近探針對，但是鄰近探針檢測分析的修飾已描述于例如國際專利 W001/61037,國際專利W02005/123963和國際專利W02007/107743,其中使用三種鄰近探針 來檢測單個的分析物分子。例如，第三鄰近探針可以用來提供可以與前兩種鄰近探針的核 酸結構域相互作用的另外的核酸結構域。
[0010] 除了對鄰近探針檢測分析的修飾，鄰近探針本身結構的修飾已描述于例如國際專 利W003/044231中，其中使用了多價鄰近探針。這樣的多價鄰近探針包括至少兩個，但是多 達100個的分析物結合結構域，所述分析物結合結構域綴合于至少一個核酸，優選多于一 個核酸。
[0011] 基于鄰近探針的檢測分析，且特別是鄰近延伸分析，已經證明在許多不同的應用 中在蛋白質的特異性和靈敏性檢測中是非常有用的，所述應用例如是檢測弱表達或低豐度 蛋白質。然而，就分析的靈敏度和特異性兩方面而言，這樣的分析都不是沒有其問題，并且 存在改進空間。
[0012] 例如上述鄰近延伸分析的傳統鄰近分析的靈敏度受兩個主要因素的限制：（i)分 析物結合結構域對靶標分析物的親和力，和（ii)由非結合探針特別是探針對的隨機鄰近 產生的非特異性背景信號。使用具有對分析物親和力高的結合結構域時，靈敏度被限制在 檢測約6000個分子。傳統地，為了實現低水平的背景，必須使用非常低濃度的鄰近探針。這 阻止了試圖通過使用高濃度的探針來補償包括低親和力分析物結合結構域的探針的任何 嘗試。因此發現這可能限制分析的靈敏度和可能獲得定量結果的范圍。
[0013] 已經提出了用于減少非特異性背景信號的其它方法，諸如使用封閉劑，例如封閉 寡核苷酸，所述封閉劑結合于鄰近探針上的核酸結構域的游離端，直到被取代，例如被置換 劑寡核苷酸取代。在允許鄰近探針結合于分析物之后加入置換劑寡核苷酸，意味著鄰近探 針的核酸結構域的相互作用僅可能發生在結合于靶標分析物的鄰近探針上。
[0014] 改善鄰近探針分析特別是鄰近延伸分析的靈敏度的其它方法使用了包含3'核酸 外切酶活性的組分，例如具有3'核酸外切酶活性的聚合酶，所述組分被認為是通過降解具 有游離且未被保護的3'端的鄰近探針核酸結構域來降低背景活性，所述游離且未被保護的 3'端是指鄰近探針上沒有結合于靶標分析物且因此不形成特異性相互作用或雙鏈體的結 構域。這會阻止由非雜交的或"非雙鏈的"核酸結構域產生非特異性延伸產物，因而同時增 強分析的特異性和靈敏性。減少背景信號的其它方法集中在改進核酸延伸產物的檢測上。
[0015] 然而，仍然有改進背景信號水平的空間，并且為了克服鄰近分析的局限性，特別是 如上所述的本領域已知的鄰近延伸分析，已發現使用在室溫下具有最小活性或無活性的聚 合酶能顯著改善分析的靈敏性和特異性，所述聚合酶在其它反應組分之前加入，或者與其 它反應組分同時加入或在其后加入。優選地，在聚合酶無活性的條件下，例如在實驗室條件 下，將在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶與樣品接觸。在優選的【具體實施方式】中，如 果靶標分析物存在于樣品中，那么在已經使鄰近探針與靶標分析物相互作用之后，加入用 于延伸核酸結構域的聚合酶。在一些【具體實施方式】中，用于延伸核酸結構域的聚合酶與其 它反應組分例如延伸反應所需的組分同時加入，這樣，鄰近延伸分析就是封閉管系統，即， 反應混合物可以在使鄰近探針與分析物相互作用（或者，在加入延伸反應組分之后，使反 應混合物均勻且使鄰近探針之間的相互反應穩定）但聚合酶不具有活性或不具有最小活 性的條件下，例如在室溫條件下，進行培養，隨后在使聚合酶具有活性的條件下，例如高于 室溫的條件下，對反應混合物進行培養。因此，在一種特別優選的【具體實施方式】中，在室溫 下具有最小活性或無活性的聚合酶是超嗜熱聚合酶。
[0016] 通過在分析中包括在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶，而有可能減少分析 中存在的非特異性背景信號。或者，使用在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶可以視 為減少或防止不需要的、不希望的或非特異性的延伸產物的產生。
[0017] 在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶在檢測樣品中分析物的方法中的應用， 特別是在本發明的鄰近延伸分析中的應用，提供了與先前的基于鄰近探針的分析相比獨特 且出乎意料的優點。
[0018] 一般地，特別地選擇基于鄰近探針的分析的組分，以便在分析的最適條件下具有 最大或接近最大的活性。鄰近探針分析預期是依賴于在分析條件下靈敏且有效的分析組 分，以便所述分析能夠檢測小量的分析物。因此，使用具有極端活性分布的組分，例如在分 析所采用的溫度范圍之外的溫度下具有最佳活性的酶，預期會延遲或阻礙充當標明靶標分 析物存在的信號的核酸分子的產生，例如，通過與最適分析條件下具有最大活性的酶相比 降低了核酸分子的產生速度。
[0019] 然而，本發明的方法依賴于當室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶在PEA中接 觸樣品時所看到的背景的顯著降低（即：噪音比升高）。特別地，室溫下具有最小活性或 無活性的聚合酶與鄰近延伸分析的其它組分中的至少一些同時與樣品有利地接觸。或者， 也可以在分析的其它組分已經相互作用之后再提供室溫下具有最小活性或無活性的聚合 酶。由此可見，室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶可以在分析的任何合適階段與樣品 接觸。
[0020] 雖然不希望受理論約束，但是理論認為，在組分首次接觸的條件下，室溫下具有最 小活性或無活性的聚合酶不能夠延伸鄰近探針的核酸結構域。在這方面，在鄰近探針的分 析物結合結構域可以相互作用并且與分析物（如果存在于樣品中）結合的條件下，反應混 合物的全部分析組分可以存在于單個反應容器（例如，管），并且鄰近探針的核酸結構域之 間形成的、均結合至靶標分析物的雙鏈體可形成穩定的相互作用（在分析條件下，一旦結 合，鄰近探針就不容易從靶標分析物分離，從而實現穩定，即形成了非短暫的或長久的雙鏈 體）。在無聚合酶活性或只有最小聚合酶活性的情況下形成雙鏈體，會促進聚合物最終激活 時特異性延伸產物的生產，即，只有結合于靶標分析物的鄰近探針會形成穩定的雙鏈體，在 聚合酶有活性時進行延伸。由于在鄰近探針雙鏈體的形成過程中聚合酶可以存在于反應混 合物中，因此不向反應混合物中加入任何其它組分也有可能激活聚合酶，例如，通過提高反 應混合物的溫度來激活聚合酶。可以假設的是，在聚合酶無活性或只有最小活性的情況下 加入聚合酶，會給分析帶來進一步水平的控制。給分析物檢測分析增加其它步驟通常是不 希望的，因為這會使方法變復雜，從而增加了自動化和/或適用于高通量應用的困難。類似 地，向分析中添加組分會增加樣品的復雜性，即，加入其它組分后反應混合物必須均衡，其 它組分會降低分析的靈敏性。因此，室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶的使用，使得在 酶在激活之前反應混合物中的組分能夠穩定或均衡。這很難采用室溫下具有活性的聚合酶 來實現，因為需要將聚合酶在無活性的條件下加入，例如低溫，而這樣的條件會干擾或影響 鄰近探針和靶標分析物之間的相互作用，和/或，結合于靶標分析物的、鄰近的兩個鄰近探 針的核酸結構域的相互作用。
[0021] 正是因為加入了室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶，而導致鄰近探針延伸分 析中非特異性背景信號的改進地減少。如實施例所更詳細地顯示的，本發明代表了與本領 域已知的鄰近延伸分析相比更顯著的進步。令人吃驚的是，顯示出，在使用室溫下無活性或 具有最小活性的聚合酶的本發明方法中觀察到非特異性背景活性的降低，甚至可與利用室 溫下具有一些活性或顯著活性的嗜熱聚合酶或標準聚合酶的樣品相比。另外，更出乎意料 地發現，在PEA的典型溫度下，例如30-40°C，具有小于其最大活性的20%的聚合酶在本發 明的方法中是特別有用的。室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶的加入引起了分析中信 號：噪音比的相似改進，其中，在例如37°C的PEA典型溫度下以及例如45-55°C的較高溫度 下實施所述分析，這完全是出乎意料的。背景信號的這種減少的結果是鄰近探針檢測分析 的特異性和靈敏性均提高。
[0022] 此外，本文公開的方法還包括簡化的PEA，其中，室溫下無活性或具有最小活性的 聚合酶活化之前，可以將用于擴增延伸產物的組分與延伸分析的組分相結合。如下所討論 的，室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶也可用作擴增反應中的聚合酶活性，從而在分 析的延伸步驟之后避免了提供例如熱穩定聚合酶的其它聚合酶和擴增組分的需要。然而， 本文公開的方法描述了能夠使兩個分析階段的試劑預混合的各種組分的修飾。有利的是， 這導致較少的移液步驟和較少的動手操作時間，這使得此分析易于實現自動化且減少了誤 差。
[0023] 因此，可以看出本發明提供了室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶在鄰近探針 延伸分析用于檢測樣品中分析物的用途，其中延伸產物隨后被擴增和檢測。
[0024] 更具體地，室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶使用來生成延伸產物，其是在 用于鄰近分析的鄰近探針的核酸結構域相互作用（這樣的相互作用通常是核酸結構域的 雜交，以及隨后的至少一個結構域的延伸；一般說來，核酸結構域雜交，以便一個核酸結構 域可以模板化另一個結構域的延伸）之后，在鄰近探針延伸分析中生成延伸產物的步驟 中，特別是在進行聚合酶催化的延伸反應的步驟中進行的。因此，室溫下無活性或具有最 小活性的聚合酶包括在下述步驟中：基于鄰近探針的延伸分析中產生初始延伸產物的步驟 中，或換言之，鄰近探針延伸分析中由鄰近探針的核酸結構域的相互作用而產生延伸產物 的步驟中。
[0025] 可選地，本發明的這個方面提供了一種檢測樣品中分析物的方法，該方法包括鄰 近探針延伸分析，其中，所述分析包括在分析的延伸步驟中應用室溫下無活性或具有最小 活性的聚合酶，以及隨后對延伸產物進行擴增和檢測。
[0026] 另一方面，本發明提供了在用于檢測樣品中的分析物的鄰近探針延伸分析中減少 非特異性延伸產物（或者提高信號：噪聲比）的方法，所述方法包括在所述分析的延伸步驟 中使用包括室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶，其中，隨后對特異性延伸產物進行擴 增和檢測。
[0027] 如上所述，鄰近探針延伸分析的延伸步驟是生成初始延伸產物的步驟，所述初始 延伸產物隨后作為檢測分析物的手段而被檢測。換言之，延伸步驟是生成延伸產物的步驟， 其基于鄰近探針的核酸結構域的相互作用，特別是基于核酸結構域的雜交和隨后至少一個 結構域的延伸，例如，使用另一個作為模板來進行延伸。
[0028] 本發明的方法是基于鄰近探針的分析，并且將室溫下無活性或具有最小活性的聚 合酶是用于基于鄰近探針的分析中的，所述探針是鄰近探針。基于鄰近探針的分析可以是 本領域已知的任何分析，例如如上所述的，所述分析使用鄰近探針來檢測樣品中的分析物。 具體地，該分析是鄰近延伸分析，其基于通過雜交來檢測鄰近探針的核酸結構域之間的相 互作用，和一個或多個這種結構域的延伸。
[0029] 因此，在一個優選的方面，本發明提供了一種檢測樣品中分析物的方法，包括：
[0030] (a)將所述樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個探針包括分析 物結合結構域和核酸結構域，并能夠同時結合至分析物；
[0031] (b)在所述鄰近探針與所述分析物結合時，使鄰近探針的核酸結構域彼此相互作 用，其中所述相互作用包括雙鏈體的形成；
[0032] (c)延伸所述雙鏈體的至少一個核酸結構域的3'端以生成延伸產物，其中，延伸 反應使用聚合酶，所述聚合酶的特征在于40°C時其具有小于最大酶活性的20%的活性，其 中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度是高于40°C ;和
[0033] ⑷擴增和檢測延伸產物。
[0034] 如下更詳細地描述，分析物結合結構域可以直接地或間接地結合分析物。
[0035] 因此，可以看出，室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶可以用于擴大鄰近延伸 分析的敏感性和/或特異性。因此，本發明的方法可以認為是提高（針對分析物的）鄰近 延伸分析的信號：噪音比的方法。用另一種方式表達，本發明的方法可以用于降低在鄰近延 伸分析中的非特異性延伸產物的量。或者，本發明可以看做是提供了一種減少實施鄰近延 伸分析所需步驟數目的方法。此外，本發明可以看做是提供了一種使用鄰近延伸分析來檢 測靶標分析物的簡化方法。
[0036] 可以看出，該方法包括改變或修改分析的條件以活化或增強聚合酶活性的其它步 驟。因此，該方法可包括如下步驟：在聚合酶不具有（聚合酶）活性或具有最小（聚合酶） 活性的條件下，例如，在室溫或低于室溫的條件下，使聚合酶與樣品（或反應混合物）接觸。 可選地，聚合酶可以與其它分析組分同時與樣品（或反應混合物）接觸，其它分析組分例如 是延伸反應所需的組分。在一個優選的【具體實施方式】中，聚合酶與樣品接觸的步驟發生在 步驟（b)之后。
[0037] 該方法還可包括改變或修飾樣品已經接觸聚合酶之后的分析條件以活化或增強 聚合酶活性的步驟。在一個優選的【具體實施方式】中，該步驟包括將分析（反應混合物）的 溫度提高至室溫之上。在一個特別優選的【具體實施方式】中，將分析的溫度提供到至少30°C， 優選至少35°C或40°C，或者至少45°C或50°C。在一些【具體實施方式】中，可以將分析的溫 度提高到至少55、60、70或75°C。因此，分析的溫度可以由室溫提高到30-80°C之間，優選 地，35-75°C、35-70°C、35-65°C、35-60°C或 35-55°C，更優選 37-52°C，或者可選地，提高到 37-55°C，40-55°C、40-52°C或40-50°C之間。因此，延伸所述雙鏈體的至少一個核酸結構域 的3'端以生成延伸產物的步驟可以在上述溫度范圍中的任何溫度下實施，諸如30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74 或 75?。
[0038] 在本發明方法的另一個【具體實施方式】中，一個或多個鄰近探針可被提供為展開鄰 近探針，以便所述一個或多個探針的核酸結構域能夠在其3'端形成發卡環，如下所示。
[0039] 在本發明的另一個【具體實施方式】中，本發明的方法包括使用具有3 '核酸外切酶活 性的組分。具有3'核酸外切酶活性的組分在用于延伸步驟的聚合酶之前加入，或者與用于 延伸步驟的聚合酶同時加入。在一些【具體實施方式】中，用于鄰近延伸分析的延伸步驟的聚 合酶具有3'核酸外切酶活性。
[0040] 綜上所述，鄰近延伸分析涉及在兩個或多個鄰近探針的核酸結構域之間形成雙鏈 體之后延伸至少一個核酸結構域，其中所述探針結合于靶標分析物。然而，所述雙鏈體（兩 個互補核酸結構域的雜交體）可以按照多種方式形成，這取決于鄰近探針上的核酸結構域 的方向。
[0041] 鄰近延伸分析形式的代表性的例子示意性地顯示在圖1中，并且這些具體實施方 式在下面進行更詳細地描述。然而，這些不同"版本"的PEA并不意在限制本發明的范圍。 根據以下的描述，其它排列方式對本領域技術人員來說是顯而易見的，并且意在將其包括 在本發明中。實際上，本發明僅要求至少一個鄰近探針（如所示，雖然這是發明的一個優選 的方面，但是不限于蛋白質分子或抗體）具有包括能夠延伸的游離3'端的核酸結構域，且 其中所述延伸可以被第二鄰近探針的核酸結構域模板化。在這方面，以及如下所更詳細地 描述的，鄰近探針的核酸結構域可以是單鏈的或者部分雙鏈的，但是被配置以便結構域的 單鏈區域可以用于通過雜交而進行的彼此相互作用。各鄰近探針的核酸結構域也可以通過 各自雜交于共同的"夾板"核酸分子而相互作用，從而間接地形成雙鏈體。因此，在上述方 法的步驟（b)中，核酸結構域形成雙鏈體的相互作用可以是直接的或者間接的；連接于鄰 近探針的分析物結合結構域的核酸結構域可以彼此雜交以直接形成雙鏈體，或者它們可以 通過各自雜交于另外的核酸分子來間接地形成雙鏈體。這樣的另外的核酸分子可以被視為 部分雙鏈核酸結構域的第二條鏈；它將與連接于鄰近探針的分析物結合結構域的核酸分子 的至少一個區域雜交（從而形成部分雙鏈的核酸結構域，所述核酸結構域通過它的一條鏈 進行連接），留下一個末端（例如3'）單鏈區域，所述單鏈區域與另一個鄰近探針的核酸結 構域的區域互補，因此，所述單鏈區域可以用于通過與所述另一個鄰近探針的核酸結構域 雜交而相互作用。或者，"夾板"可以作為另外的鄰近探針的核酸結構域提供。
[0042] 圖1的版本1描繪了"傳統的"鄰近延伸分析，其中，每個鄰近探針的核酸結構域 (顯示為箭頭）通過其5'端連接于分析物結合結構域（顯示為倒置的"Y")，從而留下兩個 游離的3'端。當所述鄰近探針結合于其各自的分析物上的分析物結合靶時（圖中未顯示 分析物），在3'端互補的探針的核酸結構域能夠通過雜交而相互作用，即形成雙鏈體。核 酸聚合酶的加入或活化，使得使用另一個鄰近探針的核酸結構域能夠來延伸每個核酸結構 域，以模板化所述延伸。根據本發明的方法，可以特異性地擴增和檢測延伸產物，從而檢測 革巴分析物。
[0043] 圖1的版本2描繪了供選擇的鄰近延伸分析，其中，第一鄰近探針的核酸結構域通 過其5'端連接于分析物結合結構域，以及第二鄰近探針的核酸結構域通過其3'端連接于 分析物結合結構域。因此，第二鄰近探針的核酸結構域具有游離的5'端（顯示為鈍箭頭）， 所述游離的5'端不能使用通常的核酸聚合酶（其僅延伸3'端）來延伸。第二鄰近探針的 3'端被有效地"封閉"，即它不是"游離的"且由于綴合于分析物結合結構域上因而被其封 閉而不能被延伸。在這個【具體實施方式】中，當鄰近探針結合于分析物上的它們各自的分析 物結合靶時，在3'端共享互補區域的探針核酸結構域能夠通過雜交而相互作用，即形成雙 鏈體。然而，與版本1相比，僅有第一鄰近探針的核酸結構域（其具有游離的3'端）可以 使用第二鄰近探針的核酸結構域作為模板進行延伸。如上所述，可以擴增并檢測延伸產物， 從而檢測靶標分析物。
[0044] 在圖1的版本3中，與版本2類似，第一鄰近探針的核酸結構域通過其5'端連接 到分析物結合結構域，并且第二鄰近探針的核酸結構域通過其3'端連接到分析物結合結構 域。因此，第二鄰近探針的核酸結構域具有游離的5'端（顯示為鈍箭頭），所述5'端不能 被延伸。然而，在這個【具體實施方式】中，連接到各自的鄰近探針的分析物結合結構域的核酸 結構域沒有互補區域，因此不能直接形成雙鏈體。作為替代，提供了第三核酸分子，其具有 與每個鄰近探針的核酸結構域同源的區域，該區域在核酸結構域之間充當"分子橋"或"夾 板"。該"夾板"寡核苷酸橋接了核酸結構域之間的間隙，使它們彼此能間接相互作用，即每 個核酸結構域與夾板寡核苷酸形成雙鏈體。因此，當鄰近探針結合到各自的在分析物上的 分析物結合靶時，探針的核酸結構域各自通過雜交，即通過形成雙鏈體來與夾板寡核苷酸 相互作用。由此可見，第三核酸分子或夾板可以看作是在鄰近探針之一上提供的部分雙鏈 的核酸結構域的第二條鏈。例如，鄰近探針中的一個可以具有部分雙鏈的核酸結構域，所述 結構域通過一條鏈的3'端連接于分析物結合結構域，并且其中另一條（未連接的）鏈具有 游離的3'端。因此，這樣的核酸結構域具有末端單鏈區域，所述單鏈區域具有游離的3'端。 在這個【具體實施方式】中，第一鄰近探針的核酸結構域（其具有游離的3'端）可以使用"夾 板寡核苷酸"（或另一個核酸結構域的單鏈的3'端區域）作為模板延伸，并且可以有利地 連接到第二鄰近探針的核酸結構域的5'端（具體地為連接鏈的5'端，或者可選地是指核 酸結構域的雙鏈部分的5'端）。可選地或另外地，夾板寡核苷酸的游離3'端（即未連接的 鏈，或3'單鏈區域）可以使用第一鄰近探針的核酸結構域作為模板進行延伸。如上所述， 可以擴增和檢測延伸產物，從而檢測靶標分析物。
[0045] 在優選的【具體實施方式】中，本發明的方法并不涉及連接步驟或反應，即一個或多 個核酸分子的5'和3'端的綴合或結合。更具體地，鄰近探針的核酸結構域并不連接在一 起，即本發明的方法不包括分子間的連接。
[0046] 從以上描述可以清楚地看出，在一種【具體實施方式】中，夾板寡核苷酸可以作為分 析的單獨組分而提供。換言之，可以將其單獨加入反應混合物中（即與鄰近探針分別地加 入到含有分析物的樣品中）。盡管如此，由于其雜交到作為鄰近探針的部分的核酸分子，并 且當與這樣的核酸分子接觸時會這樣做，因此，盡管它是單獨加入的，但是仍將其視為部分 雙鏈的核酸結構域的一條鏈。可選地，所述夾板可以預先雜交到鄰近探針的一個核酸結構 域，即在將鄰近探針與樣品接觸之前進行雜交。在這個【具體實施方式】中，夾板寡核苷酸可 以直接看作鄰近探針的核酸結構域的部分，即，其中核酸結構域是部分雙鏈的核酸分子，例 如，鄰近探針可以通過將雙鏈核酸分子連接到分析物結合結構域（優選地，核酸結構域通 過單鏈綴合于分析物結合結構域）并且（使用能夠雜交到其它鄰近探針的核酸結構域的單 鏈突出端）修飾所述核酸分子以生成部分的雙鏈核酸結構域來制備。因此，如本文所定義 的鄰近探針的核酸結構域的延伸還包括"夾板"寡核苷酸的延伸。有利地，當延伸產物由夾 板寡核苷酸的延伸產生時，所產生的延伸的核酸鏈僅通過核酸分子的兩條鏈之間的相互作 用（通過兩條核酸鏈之間的雜交）偶聯于鄰近探針對。因此，在這些【具體實施方式】中，可以 使用變性條件將所述延伸產物從鄰近探針對上解離，所述變性條件例如是升高溫度、降低 鹽濃度等。這在異質形式中是特別有用的，其中靶標分析物結合于固體基質，由于延伸產物 可以容易地從分析的其它組分上分離，例如，結合于固定化的分析物的鄰近探針可以在固 相中，而延伸產物在變性之后可以在液相中。
[0047] 雖然在圖1的版本3中描繪的夾板寡核苷酸顯示為與全長的第二鄰近探針的核酸 結構域的互補，但是這僅僅是一個例子，并且對于夾板而言，能夠與鄰近探針的核酸結構域 的末端（或在末端附近）形成雙鏈體就足夠了，即能夠將間隙進行橋接就足夠了，如下進一 步定義的。
[0048] 在另一個【具體實施方式】中，夾板寡核苷酸可以作為如國際專利W02007/107743所 描述的第三鄰近探針的核酸結構域提供，該國際專利通過引用整體并入本文，其說明將夾 板寡核苷酸作為第三鄰近探針的核酸結構域而提供能夠進一步提高鄰近探針分析的靈敏 性和特異性。
[0049] 圖1的版本4是版本1的修飾，其中第一鄰近探針的核酸結構域包括在其3'端與 第二鄰近探針的核酸結構域不完全互補的序列。因此，當所述鄰近探針結合到分析物上它 們各自的分析物結合靶時，所述探針的核酸結構域能夠通過雜交，即形成雙鏈體，而相互作 用，但是第一鄰近探針的核酸結構域的3'最末端（包括游離3'羥基的核酸分子的部分）不 能雜交，因此作為單鏈的未雜交的"下垂物"（flap)存在。在加入或者活化核酸聚合酶時， 通過如下方法只有第二鄰近探針的核酸結構域可以被延伸：使用第一鄰近探針的核酸結構 域來模板化該延伸。如上所述，可以特異性地擴增和檢測延伸產物，從而檢測靶標分析物。
[0050] 在這種構型中，在分析還包括具有3'核酸外切酶活性的組分的【具體實施方式】中， 有益的是對第一鄰近探針的核酸結構域3'端的一個或多個核苷酸進行修飾，例如，以使其 具有對3'核酸外切酶活性的抗性。下面對合適的修飾作了進一步描述。如果核酸結構域 是抗3'核酸外切酶活性的，那么只有第二鄰近探針的核酸結構域可以被延伸。相反地，如 果核酸結構域對3'核酸外切酶活性是敏感的，那么"下垂物"可以被降解，產生與第二鄰近 探針的核酸結構域完全雜交（退火）的3'端。因此，第一鄰近探針的核酸結構域也可以使 用第二鄰近探針的核酸結構域作為模板來延伸。
[0051] 圖1中描繪的最后的【具體實施方式】，即版本5,可以看作是版本3的修飾。然而， 與版本3相比，兩個鄰近探針的核酸結構域均通過它們的5'端連接到它們各自的分析物結 合結構域。在這個【具體實施方式】中，核酸結構域的3'端不互補，因此鄰近探針的核酸結構 域不能相互作用或直接形成雙鏈體。作為替代，提供了第三核酸分子，其具有與每個鄰近探 針的核酸結構域同源的區域，該區域在核酸結構域之間充當"分子橋"或"夾板"。該"夾板" 寡核苷酸橋接了核酸結構域之間的間隙，使得它們能夠彼此間接地相互作用，即每個核酸 結構域與夾板寡核苷酸形成雙鏈體。因此，當鄰近探針結合于分析物上它們各自的分析物 結合靶時，探針的核酸結構域各自通過雜交即形成雙鏈體而與夾板寡核苷酸相互作用。因 此，根據版本3可以看出，第三核酸分子或夾板可以看作是在一個鄰近探針上提供的部分 雙鏈的核酸結構域的第二條鏈。在一個優選的實施例中，可以將探針之一與部分雙鏈的核 酸結構域一起提供，所述結構域通過一條鏈的5'端連接到分析物結合結構域，并且其中另 一條（未連接的）鏈具有游離的3'端。因此，這樣的核酸結構域具有末端單鏈區域，該區 域具有至少一個游離3'端。在這個【具體實施方式】中，第二鄰近探針的核酸結構域（其具有 游離3'端）可以使用"夾板寡核苷酸"作為模板延伸。可選地或另外地，夾板寡核苷酸的 游離3'端（即，未連接的鏈，或第一鄰近探針的3'單鏈區域）可以使用第二鄰近探針的核 酸結構域作為模板進行延伸。如上所述，可以擴增和檢測延伸產物，從而檢測靶標分析物。
[0052] 如上所討論，與版本3相關，夾板寡核苷酸可以作為分析的單獨的組分提供。另一 方面，由于它雜交到作為鄰近探針的部分的核酸分子，并且當與這樣的核酸分子接觸時會 這樣，因此，盡管它是單獨加入的，但是仍將其視為部分雙鏈的結構域的一條鏈。可選地，夾 板可以預先雜交到鄰近探針的一個核酸結構域，即，在將鄰近探針與樣品接觸之前進行雜 交。在這個【具體實施方式】中，夾板寡核苷酸可以直接看作鄰近探針的核酸結構域的部分， 艮P，其中核酸結構域是部分雙鏈的核酸分子，例如，鄰近探針可以通過將雙鏈核酸分子連接 到分析物結合結構域（優選地，核酸結構域通過單鏈綴合到分析物結合結構域）并且（使 用能夠雜交到其它鄰近探針的核酸結構域的單鏈突出端）修飾所述核酸分子以產生部分 雙鏈的核酸結構域。因此，如本文所定義的鄰近探針的核酸結構域的延伸還包括"夾板"寡 核苷酸的延伸。有利地，當延伸產物由夾板寡核苷酸的延伸產生時，所產生的延伸的核酸鏈 僅通過核酸分子的兩條鏈之間的相互作用（通過兩條核酸鏈之間的雜交）偶聯于鄰近探針 對。因此，在這些【具體實施方式】中，可以使用變性條件將所述延伸產物從鄰近探針對上解 離，所述變性條件例如是升高溫度、降低鹽濃度等。這在異質形式中是特別有用的，其中靶 標分析物結合于固體基質，由于延伸產物可以容易地從分析的其它組分上分離，例如，結合 于固定化的分析物的鄰近探針可以在固相中，而延伸產物在變形之后可以在液相中。
[0053] 雖然在圖1的版本5中描繪的夾板寡核苷酸顯示為與第一鄰近探針的全長核酸結 構域的互補，但是這僅僅是一個例子，并且對于夾板而言，能夠與鄰近探針的核酸結構域的 末端（或在末端附近）形成雙鏈體就足夠了，即能夠將間隙橋接就足夠了，如下進一步定義 的。
[0054] 在另一個【具體實施方式】中，夾板寡核苷酸可以作為如國際專利W02007/107743所 描述的第三鄰近探針的核酸結構域提供，該國際專利通過引用整體并入本文，其說明將夾 板寡核苷酸作為第三鄰近探針的核酸結構域而提供能夠進一步提高鄰近探針分析的靈敏 性和特異性。
[0055] 從以上可以理解的是，鄰近延伸分析有多個排列，其都依賴于當兩個（或多個）鄰 近探針結合于分析物時，憑借探針之間相互作用形成包括可延伸的3'端（用于模板化的延 伸）的核酸雙鏈體。因此，探針之間（或更具體地，在它們各自的核酸結構域之間，所述核 酸結構域包括夾板寡核苷酸）的相互作用是鄰近依賴性的；檢測探針在分析物上的結合共 同地使得它們鄰近，以使它們（或更具體地，它們的核酸結構域）可以相互作用。因此，可 以通過檢測該相互作用（或由此生成的延伸產物）來檢測分析物。在本發明的方法中，鄰 近探針可以通過彼此雜交而（直接地或間接地）相互作用，以使得一個或多個核酸分子能 夠延伸。該延伸可以導致兩個鄰近探針的核酸結構域綴合或相互連接，并且夾板寡核苷酸 (其可以形成鄰近探針的核酸結構域的部分）協助或介導該相互作用（綴合）。可選地，本 發明的方法并不包括連接反應，例如，鄰近探針的核酸結構域不連接。延伸（如果適用，綴 合）可以通過檢測延伸和/或綴合產物（相互作用產物）來檢測。
[0056] 雖然不希望受理論約束，但是理論認為，本發明的方法依賴于室溫下無活性或具 有最小活性的聚合酶的加入，這使得在沒有聚合酶活性或只有最小聚合酶活性的有利條件 下對分析組分進行均衡和穩定。據認為，如果聚合酶在加入的條件下是有活性的，那么它的 加入會干擾反應，這會產生非特異性/背景延伸產物，從而干擾分析物的檢測。例如，將活 性聚合酶與其它分析組分，例如引物、夾板、延伸反應組分、鄰近探針等，一起加入反應混合 物，或者將活性聚合酶在其它分析組分之前加入反應混合物，這會導致所述探針的核酸結 構域的延伸，從而產生非特異性/背景延伸產物，其中，所述探針的核酸結構域是非特異性 地和/或短暫地（暫時地）結合于其它未結合鄰近探針或分析組分的。據認為，在分析的鄰 近探針，例如結合于靶標分析物的鄰近探針和相鄰結合的探針的雙鏈形式的核酸結構域， 已相互作用之后再將組分加入到反應混合物中，可暫時地使這些相互作用不穩定。聚合酶 在有活性的條件下加入到反應混合物中的分析可導致由不穩定的鄰近探針產生非特異性/ 背景延伸產物。然而，如果聚合酶在其加入到反應時的條件下是無活性的，那么它就不會干 擾其它組分的相互作用。因此，聚合酶的存在可以使反應混合物的組分之間的相互作用穩 定，其中，不需要修飾反應組分就可活化所述聚合酶，即，只需要修飾反應條件，例如溫度。
[0057] 核酸聚合酶是這樣的酶：通過催化核酸分子3'端末端核苷酸與游離核苷酸之間 形成磷酸二酯鍵而延伸核酸分子。通常，聚合酶反應以單鏈（或部分單鏈）核酸分子為模 板，來直接形成新的分子。已知存在眾多類型的核酸聚合酶，它們可以由DNA和/或RNA模 板來合成DNA和/或RNA。
[0058] 可用于本發明方法的聚合酶包括室溫下無活性或具有最小活性的酶，這樣，就可 以在室溫將聚合酶加入到鄰近延伸分析中，而不會催化反應混合物中存在的核酸分子而發 生延伸。可以在相對于特定酶在其最適條件下，特別是最適溫度條件下的最大活性來定義 室溫下的最小（或可忽略的）活性。因此，在本發明的一個優選【具體實施方式】中，在其它參 數是最適的分析條件下來測定不同溫度下聚合酶的活性，所述其它參數例如是緩沖液、pH、 鹽濃度、模板和引物濃度、核苷酸濃度等。不同溫度下酶的活性分布可以看作是特定條件下 的平均活性，所述條件優選是除溫度之外的其它參數的最適條件，即，其中發生修飾的條件 只是溫度。因此，酶的最大活性是包括最適溫度的最適條件下的平均活性。除非特別說明， 否則本文中提到的酶活性應解讀為特定條件下的平均酶活。
[0059] 因此，室溫下具有最小或可忽略活性的聚合酶可被定義為這樣的聚合酶：其在它 參數處于最適條件，在室溫下，其活性小于最大活性的5% (平均）。優選地，這其它參數處 于最適條件，在室溫下，所述聚合酶的活性小于其最大活性的4%、3%、2%或1%。
[0060] 通常，室溫用來描述20-25°C的溫度范圍。因此，用于本發明的聚合酶在20-25°C 的活性通常小于其最大活性的5 % (平均）。優選地，室溫可被定義為標準環境溫度（SAT)， 其是25°C (298. 15開爾文）。因此，在一個優選的【具體實施方式】中，用于本發明的聚合酶在 25°C的活性小于其最大活性的5% (平均）。
[0061] 用于本發明方法的優選的聚合酶可以定義為超嗜熱聚合酶。通常，超嗜熱酶是由 超嗜熱生物體衍生或獲得的，所述生物體在高于90°c的極端溫度下最適生長，例如，在約 l〇〇°C (相比于在約70°C最適生長，70°C通常適合于絕大部分嗜熱生物）。超嗜熱聚合酶 (或更具體地，來自超嗜熱生物體的聚合酶）在高于正常生理（即一般的生物）溫度下具有 最佳酶活性，例如高于37°C，諸如高于40、50、60或70°C，一般高于60°C或70°C。顯著地，在 諸如室溫的較低溫度下，例如在25°C或30°C，這樣的酶有利地顯示了低的或降低的活性。 特別有利地，直至達到至少45°C或50°C的溫度，聚合酶的活性是低的。已經從生活在極端 溫度條件下的生物體中，例如古生菌（諸如強烈火球菌（Pyrococcus furiosus)和沃氏火 球菌（Pyrococcus woesei)等），鑒定出了這樣的酶。這些生物體中特別令人關注的酶是這 樣的聚合酶：它們已經用于很多分子生物學技術的研發中，尤其是PCR。除了自然發生的超 嗜熱酶之外，還可以對高溫下活性最佳的熱穩定酶進行修飾以使其具有在室溫降低的或低 的活性，以便產生與自然發生的超嗜熱酶具有相同或相似性質的酶，特別是具有相同或相 似溫度活性分布的酶，即高的最適溫度下（例如高于50、55或60°C )與室溫下（或在諸如 30°C、37°C或40°C的較低溫度下）具有低的或降低的活性相結合。這樣的經過修飾的聚合 酶可包括所謂的Taq聚合酶"熱起始（hotstart)"衍生物，其在約50°C獲得活性。如本文 所用，術語"超嗜熱聚合酶"不僅包括自然發生的酶，還包括所有這樣的修飾衍生物，所述修 飾衍生物還包括自然發生的超嗜熱聚合酶的衍生物。
[0062] 因此，用于本發明方法的聚合酶的特征在于其在40°C的活性小于等于其最大活性 的20%，其中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度高于40°C。可選地，相比于聚合酶在較高 溫度下的最大活性，可以根據在特定溫度諸如40°C測定的酶活性來對用于本發明方法的聚 合酶進行定義。因此，當在40°C對用于本發明方法的聚合酶的活性進行測定時，它們的活性 小于等于它們最大活性的20%，S卩，在最適條件下，即最適溫度下獲得的活性的20%。優選 地，所述聚合酶的特征在于，其在40°C的活性小于等于其最大酶活性的15 %，優選小于等 于其最大酶活性的10%，例如小于等于其最大酶活性的9%、8%、7%、6%或5%。
[0063] 可選地或另外地，所述聚合酶的特征在于，其在50°C的活性小于等于其最大酶活 性的30 %，其中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度高于50°C。優選地，所述聚合酶的特 征在于，其在50°C的活性小于等于其最大酶活性的20%，優選小于等于其最大酶活性的 15%，例如小于等于其最大酶活性的14%、13%、12%、11 %或10%。
[0064] 用于本發明方法的聚合酶的進一步的特征在于，其在25°C的活性小于等于其最大 酶活性的10%，優選地，其在25°C的活性小于等于其最大活性的5%，例如，小于等于其最 大活性的4%、3%、2%或1%。
[0065] 因此，例如，本發明的聚合酶的特征在于，其在40°C的活性小于等于其最大酶活性 的20%，且其在25°C的活性小于等于其最大酶活性的10%，其中，所述聚合酶最大活性的 最適溫度大于40°C。可選地，所述聚合酶的特征在于，其在50°C的活性小于等于其最大酶 活性的30 %，且其在25°C的活性小于等于其最大酶活性的10 %，其中，所述聚合酶最大活 性的最適溫度大于50°C。
[0066] 在特別優選的【具體實施方式】中，用于本發明方法的聚合酶包括至少是50°C的最大 活性的最適溫度，優選至少是60°C或70°C。
[0067] 基于上述限定的溫度活性分布的其它組合也適合于限定用于本發明方法的聚合 酶。因此，上述特征的任何組合，其限定了在50°C或低于50°C時具有相對低活性（小于最 大活性的30% )的聚合酶，優選地，在例如25°C的室溫沒有活性或具有最小活性，且其最大 活性的最適溫度高于40°C，例如50°C、60°C或70°C。
[0068] 可以使用本領域已知的任何便捷方法來測定聚合酶活性。例如，可以通過監測聚 合酶反應期間標記的核苷酸，例如[ 3h]ttp，摻入高分子量核酸來測定聚合酶活性。方便地， 用于本發明方法的聚合酶的聚合酶活性可在聚合酶鏈式反應（PCR)中測定。
[0069] 用于本申請方法的特別優選的超嗜熱酶包括Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶以 及它們的衍生物，例如序列-修飾衍生物，及其突變體。
[0070] 因此，本發明特別優選的方面提供了一種檢測樣品中分析物的方法，包括：
[0071] (a)將所述樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個探針包括分析 物結合結構域和核酸結構域，并能夠同時結合至分析物；
[0072] (b)在所述鄰近探針與所述分析物結合時，使鄰近探針的核酸結構域彼此相互作 用，其中所述相互作用包括雙鏈體的形成；
[0073] (c)延伸所述雙鏈體的至少一個核酸結構域的3'端以生成延伸產物，其中，延伸 反應使用聚合酶，所述聚合酶選自強烈火球菌（Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌（Pwo)DNA聚 合酶或者它們的衍生物或突變體；和
[0074] (d)擴增和檢測延伸產物。
[0075] Pfu DNA聚合酶或Pwo DNA聚合酶的序列-修飾衍生物或突變體包括保留了野 生型序列的至少一些功能活性的突變體，所述功能活性例如是聚合酶活性。突變會影響酶 的活性分布，例如，在不同反應條件下，提高或降低聚合反應速率，其中反應條件例如是溫 度、模板濃度、引物濃度等。突變或序列修飾也會影響酶的保真性，例如，抑制或降低核酸 外切酶活性。聚合酶可以作為包括其它組分的組合物的一部分而提供，所述其它組分例如 是穩定組分可增強或改善聚合酶活性，例如美國專利US6183997和US6444428(通過引用 整體并入本文）對這樣的組合物進行了描述。Pfu DNA聚合酶或Pwo DNA聚合酶的很多序 列-修飾衍生物或突變體以及包含未修飾的和修飾的酶的組合物是本領域已知的且可市 購得到，例如，超超新星 ?(Pwo) (Hypernova?(Pwo))，德爾塔 ?(Pwo) (Delta3?(Pwo))，索爾 金特?(Pfu) (S〇lGentTM(Pfu))，并且，如上所述的，所有保留了必要溫度活性分布的酶都被 認為是可用于本發明的方法中的。
[0076] 因此，在一個【具體實施方式】中，本發明的優選的超嗜熱聚合酶由包括SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列或者與其具有至少80%、85%或90%序列一致性的核苷酸序列所編碼。可 選地或另外地，本發明的優選的超嗜熱聚合酶包括SEQ ID N0:2的多肽序列或者與其具 有至少80 %、85 %或90 %序列一致性的多肽序列。因此，本發明的超嗜熱聚合酶可以是 Pfu酶或Pwo酶的天然變體或衍生物，例如，來自于諸如是火球菌（Pyrococcus)替代菌株 或種的另一超嗜熱生物體。例如，已經從其它火球菌的種，諸如甘氏火球菌（Pyrococcus glycovorans)和深海火球菌（Pyrococcus abyssi)(參見登錄號 AAA37131. 1、CAB81809. 1 和NP127396. 1，其通過引用整體并入本文），識別出眾多天然變體或衍生物。
[0077] 優選地，所述核苷酸序列或多肽序列與其所比對的序列至少具有90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%的一致性。
[0078] 核苷酸分子的序列一致性可以通過使用GCG接口的FASTA搜索來測定，所述搜索 具有缺省值和可變的姆因子，缺口產生罰分設為12. 0,缺口延伸罰分設為4. 0,具有6個核 苷酸的窗口。
[0079] 優選地，這樣的序列一致性相關的核酸分子在功能上等效于SEQ ID NO: 1中列出 的核酸分子。這樣的功能等效的核酸分子可以采用衍生物的形式并被認為是功能等效物， 前提是它們編碼根據本文描述的聚合酶活性測試被認為是功能等效物的多肽。優選的功能 等效物是編碼上文所記載的優選多肽的那些核酸分子。
[0080] 多肽分子的序列一致性可以通過使用具有可變的帕姆因子的FASTA pep-cmp的 SWISS-PR0T蛋白質序列數據庫來測定，缺口產生罰分設為12. 0,缺口延伸罰分設為4. 0,具 有2個氨基酸的窗口。優選地，所述比對是針對全長序列進行的，但是，也可以對較小的窗 口進行比對，例如，小于600、500、400、300、200、100或50連續氨基酸。
[0081] 優選地，這樣的序列一致性相關的多肽在功能上等效于SEQ ID N0:2中列出的多 肽。如此，就可對具有SEQ ID N0:2中列出的序列的多肽進行不影響多肽的序列的修飾。 [0082] 不影響多肽序列的修飾包括化學修飾，例如去糖基化和糖基化。通過多肽的后期 合成/分離修飾，例如特定殘基的糖基化和甲基化，來制備這樣的多肽，而不會影響特定殘 基的功能。
[0083] 如本文所提到，為了實現"功能等效"，多肽在聚合酶活性上可顯示出一些相對于 母體分子（即多肽所源自的分子，例如通過氨基酸替代）的增加或降低的功效，但是優選 地，多肽與母體分子同樣有效或更高效。在一些【具體實施方式】中，在功能等效多肽中，部分 原酶活性例如核酸外切酶活性可能會降低或受到抑制。因此，功能等效涉及這樣的多肽：其 在鄰近延伸反應中具有能夠延伸核酸結構域的聚合酶活性，但是在室溫不具有聚合酶活性 或只具有最小聚合酶活性。通過衍生多肽的聚合酶活性相對于其所源自的多肽的比較，以 定量方式，來測試等效多肽，如上所述。在本發明的方法中，衍生物優選與母體多肽至少是 30%、50%、70%或 90%等效的。
[0084] 與自然發生的蛋白質有關或源自自然發生的蛋白質的功能等效蛋白質，通過一個 或多個氨基酸的取代、添加和/或刪除（假設它們滿足上述序列一致的要求）來修飾天然 氨基酸但不破壞分子功能從而獲得功能等效蛋白質。優選地，天然序列具有小于20個取 代、添加或刪除，例如小于1〇、5、4、3、2或1個這樣的修飾。這樣的蛋白質由"功能等效核酸 分子"編碼，其中"功能等效核酸分子"是由一個或多個堿基的適當的取代、添加和/或刪除 而產生。
[0085] 在本發明的一個【具體實施方式】中，本發明的方法可包括使用具有3 '核酸外切酶活 性的組分。因此，本發明的方法包括使樣品接觸具有3'核酸外切酶活性的組分的另外步驟。 具有3'核酸外切酶活性的組分在聚合酶之前加入或與之同時加入。在一些【具體實施方式】 中，鄰近延伸分析的延伸步驟所用的聚合酶具有3'核酸外切酶活性。
[0086] 因此，本發明提供了一種檢測樣品中分析物的方法，包括：
[0087] (a)將所述樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個探針包括分析 物結合結構域和核酸結構域，并能夠同時結合至分析物；
[0088] (b)在所述鄰近探針與所述分析物結合時，使鄰近探針的核酸結構域彼此相互作 用，其中所述相互作用包括雙鏈體的形成；
[0089] (b'）使所述樣品與具有3'核酸外切酶活性的組分接觸；
[0090] (c)延伸所述雙鏈體的至少一個核酸結構域的3'端以生成延伸產物，其中，該步 驟可與步驟（b'）同時發生或在步驟（b'）之后發生，且其中，延伸反應使用聚合酶，所述聚 合酶的特征在于，其在40°C的活性小于其最大酶活性的20%，其中所述聚合酶最大活性的 最適溫度大于40°C ;和
[0091] ⑷擴增和檢測延伸產物。
[0092] 核酸外切酶是這樣起作用的酶：通過在3'端或5'端水解磷酸二酯鍵從而從多核 苷酸鏈末端一次一個地斷裂核苷酸。因此，核酸外切酶作為5'核酸外切酶或3'核酸外切 酶而存在，這種命名是參考斷裂的起始端，即，3'核酸外切酶沿3'至5'的方向降解核酸分 子。已知存在眾多類型的核酸外切酶，它們降解DNA和/或RNA并且作用于雙鏈核酸或單鏈 核酸。雖然核酸外切酶可以是截然不同的實體（不同的酶，具有唯一的降解核酸的功能）， 例如5'RNA核酸外切酶和來自大腸桿菌的核酸外切酶I，其中，在真核生物和原核生物中都 發現了 5' RNA核酸外切酶，其用于mRNA的轉換，而來自大腸桿菌的核酸外切酶I以3' -5' 方向降解單鏈DNA，很多核酸外切酶活性來自具有多種功能的酶，例如，很多DNA聚合酶也 具有3'和/或5'核酸外切酶活性（來自強烈火球菌的Pfu DNA聚合酶）。
[0093] 因此，用于本發明方法的具有3'核酸外切酶活性的組分包括能夠從3'端降解核 酸的任何要素。在本發明的優選方面，具有3'核酸外切酶活性的組分優先作用于單鏈核酸， 艮P，它對單鏈分子比對雙鏈具有更大的活性，例如，對單鏈核酸分子具有至少2、3、4、5、10、 20、50或100倍活性。
[0094] 包含核酸外切酶活性的組分必需能夠完全地或部分地降解未結合的鄰近探針的 核酸結構域，未結合的鄰近探針即沒有結合到靶標分析物的探針，其中，所述核酸結構域具 有游離的且未被保護的3'端。如下面所討論的，鄰近探針的核酸結構域可以由能夠參與沃 森-克里克型或同功堿基對相互作用的任何核苷酸殘基所構成。然而，在一些具體實施方 式中，其中，核酸結構域包括DNA，具有3'核酸外切酶活性的組分作用于DNA，且優選地，其 對DNA具有比對RNA更高的活性，例如，其對DNA具有對RNA的至少2、3、4、5、10、20、50或 100倍活性。類似地，在【具體實施方式】，其中，核酸結構域包括RNA，具有3'核酸外切酶活性 的組分作用于RNA，且優選地，其對RNA具有比對DNA更高的活性，例如，其對RNA具有對DNA 的至少2、3、4、5、10、20、50或100倍活性。
[0095] 在本發明的一個方面，具有3'核酸外切酶活性的組分是酶。在特別優選的具體實 施方式中，所述酶是同樣具有3'核酸外切酶活性的能夠延伸核酸分子3'端的核酸聚合酶。 特別地，具有3'核酸外切酶活性的組分是選自包括如下物質的組的任一個或多個：強烈火 球菌（Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌（Pwo)DNA聚合酶以及它們的序列-修飾衍生物或突變 體，如上所描述。因此，在一些【具體實施方式】中，具有3'核酸外切酶活性的組分可以是超嗜 熱酶，特別是如上定義的具有3'核酸外切酶活性的超嗜熱聚合酶。
[0096] 在其他【具體實施方式】中，用于鄰近探針核酸結構域（和/或夾板寡核苷酸）的延 伸的聚合酶活性可以由無3'核酸外切酶活性或具有最小3'核酸外切酶活性的酶，例如 Pfu (外切-)DNA聚合酶、Pwo (外切-)DNA聚合酶等來提供，并且，包括3'核酸外切酶組分 可以作為獨立的實體而被提供，獨立的實體例如是具有3'核酸外切酶活性的其它酶。因此， 無3'核酸外切酶活性或具有最小3'核酸外切酶活性的聚合酶可以是如上定義的超嗜熱聚 合酶。在另外的【具體實施方式】中，可以以多種形式來包括具有3'核酸外切酶活性的組分， 艮P，可以提供多于一種的有3'核酸外切酶活性的組分，例如，作為聚合酶的一部分以及作為 具有其主要功能3'核酸外切酶活性的獨立的酶。在本發明的一個方面，具有3'核酸外切 酶活性的組分是核酸外切酶I。
[0097] 有利地，在核酸結構域延伸所需的組分即聚合酶之前或與之同時，但是在鄰近探 針的核酸結構域已相互作用之后，具有3'核酸外切酶活性的組分與樣品接觸以形成雙鏈 體。在該方面，與樣品接觸時，鄰近探針的核酸結構域必需至少是部分單鏈的，以便在結合 到靶標分析物后它們能夠相互作用。因此，如果在前述雙鏈體形成之前存在（以活性形式 存在）具有3'核酸外切酶活性的組分，那么具有游離且未被保護的3'端的所有鄰近探針 的核酸結構域將對降解敏感。相反，一旦結合到靶標分析物的鄰近探針之間已經形成了雙 鏈體，那么只有未結合的鄰近探針的核酸結構域可降解。
[0098] 在【具體實施方式】中，其中如上所述的聚合酶具有3'核酸外切酶活性，所述聚合酶 (即具有3'核酸外切酶活性的組分）可在鄰近探針的核酸結構域已相互作用之前接觸樣 品，其中，鄰近探針的核酸結構域是在聚合酶具有最小活性或無活性的條件下相互接觸的， 例如室溫或標準環境溫度。在這些條件下，具有3'核酸外切酶活性的組分將不會干擾鄰近 結合的探針的核酸結構域之間的相互作用，因為所述酶是無活性的。
[0099] 沒有結合到靶標分析物的探針不會形成穩定的雙鏈體，并且，雖然它們會與其它 未結合探針或樣品的其它組分相互作用，但是這些相互作用很可能是短暫的（暫時的），從 而意味著，一旦加入到樣品中或被活化（就具有3'核酸外切酶活性的超嗜熱聚合酶而言）， 這些探針的核酸結構域將是具有3'核酸外切酶活性的組分的可利用的底物。
[0100] 如果具有3'核酸外切酶活性的組分與樣品接觸且同時與核酸結構域延伸所需的 組分接觸，例如其中所述聚合酶具有3'核酸外切酶活性，那么延伸反應和降解反應將同時 發生。
[0101] 如果具有3'核酸外切酶活性的組分在核酸結構域延伸所需的組分之前與樣品接 觸，例如其中具有3'核酸外切酶活性的獨立的酶（無實質的或可檢測到的聚合酶活性）與 樣品接觸，那么在延伸反應之前，未結合探針的具有游離且未被保護的3'端的核酸結構域 將被降解，且具有3'核酸外切酶活性的組分會被滅活（例如，移除、抑制或變性）。然而，在 延伸步驟和擴增步驟，3'核酸外切酶活性會被保留。
[0102] 在一個【具體實施方式】中，在擴增延伸產物的步驟之前，具有3'核酸外切酶活性的 組分是滅活的，以便阻止擴增步驟所需組分的降解。術語"滅活"（inactivated)意思是組 分被例如熱所抑制、變性或者從樣品中物理移除。在該方面，僅3'核酸外切酶活性需要滅 活。
[0103] 例如，其中延伸產物由PCR擴增，標準的未修飾引物（具有游離且未被保護的3' 端）是3'核酸外切酶的底物，不能滅活該活性會導致這些PCR試劑的降解從而限制擴增或 使擴增無法進行。
[0104] 在一個優選的【具體實施方式】中，在樣品接觸具有3'核酸外切酶活性的組分之前， 將擴增反應所用的一些或全部試劑加入到樣品。在特別優選的【具體實施方式】中，在上述步 驟（b'）和（c)之間，加入所述試劑。可選地，擴增反應所用的一些或全部試劑與具有3'核 酸外切酶活性的組分同時加入到樣品，即同時地或同步地。
[0105] 在一個【具體實施方式】中，以修飾形式提供引物，以便它們具有抗3'核酸外切酶活 性。對核酸分子進行修飾或對核酸分子包含的核苷酸進行修飾以阻止核酸外切酶引起的降 解，這是本領域公知的，且通常是利用受保護端的，例如3'端的，一個或多個殘基的修飾。本 發明的方法可以利用適合于抗3'核酸外切酶活性的保護的任何修飾。在該方面，用于本發 明的引物優選包含3'端至少一個修飾的核苷酸。例如，所述修飾可選擇下述的任一個或多 個：硫代磷酸酯-修飾的核苷酸、鎖核酸核苷酸（不可進入的RNA核苷酸）、2' -OMe-CE亞 磷酰胺修飾的核苷酸，或肽核酸核苷酸。
[0106] 對于本發明方法中延伸產物的擴增步驟，使用"熱起始"引物（描述于Kaboev等 人，2000，核酸研究，28(21)，e94 頁（Kaboev et al·，2000, Nuc. Acids Res. ,28(21)，ρρ· e94)，其通過引用整體并入本文）是有利的。熱起始引物是寡核苷酸引物，其包含依賴于3' 端和5'端互補區的莖-環結構。在該方面，將引物設計為與靶序列（延伸產物的特定區 域）互補，并且將至少5-6個核苷酸添加到引物的5'端，形成與引物3'端互補的序列。在 低溫，例如反應的組分進行混合的溫度或進行延伸反應的溫度，引物形成莖環結構且不能 發揮延伸產物擴增的有效引物的作用。然而，在加熱至PCR退火溫度之后，引物獲得了線性 結構且能夠開始引物延伸（擴增）。據認為，熱啟動引物的使用可阻止PCR引物對本方法鄰 近探針之間相互作用的干擾且進一步保護所述引物免受3'核酸外切酶活性的影響。
[0107] 在本發明的一個特別優選的【具體實施方式】中，一些或全部反應組分，"反應混合 物"，例如鄰近探針、聚合酶、擴增試劑和檢測試劑，可同時接觸或在同一反應容器中接觸， 以便在不加入任何其它組分的情況下能夠產生擴增產物，該擴增產物在樣品中靶標分析物 存在時是無活性的。因此，可在單一反應容器中，例如反應管中，來準備"反應混合物"，以實 現"封閉的"或"封閉管"反應。在這一【具體實施方式】中，可以通過將反應混合物的溫度提高 到足以活化聚合酶的溫度來開始延伸反應，即以便使核酸雙鏈體的至少一個核酸結構域延 伸以生成延伸產物。合適的溫度和反應條件在下面進行詳細描述，但是其可以是至少35°C， 優選至少 37°C，例如至少 40、45、50、55、60、65、70 或 75°C。
[0108] 在一些【具體實施方式】中，延伸產物的擴增步驟可以在相同的反應容器中進行，即 可以修飾反應條件來開始擴增反應，例如PCR。下面描述了合適的PCR條件。在其它具體實 施方式中，可以將含有延伸產物的反應混合物的一份轉移到新的反應容器中，分析的剩余 步驟可在一個或多個分開的反應容器中進行。
[0109] 在本發明的另一【具體實施方式】中，一個或多個鄰近探針的核酸結構域可作為展開 的鄰近探針而被提供，其包含偶聯至具有至少一個發夾結構的核酸結構域的分析物結合結 構域。發夾結構也被稱為發夾-環或莖-環，這些術語在本文中可互換使用。發夾是可發 生在單鏈DNA或RNA分子中的分子內堿基配對模式。當同一鏈的兩個區域通過堿基配對形 成了雙螺旋（雙鏈體）時，發夾發生，其中，沿反方向閱讀時所述兩個區域在核苷酸序列上 通常是互補的，且所述雙螺旋（雙鏈體）終止于不配對的環即單鏈環。可將產生的結構描 述為棒棒糖形狀（lollipop-shaped)。
[oho] 在本發明的一個優選的【具體實施方式】中，一個或多個鄰近探針的核酸結構域被提 供，以便游離的3'可延伸端能夠形成發夾結構。因此，一個或多個鄰近探針可提供為展開 鄰近探針，其中，發夾結構可以是展開的以使核酸結構域的3'端與反應混合物中的其它核 酸分子相互作用，如上所述，以便與第二鄰近探針的核酸結構域形成雙鏈體，其中所述第二 鄰近探針結合到與第一、展開鄰近探針鄰近的靶標分析物上。因此，展開后，（如上定義的） 第一和第二鄰近探針的核酸結構域互相互補，或與通用模板互補。雖然不希望受理論約束， 但是理論認為，使用展開鄰近探針可阻止或降低鄰近探針之間非特異性/背景相互作用的 數目，即，兩個鄰近探針核酸結構域中的一個或者二者的3'端不能自由地相互作用或者僅 是暫時地游離的，那么就不大可能發生鄰近探針之間的非特異性相互作用，例如，鄰近探針 不結合至靶標分析物的相互作用。
[0111] 在本發明的使用一個或多個展開鄰近探針的【具體實施方式】中，明顯的是，對于鄰 近探針的直接或間接相互作用的核酸結構域而言，一個或多個展開探針的核酸結構域必需 是展開的。在一些【具體實施方式】中，可以設計一個或多個展開鄰近探針的核酸結構域的發 夾結構，以使發夾結構是不穩定的，如此，在分析的條件下，發夾結構可以隨機地由開放形 式（展開、線性狀態）轉變為封閉形式（折疊的發夾狀態）。可對發夾結構進行設計以確保 鄰近探針的核酸結構域之間形成的雙鏈體比發夾結構更穩定。因此，如果一個或多個展開 鄰近探針的核酸結構域展開在可形成穩定相互作用的核酸的鄰近處，例如在結合至靶標分 析物的探針的鄰近處，那么在反應條件下不易斷裂的延伸雙鏈體將形成，即這樣的核酸雙 鏈體：該雙鏈體中的一個或多個游離3'端可使用該雙鏈體的另一鏈為模板通過聚合酶來 延伸。
[0112] 在其它【具體實施方式】中，可將一個或多個展開鄰近探針的核酸結構域設計為在其 它條件下展開。也可通過將發夾結構的雙鏈元件的至少部分斷裂而實現展開。這可以通過 改變樣品條件而實現，以便發夾結構不再是熱力學有利結構，例如，通過改變溶液的溫度或 鹽濃度。因此，在一些【具體實施方式】中，活化聚合酶所需的溫度的提高可有利于展開過程， 艮P，促進開放形式或狀態的而非封閉形式或狀態的鄰近探針。
[0113] 可選地，通過使發夾結構的雙鏈元件與"抗封閉"寡核苷酸競爭可使發夾結構展 開。例如，在高濃度的、與發夾結構的一條鏈互補的抗封閉寡核苷酸存在的情況下，抗封閉 寡核苷酸與鄰近探針的核酸結構域之間的相互作用（雜交）強于發夾結構。因此，在本發 明的鄰近分析中，"抗封閉"寡核苷酸可以是鄰近探針的核酸結構域的形式，例如，延伸模板 寡核苷酸或夾板寡核苷酸。明顯的是，當鄰近探針都結合到分析物時，所述探針的核酸結構 域以高的局部濃度而有效存在。因此，如果鄰近探針的核酸結構域之間的相互作用（雜交） 比展開鄰近探針的發夾結構的元件之間的相互作用更穩定（熱力學有利的），那么發夾結 構將展開以實現鄰近探針的核酸結構域之間的相互作用。
[0114] 在一些優選的【具體實施方式】中，鄰近分析包括一個或多個展開鄰近探針。在這樣 的【具體實施方式】中，明顯的是，這樣的展開鄰近探針的發夾結構可以在同一反應中以不同 的方式來展開，例如，第一展開鄰近探針可通過抗封閉寡核苷酸而展開，第二展開鄰近探針 可通過與另一鄰近探針的核酸結構域競爭而展開。例如，展開第一鄰近探針可產生引起第 二鄰近探針的發夾結構斷裂的互補區域。
[0115] 在其它【具體實施方式】中，一個或多個展開鄰近探針可以與"標準"非-展開鄰近探 針聯合使用。在優選的【具體實施方式】中，這樣的標準鄰近探針可利用封閉寡核苷酸（如下 所進一步描述）來保護（掩飾或遮蔽）所述鄰近探針的核酸結構域的反應元件，以便使它 們與其它鄰近探針的核酸結構域或樣品中的其它組分的相互作用最小化。
[0116] 第一和第二鄰近探針的核酸結構域可被視為相互作用以形成可檢測的產物的核 酸"標記"，可檢測所述產物以報告對分析物的檢測。因此，核酸結構域可被視為反應核酸官 能度，其相互作用以提供信號，借助該信號可檢測分析物（更具體地，形成信號-發出的產 物）。換言之，核酸結構域可被視為"檢測標記"，其相互作用以形成"檢測"標記或產物，或 者其能夠形成檢測"標記或產物。當同一樣品中存在兩個或多個分析物時，可以使用兩組或 多組鄰近探針同時對它們進行檢測，其中，將每組鄰近探針設計為在相互作用后形成一個 或多個唯一的核酸序列延伸產物或"檢測標記"。在擴增同時或之后，使用文獻中已知的方 法分別對這些唯一的"檢測標記"進行檢測和定量，文獻中已知的方法包括液相色譜法、電 泳法、質譜分析法、DNA測序、基于微球的以及平面的DNA陣列技術和多色實時PCR。
[0117] 在優選的【具體實施方式】中，通過定量PCR(qPCR)來對可檢測標記（即延伸產物） 進行擴增和檢測，定量PCR(qPCR)也稱為實時PCR。在特別優選的【具體實施方式】中，qPCR使 用了插入核酸分子以提供檢測信號的染料，所述檢測信號優選是熒光信號。在本發明中特 別有用的熒光插入染料是SYBR Green?和EvaGreen?，雖然本發明qPCR【具體實施方式】并不 限于這些染料。
[0118] 在本發明的方法中，第一和第二鄰近探針的核酸結構域的一個或兩個可被延伸， 這會導致可被擴增和檢測的新的核酸分子或"延伸產物"的形成。
[0119] 在一些【具體實施方式】中，在一個核酸結構域延伸之后，核酸結構域可被連接到一 起（即分子間連接），以產生延伸產物或檢測標記，即，使用"夾板"寡核苷酸作為模板由聚 合酶"填入"核酸結構域之間的間隙。在核酸結構域被連接的【具體實施方式】中，這種連接由 夾板介導，如上所述，可認為所述夾板是鄰近探針之一的核酸結構域的一部分，即，其中核 酸結構域是部分雙鏈的。夾板可以作為游離核酸分子而提供，或者夾板可以作為第三鄰近 探針的核酸結構域而被提供。
[0120] 所述連接引起可被擴增和檢測的新的核酸分子或序列的形成。
[0121] 在優選的【具體實施方式】中，本發明的方法不包括連接反應或步驟。更特別地，本發 明的方法不包括連接鄰近探針的核酸結構域的步驟，例如，本發明不包括分子間連接，即， 其中兩個或多個核酸分子，例如兩個或多個鄰近探針的核酸結構域相連接以形成單一核酸 分子。然而，在一些【具體實施方式】中，本發明的方法可包括分子內連接，例如，其中單一鄰近 探針的核酸結構域（例如，夾板寡核苷酸）（在其已延伸之后）進行連接以形成環狀核酸分 子，或者，其中鎖式探針使用核酸結構域的延伸部分作為連接模板而進行連接。
[0122] 核酸結構域可以是單鏈核酸分子（例如，寡核苷酸），部分雙鏈且部分單鏈的分 子，或者雙鏈分子，所述雙鏈分子包括雙鏈區域和兩條核酸鏈不互補因此是單鏈的區域。因 此，在特定的【具體實施方式】中，核酸結構域由單鏈核酸組成。在其它【具體實施方式】中，核酸 結構域可以由兩條部分互補的核酸鏈組成，其中，這兩條鏈包括雜交的區域和未雜交的區 域。在其它【具體實施方式】中，如上所述，核酸結構域可包括發夾結構。
[0123] 第一和第二鄰近探針的核酸結構域必需能夠通過雜交而相互作用，即形成一個或 多個雙鏈體。這種相互作用可以是直接的，例如，核酸結構域包括彼此互補的區域，優選在 它們的3'端（雖然互補區域可以在一個核酸結構域的內部，參見圖1的版本2和4)，或者， 這種相互作用也可以是間接的，例如，所述第一和第二鄰近探針的核酸結構域可以各自與 稱作"夾板"寡核苷酸的區域雜交。
[0124] 核酸結構域通常都足夠長，以便當結合到靶標分析物（夾板-介導的相互作用） 時能與另一鄰近探針的核酸結構域相互作用。核酸結構域的長度范圍通常是約8個至約 1000個核苷酸，其中，在特定的【具體實施方式】中，它們的長度范圍是約8個至約500個核苷 酸，包括約8個至約250個核苷酸，例如，約8個至約160個核苷酸，諸如約12個至約150個 核苷酸，約14個至約130個核苷酸，約16個至約110個核苷酸，約8個至約90個核苷酸， 約12個至約80個核苷酸，約14個至約75個核苷酸，約16個至約70個核苷酸，約16個至 約60個核苷酸，等等。在特定的具有代表性的【具體實施方式】中，核酸結構域的長度范圍是 約10個至約80個核苷酸，約12個至約75個核苷酸，約14個至約70個核苷酸，約34個至 約60個核苷酸，以及上述長度范圍間的任何長度。在一些【具體實施方式】中，核酸結構域的 長度通常不大于約 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、46、50、55、60、 65或70個核苷酸。
[0125] 核酸結構域可以由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸以及合成的核苷酸殘基組 成，所述合成的核苷酸殘基能夠參與沃森-克里克型或同功堿基對相互作用，即"雜交"或 形成"雙鏈體"。因此，核酸結構域可以是DNA或RNA或它們的任何變型，例如PNA或含有非 核苷酸主鏈的其它衍生物。
[0126] 第一和第二鄰近探針的核酸結構域的序列（即"檢測"核酸結構域）可以是這樣 的任何序列：其能夠形成雙鏈體且可相對彼此或夾板，如果存在，而被選擇。因此，只要第一 和第二結構域可以彼此雜交，或雜交至第三核酸結構域（夾板），那么所述序列就不至關重 要。然而，應當對所述序列進行選擇，以避免如下雜交事件的發生：沒有發生在第一和第二 鄰近探針的核酸結構域之間的雜交，或者不是與夾板寡核苷酸的核酸結構域發生的雜交。 一旦序列被選擇或鑒定，就可使用任何便捷的方法來合成核酸結構域。
[0127] 術語"擴增" (amplifying)或"擴增的" (amplified)在本文中通常用于包括在分析 中增加延伸產物或其部分的拷貝數的任何手段，作為指示樣品中靶標分析物存在的手段。 例如,本領域已知的任何擴增手段都可以用于本發明的方法中，例如,PCR、LCR、RCA、MDA等。 根據樣品中靶標分析物的豐度，可能需要擴增延伸產物或其部分，以使延伸產物的濃度翻 倍，即在擴增前存在的拷貝數的2倍。可選擇地，可以優選地使拷貝數增加多個數量級。在 一些【具體實施方式】中，樣品中的擴增結果包括了延伸產物或其部分的初始量的至少2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、50或75倍。在進一步優選的【具體實施方式】中，優選地擴增延伸產物 以使樣品包括延伸產物或其部分的初始量的至少1〇 2、1〇3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇 7、1〇8、1〇9、101°倍。
[0128] 明顯的是，不需要擴增所有延伸產物以確定樣品是否包括靶標分析物。僅有必要 擴增一部分延伸產物，所述延伸產物在延伸反應發生之前不存在與樣品中。例如，延伸產物 將有效地包括兩部分：含有由鄰近探針（或夾板）的核酸結構域構成的核苷酸序列的第一 "舊的"部分（現有的部分），和含有由模板化的延伸反應生成的核苷酸序列的第二"新的" 部分（延伸的部分）。對第二"新的"部分或"延伸"的部分的檢測使得能夠檢測靶標分析 物，即如果沒有分析物，就沒有延伸，因此沒有"新的"或"延伸的"部分。因此，在本發明優 選的方面，擴增延伸產物的步驟包括擴增延伸產物的延伸部分的一部分。
[0129] 一部分延伸的部分需要具有足夠的尺寸以使其可以與存在于樣品中的其它序列 區分開。實際上，延伸產物的延伸部分的部分充當與靶標分析物的存在相對應的獨特的標 志物或信號。因此，如果該部分包括了不存在于樣品中的核苷酸序列，則該序列的擴增足以 指示樣品中靶標分析物的存在和定量。
[0130] 因此，所述部分可以包括至少8個核苷酸，優選至少9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20個核苷酸。延伸產物的延伸部分的部分長度范圍通常是約8個至約1000個核 苷酸，其中在特定的【具體實施方式】中，它們的長度范圍是約8個至約500個核苷酸，包括約 8個至約250個核苷酸，例如，約8個至約160個核苷酸，諸如約12個至約150個核苷酸， 約14個至約130個核苷酸，約16個至約110個核苷酸，約8個至約90個核苷酸，約12個 至約80個核苷酸，約14個至約75個核苷酸，約16個至約70個核苷酸，約16個至約60個 核苷酸，等等。在特定的具有代表性的【具體實施方式】中，延伸產物的延伸部分的長度范圍是 約10個至約80個核苷酸，約12個至約75個核苷酸，約14個至約70個核苷酸，約34個至 約60個核苷酸，以及上述長度范圍間的任何長度。
[0131] 雖然設想的是可以擴增整個延伸產物，即現有的和延伸的部分，但擴增產物包括 延伸產物的延伸部分的至少一部分就足夠了。在本發明的一個方面，引物可以設計成在延 伸產物的延伸部分的部分的任一側，并且可以如下所描述的來檢測例如通過PCR進行的該 部分的擴增，和擴增產物（包括延伸產物的部分）。在本發明的另一個方面，延伸產物的延 伸部分的部分可以形成用于連接例如鎖式探針的（如本文別處所述的）模板以形成環狀寡 核苷酸，并且該序列的擴增，例如通過滾環擴增（RCA)進行的該序列的擴增會產生包括與 延伸產物的延伸部分的部分相對應的序列的多個拷貝而得到擴增產物。因此，以這種方式 可以擴增延伸產物，或更具體地擴增其部分。可選地或另外地，延伸產物的延伸部分的部分 可以充當用于環狀寡核苷酸的RCA的引物，所述寡核苷酸包括與延伸產物的延伸部分互補 的序列。如上所述，得到的產物會包括與延伸產物的延伸部分的部分相對應的序列的多個 拷貝，如下所述，可以對其進行檢測。因此，在該【具體實施方式】中，也擴增了延伸產物，或更 具體地擴增了其部分。
[0132] 在"夾板"寡核苷酸被延伸的【具體實施方式】中，所述延伸的寡核苷酸可以被環化 (即分子內連接）以提供用于擴增的模板，優選用于滾環擴增的模板。在這些具體實施方 式中，延伸的寡核苷酸的3'端（延伸端）連接于延伸的寡核苷酸的5'端（非延伸端），其 中所述連接可以由任何合適的手段來介導，如本文別處所描述的。在特別優選的具體實施 方式中，連接反應是模板化的連接，其中，延伸的寡核苷酸的3'端和5'端通過雜交于核酸 分子而彼此鄰近，所述核酸分子例如是加入到反應中以便在延伸的寡核苷酸的3'端和5' 端之間充當"夾板"或"分子橋"的寡核苷酸（如本文別處所述）。當延伸的寡核苷酸的末 端與"夾板"核酸分子雜交時，末端可以連接，例如通過連接酶的活性連接，以形成含有延伸 產物的延伸部分的環狀寡核苷酸。因此，所述環狀寡核苷酸的擴增，例如通過滾環擴增的擴 增，導致延伸產物的擴增。在這種情況下，擴增產物包括與延伸產物的延伸部分互補的序 列。因此，環化的寡核苷酸的擴增導致延伸產物的間接擴增。
[0133] 從上文顯而易見的是，延伸產物的延伸部分僅需要包括相對少量的核苷酸。此外， 延伸產物的最大尺寸將取決于鄰近探針的核酸結構域和/或充當用于延伸產物的模板的 夾板寡核苷酸（如下所定義）的尺寸。延伸產物可以由核酸結構域和/或夾板寡核苷酸的 全部或部分延伸而產生，即，延伸反應可以產生延伸到模板核酸的末端的延伸產物，或延伸 反應可以使用條件以使延伸產物僅為模板核酸的部分互補鏈。
[0134] 術語"檢測"（detecting)或"檢測"（detected)廣泛地用于本文中，包括測定分 析物存在（即，其存在與否）的任何手段或測量分析物的任意形式。在本發明的方法中，通 過擴增延伸產物（其包括擴增基于或來自延伸產物或使用延伸產物生成的產物）并檢測所 述擴增產物來間接地檢測分析物。因此，檢測分析物相當于檢測上述定義的擴增產物，并且 這些術語在本文中可互換使用。
[0135] 因此，"檢測"（detecting)可以包括以任何方式測定、測量、評估或分析分析物的 存在或不存在或量或位置。包括了定量和定性測定、測量或評估，包括半定量。這樣的測 定、測量或評估可以是相對的，例如當樣品中的兩種或多種不同的分析物被檢測時，或者這 樣的測定、測量或評估也可以是絕對的。因此，當用于定量樣品中的靶標分析物（或多種靶 標分析物）的情況下，術語"定量"是指絕對或相對定量。絕對定量可以通過包括已知濃度 (或多個濃度）的一種或多種對照分析物和/或將靶標分析物的檢測水平與對照分析物進 行對照（例如，通過生成標準曲線）來實現。可選地，相對定量可以通過比較兩種或多種不 同的靶標分析物的檢測水平或量以提供兩種或多種不同的靶標分析物中每個的相對定量， 即相對于彼此的量，來實現。
[0136] "分析物"可以是想要通過本發明的方法檢測的任何物質（例如分子）或實體。分 析物是本發明的分析方法的"靶標"。因此，分析物可以是希望檢測的任何生物分子或化學 化合物，例如，肽或蛋白質，或者核酸分子或小分子，包括有機分子和無機分子。分析物可以 是細胞或微生物，包括病毒或者其片段或其產物。因此，可以看出分析物可以是可形成特異 性結合伴侶（例如，親和結合伴侶）的任何物質或實體。所有要求的是，分析物能夠同時結 合至少兩個結合伴侶（更具體地，至少兩個鄰近探針的分析物結合結構域）。基于鄰近探針 的分析，如本發明的分析，在蛋白質或多肽的檢測中是特別有用的。因此，令人特別感興趣 的分析物可以包括蛋白質分子，諸如肽、多肽、蛋白質或者朊病毒或者包括蛋白質或多肽組 分的任何分子，等等，或者它們的片段。在本發明特別優選的【具體實施方式】中，分析物完全 地或部分地是蛋白質分子。分析物可以是含有兩個或多個分子亞基的單一分子或復合物， 所述亞基可以或可以不彼此共價結合，并且可以是相同的或不同的。因此，除了細胞或微 生物，這樣的復合物分析物也可以是蛋白質復合物。因此，這樣的復合物可以是均多聚體或 雜多聚體。例如蛋白質的分子的聚集體也可以是靶標分析物，例如相同蛋白質或不同蛋白 質的聚集體。分析物也可以是蛋白質或肽與諸如DNA或RNA的核酸分子之間的復合物。令 人特別感興趣的是蛋白質與核酸之間的相互作用，例如，調節因子，諸如轉錄因子和DNA或 RNA。
[0137] 包括所有的生物和臨床樣品，例如生物體的任何細胞或組織樣品，或者任何體液 或來自其的制劑，以及諸如細胞培養物、細胞制劑、細胞裂解物等的樣品。環境樣品也包括 在內，例如，土壤和水樣品或食物樣品。樣品可以是新鮮制備的，或者它們可以是以任何便 捷的方式被前處理過的，例如用于儲存。
[0138] 因此，代表性的樣品包括任何材料，所述材料可以含有生物分子，或任意其它希望 的分析物或靶標分析物，包括例如食物和有關產品、臨床樣品和環境樣品。樣品可以是生物 樣品，所述生物樣品可以含有任何病毒或細胞材料，包括所有原核或真核細胞、病毒、噬菌 體、支原體、原生質體和細胞器。因此，這樣的生物材料可以包括所有類型的哺乳動物細胞 和非哺乳動物細胞、植物細胞、包括藍綠藻的藻類、真菌、細菌、原生動物等。因此，代表性的 樣品包括全血和血衍生物產品、尿液、糞便、腦脊液或任何其它液體（例如，呼吸道分泌物、 唾液、乳汁等）、組織、活體組織切片、細胞培養物、細胞混懸液、條件培養基或細胞培養物成 分的其它樣品等，其中所述全血和血衍生物產品諸如是血漿、血清、白細胞層、血細胞。可以 按照任何便捷或理想的方式對樣品進行預處理以制備用于本發明的方法中，例如，通過細 胞裂解或分析物的純化、分離等。
[0139] 用于本發明方法的鄰近探針包括分析物結合結構域和核酸結構域，并且實際上， 它們是（通過分析物結合結構域）結合于分析物的檢測探針，可以通過在這樣的結合后檢 測其核酸結構域之間發生的相互作用來檢測所述檢測探針的結合（以檢測分析物）。因此， 可以將探針視為核酸標記的親和配體或針對分析物的結合伴侶，所述分析物結合結構域是 親和結合伴侶，并且核酸結構域是核酸標記。核酸結構域偶聯于分析物結合結構域，并且該 "偶聯"或連接可以采用本領域已知的任何手段，且其可以是所希望的或便捷的，可以是直 接的或間接的，例如通過連接基團。例如，結構域可以通過共價連接（例如化學交聯）或通 過非共價結合來彼此相連，例如，通過基于鏈酶親和素-生物素的偶聯（在一個結構域上提 供生物素，在另一個結構域上提供鏈酶親和素）。
[0140] 分析物結合結構域可以是針對靶標分析物的任何結合伴侶，并且可以是針對其的 直接或間接結合伴侶。因此，它可以直接結合于靶標分析物，或通過中間分子或結合于靶標 分析物的結合伴侶來間接地結合于靶標分析物，所述分析物結合結構域結合于所述中間分 子（結合伴侶）。特別地，分析物結合結構域或中間結合伴侶是針對分析物的特異性結合伴 侶。結合伴侶是能夠與其靶標結合的任意分子或實體，所述靶標例如是靶標分析物，并且， 特異性結合伴侶是能夠特異性結合于其靶標（例如靶標分析物）的結合伴侶，即結合伴侶 以比樣品中其它組分更高的親和力和/或特異性而結合于靶標（例如分析物）。因此，與靶 標分析物的結合可以區別于非靶標分析物；特異性結合伴侶不結合于非靶標分析物或可忽 略地或不可檢測地結合于非靶標分析物，或者任何這樣的非特異性結合，如果發生的話，就 可被區分。靶標分析物及其結合伴侶之間的結合通常是非共價的。
[0141] 可以選擇分析物結合結構域以具有針對靶標分析物的高的結合親和力。高的結合 親和力是指至少約1(Γ4Μ，通常至少約1(Γ4Μ或更高，例如1(Γ9Μ或更高。分析物結合結構域 可以是多種不同類型的分子的任一種，只要它在作為鄰近探針的部分存在時顯示針對靶標 蛋白的所需的結合親和力。在其它【具體實施方式】中，分析物結合結構域可以是對其靶標分 析物具有中等或甚至低親和力的配體，例如，小于約1(Γ 4Μ。
[0142] 分析物結合結構域可以是小分子配體或大分子配體。小分子配體是指尺寸為約50 至約10, 000道爾頓的配體，通常為約50至約5, 000道爾頓，更通常地為約100至約1000 道爾頓。大分子配體是指尺寸為約10, 〇〇〇道爾頓或分子量更大的配體。
[0143] 小分子可以是能夠以需要的親和力結合于靶標分析物的任何分子，以及它們的結 合部分或片段。一般地，小分子是能夠結合于感興趣的靶標分析物的有機小分子。小分子 會包括與靶標分析物結構相互作用所必需的一個或多個官能團，例如疏水、親水、靜電或甚 至共價相互作用所需的基團。當靶標分析物是蛋白質時，小分子配體包括與蛋白質在結構 上相互作用所需的官能團，如氫鍵、疏水-疏水相互作用、靜電相互作用等，并通常包括至 少一個氨基、酰胺基、巰基、羰基、羥基或羧基，優選地至少兩個化學官能團。小分子還可以 包括一個這樣的區域：其可以被修飾和/或參與鄰近探針的核酸結構域的共價連接，而基 本沒有不利地影響小分子結合于其靶標分析物的能力。
[0144] 小分子親和配體通常包括被一個或多個上述官能團取代的碳環或雜環結構和/ 或芳香或聚芳香結構。此外，令人感興趣的小分子還是在生物分子中發現的結構，它們的衍 生物、結構類似物或組合，其中在生物分子中發現的結構包括肽、多糖、脂肪酸、留體、嘌呤、 嘧啶。可以對這樣的化合物進行篩選以確定感興趣的化合物，其中多種不同的篩選方案在 本領域是已知的。
[0145] 小分子可以來自由多種來源獲得的天然存在或合成的化合物，包括合成或天然化 合物庫。例如，可以使用許多方法來隨機和定向合成多種有機化合物和生物分子，包括隨機 化的制備寡核苷酸和寡肽。可選地，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物庫是 可得的或容易制備的。此外，天然或合成制備的庫和化合物容易通過傳統的化學、物理和生 物化學手段修飾，并且可以用于制備組合庫。已知的小分子可以進行定向或隨機的化學修 飾，諸如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以產生結構類似物。
[0146] 如此，所述的小分子可以從天然存在或合成分子庫中獲得，所述的庫包括通過組 合手段制備的化合物庫，即化合物多樣性組合庫。當從這樣的庫中獲得時，在便捷的結合 親和力分析中采用的小分子會顯示對蛋白質靶標具有某些理想的親和力。組合庫及其制 備和篩選方法是本領域已知的，并描述于下述美國專利文獻中：US5, 741，713 ;5, 734, 018 ; 5, 731, 423 ；5, 721, 099 ；5, 708, 153 ；5, 698, 673 ；5, 688, 997 ；5, 688, 696 ；5, 684, 711 ； 5, 641, 862 ； ；5, 639, 603 ；5, 593, 853 ；5, 574, 656 ；5, 571, 698 ；5, 565, 324 ；5, 549, 974 ； 5, 545, 568 ; ;5, 541，061 ;5, 525, 735 ;5, 463, 564 ;5, 440, 016 ;5, 438, 119 ;5, 223, 409,這些 專利文獻通過引用整體并入本文。
[0147] 分析物結合結構域也可以是大分子。特別令人感興趣的大分子分析物結合結構域 是抗體，及其結合片段和衍生物或其模擬物。當抗體是分析物結合結構域時，它們可以來 自多克隆組合物，以使通過從特異性上進行區分的抗體的異種群體各自"標記"相同的標記 核酸（核酸結構域），或它們可以來自單克隆組合物，其中對靶標分析物具有相同特異性的 相同抗體的同種群體各自標記相同的標記核酸。因此，分析物結合結構域可以是單克隆抗 體或多克隆抗體。在其它【具體實施方式】中，親和配體是抗體結合片段或其衍生物或其模擬 物，其中這些片段、衍生物和模擬物對靶標分析物具有所需要的結合親和力。例如，抗體片 段，諸如？1?( &13)2和？&13，可以通過裂解完整蛋白質來制備，例如，通過蛋白酶或化學裂解 來進行裂解。令人感興趣的還有重組地或合成地制備的抗體片段或衍生物，諸如單鏈抗體 或scFvs,或者其它抗體衍生物諸如嵌合抗體或CDR-接枝的抗體，其中該重組地或合成地 制備的抗體片段保留了上述抗體的結合特性。這樣的抗體片段或衍生物通常至少包括抗體 的V H和 '結構域，以保留主體抗體的結合特性。本發明的這樣的抗體片段、衍生物或模擬 物可以使用任何便捷的方法制備，諸如在美國專利第5, 851，829號和第5, 965, 371號中公 開的方法；這些專利通過引用整體并入本文。
[0148] 上面描述的抗體、其片段、衍生物和其模擬物可以由商業來源獲得和/或使用任 何便利的技術制備，其中制備多克隆抗體，單克隆抗體，它們的片段、衍生物和模擬物的方 法，包括制備它們的重組衍生物的方法，是本領域技術人員已知的。
[0149] 此外，適合用作結合結構域的是多聚核酸適體。多聚核酸適體可以是RNA寡 核苷酸，其作用是以與受體或抗體相同的方式選擇性地結合蛋白質（Conrad等人， 酶學方法·（1996),267(組合化學），336-367) (Conrad et al·，Methods Enzymol. (1996)，267 (Combinatorial Chemistry)，336-367)。在分析物結合結構域是例如適體的核 酸的特定【具體實施方式】中，靶標分析物并不是核酸。
[0150] 重要的是，分析物結合結構域是包括如下部分的結構域：該部分能夠共價連接于 核酸分子結構域而基本不消除分析物結合結構域對其靶標分析物的結合親和力。
[0151] 除了基于抗體的肽/多肽或基于蛋白質的結合結構域，分析物結合結構域也可以 是凝集素，可溶性的細胞表面受體或其衍生物，親和體或來自如下的任意組合衍生的蛋白 質或肽：噬菌體展示或核糖體展示或任何類型的組合肽或蛋白質庫。可以使用任意分析物 結合結構域的組合。
[0152] 分析物上的結合位點可以是相同的或不同的，所述結合位點是針對一組中的鄰近 探針的各分析物結合結構域的。因此，例如在同聚蛋白質復合物或聚集物包括兩種或多種 相同的亞基或蛋白質組分的情況下，兩個或多個探針的分析物結合結構域可以是相同的。 當分析物為單一分子或包括不同的亞基或組分時（例如，異聚復合物或不同蛋白質聚集 體），分析物結合結構域是不同的。
[0153] 由于鄰近探針的核酸結構域的長度可以構建成跨越不同的分子距離，分析物上的 針對分析物結合結構域的結合位點不需要在相同的分子上。它們可以在不同的但是緊挨著 的分子上。例如，可以通過本發明的方法靶向生物體的多個結合結構域，所述生物體例如是 細菌或細胞，或病毒。
[0154] 如上所述，分析物結合結構域可以直接或間接地結合于分析物上。在間接結合的 情況下，靶標分析物可以首先被特異性結合伴侶（或親和配體）所結合，并且鄰近探針的分 析物結合結構域可以結合于特異性結合伴侶。這使得鄰近探針能夠作為通用試劑來設計。 例如，分析物特異性結合伴侶可以是抗體，并且通用鄰近探針可以通過結合于各種不同的 分析物特異性抗體的Fc區域而用于檢測不同的分析物。
[0155] 鄰近探針的兩個組分通過鍵直接地連接在一起或通過連接基團間接地連接在一 起。當采用連接基團時，可以選擇這樣的基團以提供核酸和分析物結合結構域通過連接基 團進行共價連接，以及維持分析物結合結構域對其靶標分析物理想的結合親和力。令人感 興趣的連接基團可以根據分析物結合結構域而有很大不同。在很多【具體實施方式】中，當連 接基團存在時，其是生物惰性的。各種連接基團是本領域技術人員已知的，并且在所述鄰 近探針中是有用的。在具有代表性的【具體實施方式】中，連接基團通常為至少約50道爾頓， 通常為至少約100道爾頓，并且可以是1000道爾頓或更大，例如，如果連接基團含有間隔 子（spacer)那么可高達1000000道爾頓，但是通常不會超過約500道爾頓且通常不超過約 300道爾頓。通常地，這樣的連接物包括間隔子基團，該基團在任一端以能夠共價結合于核 酸或分析物結合部分的反應官能團封端。令人感興趣的間隔子基團可以包括脂肪族和不飽 和的烴鏈、含有雜原子如氧（醚，如聚乙二醇）或氮（多胺）的間隔子、肽、糖類、可以含有 雜原子的環狀或非環狀系統。間隔子基團也可以包含結合于金屬的配體，以使金屬離子與 兩個或多個配體配位以形成復合物。特異性的間隔子元件包括：1，4-二氨基己烷，苯二甲 撐二胺，對苯二甲酸，3, 6-二氧雜辛烷二酸，乙二胺-N，N-二乙酸，1，Γ -亞乙基雙（5-氧 代-3-吡咯烷羧酸），4, 4'-亞乙基二哌啶。可能的反應官能團包括親核官能團（胺、醇、 硫醇、酰肼），親電官能團（醛、酯、乙烯基酮、環氧化物、異氰酸酯、馬來酰亞胺），能夠環加 成反應、形成二硫鍵或者結合于金屬的官能團。具體的例子包括伯胺和仲胺，異羥肟酸， N-羥基琥珀酰亞胺酯，N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯，氧基羰基咪唑，硝基苯基酯，三氟乙基 酯，縮水甘油醚，乙烯基砜和馬來酰亞胺。可用于所述鄰近探針的具體的連接基團包括雜官 能化合物，諸如疊氮苯甲酰肼、N-[4-(對疊氮基水楊基氨基）丁基]-3' _[2' -吡啶基二硫 代]丙酰胺）、雙-磺基琥珀酰亞胺辛二酸酯、二亞胺代己二酸二甲酯、二琥珀酰亞胺酒石 酸酯、N-馬來酰亞胺丁酰基氧基琥珀酰亞胺酯、N-羥基硫代琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲 酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-疊氮基苯基]_1，3'_二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-碘乙 酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛和琥珀酰亞氨基-4_[N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧酸 酯、3-(2-吡啶二硫代）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SH)P)、4-(N-馬來酰亞胺甲基）-環己 烷-1-羧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SMCC)以及類似的物質。
[0156] 可以使用任何便捷的方法來制備本發明的方法所采用的鄰近探針。在具有代表 性的【具體實施方式】中，核酸結構域可以直接或通過連接基團綴合于分析物結合結構域。如 本領域已知的，可以通過官能團而將組分彼此共價連接，其中，這樣的官能團可以存在于組 分上或使用一個或多個步驟而被引入到組分中，所述步驟例如是氧化反應、還原反應、裂解 反應等。可用于將組分共價連接到一起以產生鄰近探針的官能團包括：羥基、巰基、氨基 等。經修飾以提供用于共價連接的不同組分的具體部分可以經選擇以便于基本上不會不 利地干擾組分對靶標分析物所需的結合親和力。如果必要和/或需要的話，可以使用如本 領域已知的封閉基團來保護組分的某些部分，參見例如Green和Wuts著，有機合成中的保 護基團（John Wiley&Sons 出版社）（1991) (Green&Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis(John Wiley&Sons) (1991))。用于產生核酸/抗體綴合物的方法對本領域技術 人員是眾所周知的。參見美國專利第5, 733, 523號，其通過引用而整體并入本文。
[0157] 在其它【具體實施方式】中，可以使用產生核酸-蛋白質綴合物的體外方法來 制備鄰近探針，所述核酸-蛋白質綴合物即具有共價連接至蛋白質的核酸的分子， 例如編碼序列，即其中通過載體在體外產生編碼鄰近探針的分析物結合結構域。這 樣的令人感興趣的體外方法包括：基于R印A的方法（參見Fitzgerald,藥物發 現·今天（2000)5:253-258(Fitzgerald, Drug Discov.Today(2000)5:253-258)和 國際專利W098/37186)，基于核糖體展示的方法（參見Hanes等人，美國科學院院 刊（1997)94:4937-42(Hanes et al.，Proc. Natl Acad.Sci. USA(1997)94:4937-42); Roberts,生物化學當代觀點（1999)六月；3:268-73 (Roberts, Curr Opin Chem Biol (1999) Jun ;3:268-73) ;Schaffitzel 等人，免疫學方法雜志（1999)十二月 10 ; 231:119-35(Schaffitzel et al.，J Immunol Methods(1999)Decl0;231:119-35);和國際 專利 W098/54312)等。
[0158] 在利用夾板寡核苷酸（其可以是第三鄰近探針的核酸結構域）的【具體實施方式】 中，所述夾板寡核苷酸的功能是介導第一和第二鄰近探針的核酸結構域（即"檢測"結構 域）之間的相互作用。如上所述，夾板寡核苷酸也可充當待延伸的的核酸結構域，產生延伸 產物以根據本發明方法而被擴增和檢測。因此，夾板可以視為"連接者"（connector)寡核 苷酸，其作用是使第一和第二鄰近探針的檢測結構域進行連接或"結合在一起"，如此，它們 可相互作用或可連接在一起。可選地，本發明的方法并不包括連接反應或步驟，特別是分子 間連接，即，其中，第一和第二鄰近探針的核酸結構域是連接在一起的。可選地或另外地，夾 板可以視為核酸結構域或標記的可延伸的結構域，或者單獨的核酸結構域，其充當用于延 伸的"引物"以生成用于擴增和檢測的延伸產物。
[0159] 在這些【具體實施方式】中，夾板與第一和第二鄰近探針的核酸結構域雜交。更具體 地，夾板同時與至少第一和第二鄰近探針的核酸結構域雜交（退火）。然而，其中，將"夾板" 寡核苷酸預雜交至至少一個所述鄰近探針的核酸結構域，它先與一個鄰近探針的核酸結構 域雜交，再與另一個雜交。然而，優選地，"夾板"將與兩個鄰近探針的核酸結構域同時雜交 以形成能夠被延伸的穩定復合物。
[0160] 當夾板寡核苷酸作為第三鄰近探針的核酸結構域提供時，所有鄰近探針組的核酸 結構域的這種相互雜交提高了結合于靶標分析物后的探針-靶標復合物的親和力。通過支 持產生信號的鄰近探針-靶標分析物復合物的形成，該親和力的影響有助于提高分析的靈 敏性。
[0161] 本文所用的術語"雜交（hybridisation) "和"雜交（hybridise) "是指核苷酸序列 之間的雙鏈體的形成，所述核苷酸序列足夠互補以通過沃森-克里克堿基配對來形成雙鏈 體。當兩個核苷酸序列具有堿基配對組織同源性時，兩個核苷酸序列彼此"互補"。"互補" 的核苷酸序列在合適的雜交條件下將特異性地結合以形成穩定的雙鏈體。例如，當第一序 列的一部分可以按照反式平行的方式結合于第二序列的一部分時，兩個序列是互補的，其 中每個序列的3'端結合于另一個序列的5'端，并且一個序列的每個A、T(U)、G和C與另 一個序列的T (U)、A、C和G分別配對。RNA序列也可以包括互補的A = U或U = A堿基對。 因此，在本發明中，兩個序列不需要為了"互補"而具有完美的同源性。通常當至少約80% (優選至少約90%，且最優選至少約95% )的核苷酸在限定長度的分子或結構域上具有確 定互補的堿基對組織時，兩個序列是充分互補的。因此，第一和第二鄰近探針的核酸結構域 含有對另一個鄰近探針的核酸結構域互補的區域。可選地，當使用夾板寡核苷酸時，第一和 第二鄰近探針含有與夾板寡核苷酸（可能存在于第三鄰近探針上）互補的區域，反過來說， 夾板寡核苷酸含有對第一和第二鄰近探針的每個核酸結構域互補的區域。
[0162] 互補的區域（S卩，雜交區域）的長度范圍是4_30bp，例如6-20、6-18、7_15或 8-12bp〇
[0163] 夾板核苷酸的長度通常足以提供第一和第二探針的核酸結構域進行如上文所述 的同時結合。在具有代表性的【具體實施方式】中，夾板寡核苷酸的長度范圍是約6至約500 個核苷酸，包括約20至約40個核苷酸，例如約25至約30個核苷酸。
[0164] 如上所述，第一和第二鄰近探針的核酸結構域之間的相互作用主要是雙鏈體的形 成，其中，核酸結構域的一個或兩個都可以被延伸，特別是使用另一個鄰近探針的核酸結構 域作為模板進行模板導向的延伸。這會導致形成完全雙鏈的核酸，例如其中兩個結構域完 全延伸，或導致形成部分雙鏈的分子，例如僅有一條單鏈延伸或兩條鏈部分的延伸。因此， 一個或兩個核酸結構域的延伸可以被認為是各自結構域的"接合"，例如，由兩條單鏈的分 子產生一個雙鏈核酸。
[0165] 在其它【具體實施方式】中，該"接合"可以是連接，特別地，其中，例如，第一鄰近探針 的核酸結構域被延伸以使其3'端與第二鄰近探針的5'端鄰近，以使得兩個結構域模板導 向連接，即分子間連接。在這種情況下，可清楚理解的是，連接模板可以由夾板提供，所述夾 板可以形成核酸結構域之一的部分，或可以在溶液中分別游離地被提供，或作為第三鄰近 探針的核酸結構域提供。這樣的連接可以使用連接酶進行，所述連接酶可以在聚合酶介導 的第一鄰近探針的核酸結構域的延伸之后加入反應中。
[0166] 因此，在本發明方法的優選的【具體實施方式】中，第一和第二探針的核酸結構域可 以借助這樣的反應而連接：該反應由雜交的夾板而被模板化，使所述核酸結構域連接（在 其中一個核酸結構域延伸后），并且對"連接"產物進行擴增和檢測，所述"連接"產物也是 延伸產物。因此，在這樣的【具體實施方式】中，夾板可以視為"夾板模板"或"連接模板"或"夾 板寡核苷酸"。在這樣的【具體實施方式】中，還可以延伸夾板以產生另外的"延伸產物"，對所 述"延伸產物"進行擴增和檢測。
[0167] 在一些【具體實施方式】中，本發明的方法不包括連接步驟或反應。更具體地，本發明 不包括分子間連接。
[0168] 如上所述，為了使核酸結構域之間發生各種相互作用，第一和第二鄰近探針的核 酸結構域需要按照特定的方向來偶聯到分析物結合結構域上。例如，為了延伸兩個包括單 鏈核酸的結構域，每個核酸結構域必須通過其5'端偶聯到分析物結合結構域，留下游離的 3'羥基端，當鄰近時，所述3'羥基端可以"退火"或"雜交"。然而，為了單一結構域的延伸 和/或兩個結構域的綴合，通常（雖然不是必須的，參見圖1的版本4)通過5'端偶聯第一 鄰近探針的核酸結構域（留下可以被延伸的游離的3'羥基端），而另外的結構域可以通過 其3'端偶聯（留下游離的5'磷酸酯端，其不能使用傳統聚合酶來延伸）。
[0169] 在核酸結構域是可連接的【具體實施方式】中，第一和第二核酸結構域各自雜交于夾 板或其中一個鄰近探針的核酸結構域是部分雙鏈的，其具有單鏈突出段，另一個鄰近探針 的核酸結構域雜交于該突出段的結構域。隨后可以將具有3'端的結構域通過模板導向的延 伸來延伸至另一個結構域的5'磷酸酯，其中可以利用連接酶將兩條鏈結合在一起。因此， 3'和5'端不立即在各自彼此鄰近地在夾板（模板）上雜交，而是雜交于夾板，在它們之間 留下空間（或一段核苷酸）。
[0170] 兩端之間的間隔或空間或一段核苷酸的長度范圍是約8至約1000個核苷酸，其 中，在特定的【具體實施方式】中，長度范圍是約8至約500個核苷酸，包括約8至約250個核 苷酸，例如約8至約160個核苷酸，諸如約12至約150個核苷酸，約14至約130個核苷酸， 約16至約110個核苷酸，約8至約90個核苷酸，約12至約80個核苷酸，約14至約75個核 苷酸，約16至約70個核苷酸，約16至約60個核苷酸，等等。在特定的代表性具體實施方 式中，核酸結構域的長度范圍是約10至約80個核苷酸，約12至約75個核苷酸，約14至約 70個核苷酸，約34至約60個核苷酸，和以及上述長度范圍間的任何長度。在一些具體實施 方式中，核酸結構域的長度通常不超過約28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、44、46、50、55、60、65 或 70 個核苷酸。
[0171] 因此，夾板可以包括與5'游離鄰近探針的核酸結構域互補的第一 3'區域，和與 3'游離鄰近探針的核酸結構域互補的第二5'區域。夾板的第一和第二區域的長度可以是 3至20,6至17,6至15或6至12或8至12個核苷酸，例如，約13至17,12至16,11至15 或12至14個核苷酸，或者約6至12, 7至11或8至10個核苷酸。
[0172] 如以下將更詳細地描述的，連接/延伸產物的擴增在檢測過程之前或與檢測過程 同時進行。因此，在一些【具體實施方式】中，所希望的是，設計夾板以盡量減少在這樣的步驟 中可能發生的任何假擴增，例如，夾板充當擴增中使用的聚合酶的模板的任何可能性。因 此，例如，夾板可以作為RNA寡核苷酸或DNA/RNA雜交體而被提供；通常用于擴增反應的聚 合酶，例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶，不能使用RNA模板。可選地，使用具有兩個 短雜交區域的DNA夾板可實現類似的效果；由于雜交是弱的，因此這樣的夾板將不能在PCR 所使用的高溫條件下模板化DNA聚合反應。
[0173] 可選地，在其它優選的【具體實施方式】中，使夾板有利地延伸以產生如上所定義的 延伸產物，根據本發明的方法對該延伸產物自身進行擴增與檢測。
[0174] 在特定的【具體實施方式】中，可針對兩種或多種不同的靶標分析物來分析樣品。在 這樣的【具體實施方式】中，針對每個靶標分析物，使樣品接觸一組鄰近探針，如此，與樣品接 觸的組的數目會是兩組或多組，例如，三組或多組，四組或多組等。這樣的方法在多重的或 高通量的應用中是特別有用。
[0175] 可以選擇加入到樣品中的鄰近探針的量用以提供反應混合物中足夠低濃度的鄰 近探針，以便確保鄰近探針在沒有結合到靶標分析物時將不會隨機地彼此緊密鄰近，至少 不會達到緊密鄰近到任何大的或實質的程度。因此，目的是，僅當鄰近探針通過鄰近探針的 分析物結合結構域與分析物的結合位點之間的結合相互反應而結合分析物時，鄰近探針彼 此緊密鄰近。
[0176] 然而，已經令人吃驚地發現，加入室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶可以減 少未結合于靶標分析物的鄰近探針之間的相互作用所產生的延伸產物的數目，這可能是暫 時的。在這方面，在聚合酶存在的情況下，在聚合酶無活性或具有最小活性的條件下，鄰近 探針可以相互作用。因此，不需要例如通過加入其它組分，來打破反應混合物的平衡，以提 供聚合酶活性，并且聚合酶可優先與穩定的雙鏈體結合，所述穩定的雙鏈體即結合于靶標 分析物的鄰近探針的核酸結構域之間形成的雙鏈體。因此，在本發明的方法中，有可能使用 之前在基于鄰近的檢測分析中不能使用的鄰近探針的濃度。當鄰近探針的分析物結合結構 域對靶標分析物具有中度或低親和力時，這是特別有利的，并且因此在更高的濃度下需要 如此。
[0177] 已經發現了其它預料之外的優點，其中分析也包括具有3'核酸外切酶活性的組 分，例如也具有3'核酸外切酶活性的在室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶。據認為， 通過降解具有游離且未受保護的3'端的核酸結構域，可以減少未結合于靶標分析物的鄰近 探針的相互作用的數目。在這方面，這樣的相互作用不如結合于靶標分析物的探針之間的 相互作用穩定，因此是暫時的。因此，通過具有3'核酸外切酶活性的組分對所述未結合的 鄰近探針進行降解。因此，在本發明的方法中，有可能使用之前在基于鄰近的檢測分析中不 能使用的鄰近探針的濃度。當鄰近探針的分析物結合結構域對靶標分析物具有中度或低親 和力時，這是特別有利的，并且因此在更高的濃度下需要如此。
[0178] 在本發明方法的【具體實施方式】中，還發現了其它的優點，其中，一個或多個鄰近探 針是展開鄰近探針，包含具有發夾結構的核酸結構域。可以相信的是，展開鄰近探針也可減 少未結合于靶標分析物的鄰近探針之間的相互作用的數目。只在穩定的條件下，例如當兩 個探針都結合于靶標分析物時，展開鄰近探針的核酸結構域可與其它鄰近探針的核酸結構 域相互作用。因此，使用展開鄰近探針也使得有可能使用之前在基于鄰近的檢測分析中不 能使用的鄰近探針的濃度。如上所述，當鄰近探針的分析物結合結構域對靶標分析物具有 中度或低親和力時，這是特別有利的，并且因此在更高的濃度下需要如此。
[0179] 在具有代表性的【具體實施方式】中，在與樣品組合后，反應混合物中的鄰近探針的 濃度范圍是約lfM至1 μ M，諸如約ΙρΜ至約InM，包括約ΙρΜ至約ΙΟΟηΜ。
[0180] 在樣品和鄰近探針組進行組合后，如果分析物存在于樣品中，可以將反應混合物 培養一段時間，該時間足夠使鄰近探針結合靶標分析物。在代表性的【具體實施方式】中，可以 在約4°C至約50°C，優選約4°C至約40°C，包括約20°C至約37°C的溫度下，將產物混合物 (反應混合物或分析混合物）培養約5分鐘至約48小時的一段時間，包括約30分鐘至約 12小時。反應混合物維持的條件應進行優化以促進鄰近探針與分析物的特異性結合，同時 抑制非特異性相互作用。條件應使得在上述的核酸結構域之間能有效的和特異的雜交。
[0181] 在鄰近探針在上述聚合酶存在下進行培養的【具體實施方式】中，在使聚合酶活性最 小化的條件下，將聚合酶加入反應混合物中，和/或，培養反應混合物。因此，在一些具體實 施方式中，在低于40°C的溫度下，優選低于35°C或30°C的溫度下，加入聚合酶，和/或，培養 反應混合物。在特別優選的【具體實施方式】中，在室溫或更低的條件下，即25°C或更低，例如 24、23、21、20°C或更低，培養包含聚合酶的反應混合物。
[0182] 在一些【具體實施方式】中，鄰近探針是凍干的。在本發明的一個方面，所述凍干的鄰 近探針在接觸含分析物的樣品之前是再水化的。在本發明的一個優選的方面，凍干鄰近探 針在加入含靶標分析物的樣品時是在水化的。
[0183] 在特定的【具體實施方式】中，至少在鄰近探針結合于靶標分析物的培養步驟期間， 減小培養混合物的有效體積，假設靶標分析物存在于樣品中。在這些【具體實施方式】中，可出 于多種原因而減小培養混合物的有效體積。在特定的【具體實施方式】中，減小培養混合物的 有效體積以使用中度或低親和力分析物結合結構域和/或提高分析的敏感性。例如，在一 些特定的【具體實施方式】中，當培養混合物的有效體積減小時，分析物結合結構域可以是中 度或低親和力結合劑，借此意味著分析物結合結構域對它們的祀標分析物的親和力小于約 1(Γ 4Μ，諸如約InM Kd。在特定的【具體實施方式】中，可以提高分析的靈敏度，以便分析可以檢 測1 μ 1樣品中少至約100個或更少的靶標分析物，包括1 μ 1樣品中少至約75個或更少的 靶標分析物，包括1 μ 1樣品中少至約50個或更少的靶標分析物。
[0184] 在特定【具體實施方式】中，在上述培養步驟的過程中，在混合物中包括"加濃試劑" 或"體積排阻劑"，例如，用來在鄰近探針與其靶標分析物結合的過程中降低培養混合物的 有效體積。典型地，"加濃試劑"是水溶性的大分子材料。適合的大分子材料廣泛地包括 平均分子量為約1500至幾百萬的生物相容的天然或合成聚合物，所述聚合物不與混合物 中的其它試劑或產物特異性地相互作用。這樣的聚合物在本領域中稱為"體積排阻劑"，因 為其主要功能是占據體外反應介質中的體積并為生化反應提供高度濃縮的環境，例如接近 于體內條件的環境。體積排阻聚合物當然必須足夠可溶以提供所需的濃度。合適的典型 聚合物包括但不限于：市售的聚乙二醇（PEG),例如具有高于約2000的平均分子量的聚乙 二醇聚合物，FIC0LL聚合物如具有約70, 000的平均分子量的那些，牛血漿白蛋白，糖原， 聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖，例如交聯葡聚糖sephadex?，等等。在具有代表性的具體實施 方式中，采用了更高分子量的PEG聚合物，特別是分別具有約1450、3000-3700、6000-7500 和 15, 000-20, 000 的平均分子量的 PEG1450、PEG3350、PEG6000 (也作為 PEG8000 出售）和 PEG20,000。具有代表性的【具體實施方式】中采用了 PEG6000和PEG8000。在具有代表性的具 體實施方式中，培養反應中的體積排阻聚合物的濃度根據聚合物的類型及其分子量落入約 5% w/v至約45% w/v的范圍。一般地，所希望的是，給定類型的更高的分子量的聚合物需 要以比相同類型的分子量較低的聚合物更低的濃度存在，以實現酶活性的相同效果。
[0185] 在優選的【具體實施方式】中，加濃試劑或體積排阻劑是交聯葡聚糖。在特別優選的

【具體實施方式】中，交聯葡聚糖是G-100型。
[0186] 在采用體積排阻劑的那些【具體實施方式】中，在方法的下一步驟之前，可以由于存 在體積排阻劑而根據存在的體積排阻劑的量、稀釋流體的性質等將培養混合物稀釋，例如 稀釋到至少約2倍或更多，如至少約5倍或更多，包括至少約10倍或更多，其中，在具有代 表性的【具體實施方式】中，稀釋流體是水，或者水和一種或多種溶質的其它的合適的水性流 體，所述溶質例如是鹽、緩沖劑等。
[0187] 作為體積排阻劑的替代，或在使用體積排阻劑的同時，可以通過將一部分水從培 養混合物中除去，來減少培養混合物在培養過程中的體積，例如通過蒸發。在這些具體實 施方式中，根據需要，流體的體積可以減少至少約2倍或更多，如至少約5倍或更多，包括 至少10倍或更多。重要的是，在這些【具體實施方式】中，并非所有的水均從培養混合物中除 去。可以采用任何便捷的方法，通過從培養混合物中除去選擇的部分的水，來減小培養混 合物的體積。可以采用通過監測和調節濕度與溫度來控制蒸發的儀器，其中在某些具體實 施方式中，培養混合物的體積被監測，例如通過連續測量培養混合物的體積來進行監測，其 中，當適當地蒸發時，可以加入如上所述聚合酶和PCR混合物。根據需要，可以使用加熱塊 來加快蒸發，優選地，如果反應混合物中存在聚合酶，那么在使聚合酶活性最小化的溫度條 件下，使用加熱塊來加快蒸發。可選地，通過將水過濾掉，可以減小培養混合物的體積。在 具有代表性的【具體實施方式】中，使用體積排阻過濾器來選擇性地容納尺寸大于臨界值的分 子，而較小的分子和水將通過過濾器而被除去。施加于溶液使其通過過濾器的力可以通過 離心或真空抽吸而達到。
[0188] 當鄰近探針的結合結構域與分析物結合時，鄰近探針的核酸結構域互相緊密鄰 近。因此，第一和第二鄰近探針的核酸結構域能夠彼此直接雜交或間接雜交，所述間接雜交 例如是通過夾板間接雜交。
[0189] 當存在時，夾板可以在鄰近探針之如、與鄰近探針冋時或在鄰近探針之后加入樣 品中。在一個【具體實施方式】中，夾板預先雜交至鄰近探針。在另一個【具體實施方式】中，夾板 寡核苷酸形成了鄰近探針的核酸結構域的一部分。在另一個【具體實施方式】中，夾板寡核苷 酸可以以第三鄰近探針的形式偶聯至分析物結合結構域，其中，優選地，將其與第一和第二 鄰近探針同時加入。
[0190] 樣品與鄰近探針組合后，可將樣品稀釋，優選地，通過加入延伸反應的酶組分和/ 或非酶組分，例如緩沖液、鹽、核苷酸等，但是不加入具有3'核酸外切酶活性的組分，來將樣 品稀釋，但是如果具有3'核酸外切酶活性的組分以室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶 的形式存在，那么可將其加入。在優選的【具體實施方式】中，稀釋還可包括用于擴增反應的試 齊U，例如緩沖液、鹽、核苷酸、引物和聚合酶。稀釋步驟的作用是降低未結合鄰近探針之間相 互作用的可能性和/或它們與樣品中其它組分相互作用的可能性。
[0191] 稀釋還可以破壞結合的探針的核酸結構域之間的相互作用。然而，由于結合的探 針緊密鄰近，因此在合適的條件下將使被破壞的任何相互作用穩定化（即重新退火或重新 雜交）。因此，在一個【具體實施方式】中，樣品可以被培養更長的一段時間，該時間足以使結合 的鄰近探針之間的相互作用穩定化。在具有代表性的【具體實施方式】中，在約4°C至約50°C， 優選約4°C至約40°C，包括約20°C至約37°C的溫度下，可將產物混合物培養約1分鐘至約 48小時的一段時間，包括約5分鐘至約12小時。應當對反應混合物培養的條件進行優化， 以維持鄰近探針與分析物的特異性結合，同時抑制非特異性相互作用。條件也應使得在上 述的核酸結構域之間發生有效的和特異性的雜交。
[0192] 在上述聚合酶存在的情況下鄰近探針被重新培養的【具體實施方式】中，可在使聚合 酶活性最小化的條件下對反應混合物進行培養。因此，在一些【具體實施方式】中，可在低于 40°C的溫度下，優選低于35°C或30°C的溫度下培養反應混合物。在特別優選的具體實施方 式中，可在室溫或更低的溫度下，即25°C或更低，例如24°C、23°C、21°C、20°C或更低，重現 培養含有聚合酶的反應混合物。
[0193] 在一些【具體實施方式】中，在已經對鄰近探針進行培養以與靶標分析物相互作用之 后，或者在已經對鄰近探針進行重現培養以使結合于靶標分析物的鄰近探針的核酸結構域 之間的相互作用穩定之后，將室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶加入到反應混合物 中。優選地，在使聚合酶活性最小化的條件下，將聚合酶加入到反應混合物中。因此，在一些

【具體實施方式】中，在低于40°C的溫度下，優選低于35°C或30°C的溫度下，加入聚合酶。在一 些特別優選的【具體實施方式】中，在室溫或更低的溫度下，即25°C或更低，例如24°C、23°C、 21 °C、20°C或更低，可將聚合酶加入反應混合物中。例如，可在15°C、10°C或5°C或更低的溫 度下，加入聚合酶。
[0194] 在一些【具體實施方式】中，將聚合酶與其它組分一起加入反應混合物中，所述其它 組分例如是用于本文別處所述方法的延伸、擴增和/或檢測步驟的組分。
[0195] 在一些【具體實施方式】中，在聚合酶活性最小的條件下將聚合酶和/或其它組分加 入之后，可使反應混合物均衡，所述條件例如是聚合酶加入到樣品中的條件。這可以起到穩 定結合于靶標分析物的鄰近探針核酸結構域之間的相互作用的作用。因此，在約4°C至約 30°C，優選約4°C至約25°C，包括約20°C至約25°C的溫度下，可使反應混合物均衡約1分鐘 至約1小時的一段時間，包括約5分鐘至約30分鐘。
[0196] 一些方法包括具有3'核酸外切酶活性的組分并且在培養探針與樣品的步驟之后 將擴增試劑加入樣品中，在這樣的方法的【具體實施方式】中，優選的是，例如如上所述通過引 物的3'端進行修飾，來保護引物的3'核酸外切酶活性。在進一步優選的【具體實施方式】中， 可選地或另外地，引物可以是熱起始PCR引物，例如，莖環引物。在一個優選的具體實施方 式中，使用同一聚合酶來延伸鄰近探針的核酸結構域并擴增延伸產物。在另一優選的具體 實施方式中，緩沖液和/或鹽活化加入樣品中的所有酶。
[0197] 在一些【具體實施方式】中，在延伸步驟完成之后，將等分的反應混合物轉移到新的 容器中以擴增和檢測。單獨的反應容器可包含另一聚合酶（和反應組分），諸如，如下進一 步限定的嗜熱聚合酶。
[0198] 一些方法包含與室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶分開的且具有3'核酸外 切酶活性的組分，在該方法的【具體實施方式】中，在任何稀釋步驟之后，具有3'核酸外切酶活 性的組分與樣品接觸。該步驟可包括進一步稀釋樣品，例如，加入具有合適緩沖液的組分和 /或其它鹽/組分。如上所述，具有3'核酸外切酶活性的組分可以在延伸反應所需的聚合 酶之前加入，或與之同時加入。在優選的【具體實施方式】中，用于本發明方法的聚合酶還具 有3'核酸外切酶活性。可在合適的條件下進一步培養樣品，以使3'核酸外切酶活性作用 在未結合鄰近探針的核酸結構域。如果樣品中存在聚合酶，那么所述條件還應當有利于核 酸結構域的延伸。在一些【具體實施方式】中，可在具有3'核酸外切酶活性的組分之后加入聚 合酶，其中可以進一步培養樣品以產生延伸產物。培養條件將取決于反應所用的組分，且一 些典型的條件如上所述。然而，在一些【具體實施方式】中，用于延伸核酸結構域的聚合酶是如 上定義的超嗜熱聚合酶，例如，修飾的Taq聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶，在該 方法的核酸外切酶和/或延伸階段可優選其它反應條件，特別是溫度條件。例如，用于延伸 反應的、且如果聚合酶還具有3'核酸外切酶活性則也用于核酸外切酶反應的溫度的范圍是 約25°C至約80°C，包括約25°C至約75°C，約30°C至約65°C，或約40°C至約60°C，最優選約 45°C 至約 55°C。
[0199] 產生延伸產物之后，具有3'核酸外切酶活性的組分會滅活。在優選的具體實施方 式中，通過熱變性，例如65-80°C 10分鐘，而使3'核酸外切酶活性喪失，雖然明顯的是所需 的條件會根據組分的性質而不同，例如，通過上述條件不會使包括3'核酸外切酶的超嗜熱 聚合酶失去活性。在一些【具體實施方式】中，熱失活可能是擴增反應的第一步。
[0200] 在鄰近探針與樣品接觸的步驟之后，或者在分析的延伸步驟之前，如果不將擴增 反應物加入到樣品，那么所述反應物將在該階段與樣品接觸。在優選的【具體實施方式】中，將 等分的樣品轉移到包含擴增組分的新容器中，以擴增和檢測。在該方面，具有3'核酸外切 酶活性的組分滅活之后，引物不需要抗3'核酸外切酶活性。即使具有3'核酸外切酶活性 的組分不滅活，只要包含延伸產物的等份只含有最低3'核酸外切酶活性，那么也允許使用 不抗3'核酸外切酶活性的引物。
[0201] 在一些【具體實施方式】中，能夠延伸鄰近探針的核酸結構域的聚合酶也可用于擴增 反應，例如，如果聚合酶是上述超嗜熱聚合酶，例如Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、修飾 的Taq聚合酶等。
[0202] 如果在鄰近探針與樣品接觸的步驟之后將擴增試劑加入到樣品中，那么有可能直 接進行擴增反應。在優選的【具體實施方式】中，將等分的反應混合物轉移到新容器以擴增和 檢測。
[0203] 通常，可以采用能夠檢測鄰近相互作用存在的任何便捷的方法。檢測方法可以是 或可以不需要分離步驟。
[0204] 在一個具有代表性的【具體實施方式】中（本發明方法的其它具有代表性的具體實 施方式如上所述），通過第一和第二鄰近探針的核酸結構域的游離3'羥基的核酸延伸可以 得到第一和第二鄰近探針的相互作用產生的延伸產物，并且通過隨后的延伸產物的擴增和 檢測可以檢測該相互作用。在該具有代表性的【具體實施方式】中，通過在聚合酶有活性的條 件下使反應混合物與聚合酶接觸來實現第一和第二鄰近探針的核酸結構域的延伸。因此， 如上所述，在聚合酶無活性或具有最小活性的條件下，聚合酶可以在鄰近探針之前、與鄰近 探針同時、或在鄰近探針之后與樣品接觸。在適合鄰近探針與靶標分析物相互作用且適合 鄰近探針的核酸結構域相互作用的條件下培養反應混合物之后，含有聚合酶的反應混合物 可經受并保持在如下條件下：該條件足以使核酸結構域延伸，即反應混合物的溫度提高到 聚合酶具有上述最小活性的溫度下，例如約25°C至約80°C，包括約25°C至約75°C，約30°C 至約65°C，或約40°C至60°C，最優選約45°C至約55°C。
[0205] 如本領域已知的，聚合酶催化在并列的核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，其中包括3' 羥基部分（3'端）的核苷酸可以形成已有的核苷酸聚合物的一部分，已有的核苷酸聚合物 即核酸。通常地，使核酸退火或雜交于互補的核酸分子，所述核酸分子的作用是模板化（即 模板核酸）具有游離3'端的核酸的延伸。隨后，與模板核酸上的下一個核苷酸互補的具有 游離5'磷酸酯部分的游離核苷酸連接于具有游離3'端的核酸以使其延伸，并重復該過程， 例如，直至到達模板的末端。可以采用如上定義的任何便利的聚合酶。用于本發明方法的特 別優選的聚合酶包括Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶以及它們的突變體和/或衍生物， 例如其序列-修飾的衍生物，如上定義。突變體和衍生物可以包括具有或不具有3'核酸外 切酶活性的聚合酶，并且，修飾具有3'核酸外切酶活性的聚合酶以去除、滅活或抑制多肽的 3'核酸外切酶部分在本領域是常規的。某些RNA聚合酶也可用于本發明的方法中。
[0206] 當通過無 3'核酸外切酶活性的聚合酶，例如Pfu (外切_) DNA聚合酶、Pwo (外切_) DNA聚合酶等，來實施延伸步驟時，包含3'核酸外切酶的組分，例如核酸外切酶，可在聚合 酶之前或與之同時被加入。可采用任何方便的3'核酸外切酶，例如核酸外切酶I。本發明 的方法還可采用某些RNA核酸外切酶。
[0207] 在該延伸步驟中，如上定義的合適的聚合酶，如果需要的話和另外的3'核酸外切 酶，和需要的和/或希望的任何試劑與反應混合物組合并維持在足以使雜交的核酸結構域 發生延伸的條件。如果具有3'核酸外切酶活性的組分存在與反應混合物中，那么所述條件 還應該足以使未結合的鄰近探針的核酸結構域發生降解。聚合酶和核酸外切酶反應條件對 本領域技術人員而言是已知的且如上所述。在延伸和/或降解過程中，某些【具體實施方式】 中的反應混合物可保持在約4°C至約80°C，諸如約20°C至約75°C，約30°C至約60°C，例如 約45°C至約55°C或者約20°C至約37°C的溫度下（取決于分析中所用的聚合酶和/或核酸 外切酶的最適條件）約5秒至約16小時，諸如約1分鐘至約1小時的一段時間。在其它

【具體實施方式】中，反應混合物可保持在如下的溫度保持一段時間，其中，所述溫度是約35°C 至約451：的范圍，諸如約371：至約421：，例如約381：、391：、401：或411：，或者約401：至 約 80°C 范圍，諸如 45°C至約 75°C，例如約 46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、5rC、52°C、53°C、 54 °C、55 °C、56 °C、57 °C、58 °C、59 °C、60 °C、61 °C、62 °C、63 °C、64 °C、65 °C、66 °C、67 °C、68 °C、 69°C、70°C、71 °C、72°C、73°C、74°C或75°C，所述一段時間是約5秒至約16小時，諸如約1分 鐘至約1小時，包括約2分鐘至約8小時。反應組分和條件的代表性【具體實施方式】在實施 例中進行了描述。
[0208] 延伸之后，將延伸產物（例如，第一和第二探針的延伸的核酸結構域）作為指示樣 品中的分析物的存在或作為度量樣品中分析物的量和其任意的位置來擴增和檢測。如上所 述，延伸的產物可以包括單鏈或雙鏈核酸分子。單鏈核酸分子可以由夾板寡核苷酸的延伸 而產生，所述夾板寡核苷酸可以從第一和第二鄰近探針的核酸或在分析物結合結構域中的 每個末端封端的第一和第二探針的兩個鄰近核酸結構域的綴合產物上解離。
[0209] 延伸步驟之后，方法的下一步是確定反應混合物中延伸產物的存在，以便檢測樣 品中的靶標分析物。換言之，篩選（即，分析、評估、評價、測試等）反應混合物中任何生成 的延伸產物的存在，以便檢測被分析樣品中靶標分析物的存在。根據本發明，檢測步驟涉及 擴增步驟以生成被檢測的擴增產物，通常擴增延伸產物的全部或一部分。
[0210] 有上述方法產生的延伸產物，或更具體地擴增產物，在最廣泛的意義上使用任何 便捷的方法進行檢測。具體的檢測方法可以根據所要求的靈敏度和實施方法的應用而變 化。在本文所述的本發明的方法中，檢測方法可以包括擴增組分，其中延伸產物核酸（或其 部分）的拷貝數升高，例如，以提高具體分析的靈敏度。然而，可能的是，在其它方法中可以 無需任何擴增而直接檢測延伸產物。
[0211] 雖然這不是本發明方法的優選【具體實施方式】，其中無需擴增的檢測是可實施的， 可以以許多不同的方式檢測核酸延伸產物。例如，一種或多種延伸產物可以是直接標記的， 例如通過熒光，或通過分光光度法標記，或通過放射性同位素標記或使用任何產生信號的 標記，以直接標記延伸產物。在這些【具體實施方式】中，直接標記的延伸產物可以從剩余反應 混合物中按大小分離，包括以未延伸的寡核苷酸（即，核酸結構域寡核苷酸或夾板寡核苷 酸）中分離，以檢測延伸的核酸。可選地，可以采用構象選擇的探針，例如分子信標（如以 下更詳細地描述）來檢測延伸產物的存在，其中這些探針針對僅存在于延伸的核酸產物中 的序列。
[0212] 如上所述，在本發明方法的優選【具體實施方式】中，檢測步驟包括擴增步驟，其中增 加延伸核酸或其部分的拷貝數，例如，以提高分析的靈敏度。根據需要，擴增可以是線性的 或指數的，其中令人感興趣的代表性擴增方案包括但不限于：聚合酶鏈式反應（PCR);等溫 擴增，滾環擴增等。在本發明一個特別優選的【具體實施方式】中，擴增方法是定量PCR(qPCR) 或實時PCR。
[0213] 例如美國專利US6, 558, 928所描述的鎖式探針，或實際上使用任意環狀核酸分子 作為模板的滾環擴增，也可以用于擴增現有的"信號"核酸分子或其部分，例如，由鄰近延伸 分析生成的延伸產物。因此，在方法優選的方面，延伸產物（或其部分）可以通過滾環擴增 來擴增。在一個【具體實施方式】中，使用鎖式探針進行RCA。在另一個【具體實施方式】中，使用 環狀模板（環狀寡核苷酸）進行RCA。
[0214] 當檢測步驟包括擴增步驟（更具體地，體外擴增延伸產物或其部分的步驟），可以 檢測擴增的產物（或擴增產物）以檢測分析物。
[0215] 聚合酶鏈式反應（PCR)在本領域是已知的，在美國專利第4, 683, 202號、地 4, 683, 195號；第4, 800, 159號；第4, 965, 188號和第5, 512, 462號中進行了描述，這些專 利通過引用整體并入本文。在代表性的PCR擴增反應中，將包括以上延伸的核酸或延伸產 物（也可是為擴增反應中的模板核酸）的反應混合物與在引物延伸反應中采用的一種或多 種引物組合，所述引物例如PCR引物（如在幾何（或指數）擴增中采用的正向和反向引物， 或在線性擴增中采用的單一引物）。與模板核酸（以下為方便起見稱為模板DNA)接觸的寡 核苷酸引物具有足夠的長度以提供在退化條件下的與互補模板DNA的雜交（以下更詳細地 描述）。引物通常為至少l〇bp的長度，通常為至少15bp的長度，更通常為至少16bp的長 度，可以是長達30bp的長度或更長，其中引物的長度一般地為18至50bp的長度，通常為約 20至35bp。根據是否需要引物延伸、模板DNA的線性或指數擴增，可以將模板DNA與單一 引物或一組兩個的引物（正向引物和反向引物）接觸。
[0216] 如上所討論的，可以在加入聚合酶之前將引物加入到樣品中，也可以與聚合酶同 時或在加入聚合酶之后將引物加入到樣品中。在包含具有3'核酸外切酶活性的方法的具 體實施方式中，除非在3'核酸外切酶組分已經滅活之后加入引物，否則可以對所述引物進 行修飾以抗3'核酸外切酶活性，例如，修飾3'端。此外，引物也可以是熱起始引物，如上所 述。
[0217] 除了上述組分，本發明方法中產生的反應混合物通常包括聚合酶和脫氧核苷三磷 酸（dNTP)。可以由一種或多種不同的聚合酶來提供所需的聚合酶活性。在優選的具體實施 方式中，用于本發明方法的延伸步驟的聚合酶也用于擴增步驟。
[0218] 然而，在一些【具體實施方式】中，含有延伸產物的等分反應混合物可以被轉移到單 獨的反應容器中進行擴增和檢測步驟。單獨的反應容器可以含有擴增反應混合物，其包 括至少一種家族A聚合酶，其中，令人感興趣的代表性家族A聚合酶包括但不限于：水生 棲熱菌（Thermus aquaticus)聚合酶，包括天然存在的聚合酶（Taq)及其衍生物和其同 源物，諸如克萊因 taq(如Barnes等人，美國科學院院刊（1994)91:2216-2220 (Barnes et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1994)91:2216-2220)中描述的）或 iTaq(美國伯樂 公司）（BioRad);嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus)聚合酶，包括天然存在的聚合酶 (Tth)及其衍生物和其同源物，以及諸如此類。在進行的擴增反應是高保真反應的某些具 體實施方式中，反應混合物可進一步包括具有3' -5'核酸外切酶活性的聚合酶，例如可由 家族B聚合酶提供，其中令人感興趣的家族B聚合酶包括但不限于：如Perler等人，美 國科學院院刊（1992)89:5577-5581所描述的嗜熱高溫球菌（Thermococcus litoralis) DNA 聚合酶（Vent);火球菌（Pyrococcus)種 GB-D (深 Vent);如 Lundberg 等人，基因 (1991) 108:1-6 (Lundberg et al·，Gene (1991) 108:1-6)所描述的強烈火球菌（Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶（Pfu)，沃氏火球菌（Pyrococcus woesei) (Pwo)，以及諸如此類。當反 應混合物包括家族A和家族B聚合酶時，家族A聚合酶可以以大于家族B聚合酶的量存在 于反應混合物中，其中活性的差異通常是至少10倍，且更通常是至少約100倍。
[0219] 通常，擴增步驟的反應混合物將包括4種不同類型的dNTP，這對應于4種天然存在 堿基，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本發明的方法中，每種dNTP通常以約10至5000μΜ， 通常約20至1000 μ Μ的量存在。
[0220] 本發明方法的該檢測步驟中制備的反應混合物可以進一步包括水性緩沖液介質， 所述水性緩沖液介質包括單價離子源，二價陽離子源和緩沖劑。可以采用單價離子的任何 便利來源，諸如KC1、Κ-醋酸、ΝΗ 4-醋酸、Κ-谷氨酸、NH4C1、硫酸銨，等等。二價陽離子可以 是鎂、錳、鋅等，其中陽離子可以通常是鎂。可以采用任何鎂離子的便利來源，包括MgCl 2、 Mg-醋酸，等等。存在于緩沖液中的Mg2+的量可以是0. 5至10mM，但優選是3至6mM，且理想 地是約5mM。可能存在于緩沖液中的代表性的緩沖劑或鹽包括三羥甲基氨基甲烷（Tris)、 三甲基甘氨酸（Tricine)、HEPES、M0PS，等等，其中緩沖劑量的范圍通常為約5至150mM，通 常為約10至100mM，且更通常為約20至50mM，其中在某些優選的【具體實施方式】中，緩沖劑 將以足夠的量存在以提供約6. 0至9. 5的pH值，其中最優選的是在約72°C下約7. 3的pH 值。其它可能存在于緩沖介質中的試劑包括螯合劑，諸如EDTA、EGTA等。
[0221] 在本發明方法制備該步驟的反應混合物時，各種組成組分可以按照任何方便的順 序合并。例如，緩沖液可以與引物、聚合酶結合、然后與模板DNA結合，或所有各種組成組分 可以同時結合以產生反應混合物。在特別優選的【具體實施方式】中，將擴增反應物與用于延 伸和降解反應的組分結合。在這方面，反應的組分優選適合反應的所有酶組分的活性，即， 適合于產生延伸產物的"第一"聚合酶和可選地適合于擴增步驟的"第二"聚合酶，和如果具 有3'核酸外切酶活性的組分，其中"第二"聚合酶可不同于"第一"聚合酶（例如，如果擴增 反應發生在單獨的反應容器中）。在優選的【具體實施方式】中，"第一"和"第二"聚合酶是相 同的，即聚合酶能夠延伸鄰近探針的核酸結構域并擴增延伸的結構域的至少一部分。在其 它【具體實施方式】中，聚合酶可具有3'核酸外切酶活性。例如，Pfu DNA聚合酶可用于采用 PCR檢測延伸反應產物的【具體實施方式】中，即Pfu DNA聚合酶能夠被用作延伸組分、擴增組 分和3'核酸外切酶組分，如果存在。
[0222] 擴增反應的擴增產物可以使用任何便利的方法檢測，其中采用的具體方法可以非 特異性地或特異性地檢測擴增產物，如以下更詳細地描述的。令人感興趣的代表性非特異 性檢測方法包括采用信號生成系統的方法，所述信號生成系統例如通過嵌入選擇性地檢測 雙鏈DNA產物。用于這樣的【具體實施方式】中的代表性可檢測分子包括熒光核酸染色劑，諸 如菲陡（phenanthridinium)類的染料，包括其單體或同二聚體或異二聚體，當其與核酸復 合時會產生增強的熒光。菲啶染料的例子包括乙啡啶同二聚體、溴化乙啡錠、碘化丙錠和其 它烷基取代的菲啶染料。在本發明的另一個【具體實施方式】中，核酸染色劑是吖啶染料或包 括吖啶染料，或其同二聚體或異二聚體，諸如吖啶橙、吖啶同二聚體、乙啡錠-吖啶異二聚 體，或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本發明的另一個【具體實施方式】中，核酸染色劑是 吲哚或咪唑染料，諸如赫克斯特33258 (Hoechst33258)、赫克斯特33342 (Hoechst33342)、 赫克斯特34580(Hoechst34580)(生物探針34,分子探針公司，尤金，俄勒R州，（2000年5 月））（BI0PR0BES 34, Molecular Probes, Inc. Eugene, Oreg.，（May2000))、DAPI (4,，6-二脈 基-2-苯基吲哚）或DIPI (4'，6-(二咪唑啉-2-基）-2-苯基吲哚）。其它允許的核酸染 色劑包括但不限于7-氨基放線菌素 D、羥基司替巴脒、LDS751、選擇的補骨脂素（呋喃香豆 素）、苯乙烯基染料、金屬復合物如釕復合物，和過渡金屬復合物（例如，包括Tb3+和Eu3+)。 在本發明某些【具體實施方式】中，核酸染色劑是花青染料或花青染料的同二聚體或異二聚 體，當其與核酸連接時會產生增強的熒光。可以使用如下專利文獻中所描述的任何染料： Lee的美國專利第4, 883, 867號（1989)、Yue等人的美國專利第5, 582, 977號（1996)、Yue 等人的美國專利第5, 321，130號（1994)和Yue等人的美國專利第5, 410, 030號（1995)(這 四篇專利通過引用整體并入本文），包括購自分子探針公司，尤金，俄勒R州（Molecular Probes, Inc.，Eugene, Oreg)的商標為 TOTO、BOBO、POPO、YOYO、TO-PRO、BO-PRO、P0-PR0 和 YO-PRO的市售核酸染色劑。可以使用如下專利文獻中所描述的任何染料：Haugland等人的 美國專利第5, 436, 134號（1995)、Yue等人的美國專利第5, 658, 751號（1997)和Haugland 等人的美國專利第5, 863, 753號（1999)(這三篇專利通過引用整體并入本文），包括購自 分子探針公司，尤金，俄勒網州（Molecular Probes, Inc.，Eugene, Oreg)的商標為SYBR Green、SYTO、SYTOX、PICOGREEN、OLIGREEN和RIBOGREEN的市售核酸染色劑。在本發明其它

【具體實施方式】中，核酸染色劑是是單體的、同二聚體的或異二聚體的花青染料，它們包括氮 雜苯并唑雜環或聚氮雜苯并唑雜環，諸如氮雜苯并惡唑、氮雜苯并咪唑或氮雜苯并噻唑，當 與核酸結合時它們會產生增強的熒光，包括購自分子探針公司，尤金，俄勒R州（Molecular Probes, Inc.，Eugene, Oreg)的商標為 SYTO、SYTOX、JOJO、JO-PRO、LOLO、L0-PR0 的市售核 酸染色劑。可用于本發明方法的其它嵌入染料是購自Biotium公司的EvaGreen?染料。
[0223] 在本發明特別優選的【具體實施方式】中，延伸產物通過PCR擴增，其中PCR是定量 PCR，且使用嵌入染料對擴增的核酸分子進行定量。在優選的【具體實施方式】中，嵌入染料選 自 SYBR Green? 和 EvaGreen?。
[0224] 在特別優選的【具體實施方式】中，當樣品是血漿或血清時，定量PCR被用于本發明 方法的擴增和檢測步驟。用于血漿或血清的特別有用的嵌入染料可選自SYBR Green?和 EvaGreen?。
[0225] 在其它【具體實施方式】中，可以采用對擴增產物而非一般的雙鏈分子具有特異性的 信號產生系統來檢測擴增。在這些【具體實施方式】中，信號產生系統可以包括探針核酸，該探 針核酸特異性結合于擴增產物中發現的序列，其中，所述探針核酸可以用直接或間接可檢 測的標記物進行標記。直接可檢測的標記物是可以直接被檢測而無需使用另外的試劑的 標記物，而間接可檢測的標記物是通過采用一種或多種另外的試劑才可檢測的標記物，例 如，其中標記物是由兩種或多種組分構成的信號產生系統的成員。在很多【具體實施方式】中， 標記是直接可檢測的標記，其中令人感興趣的直接可檢測的標記包括但不限于：熒光標記、 放射性同位素標記、化學發光標記等。在很多【具體實施方式】中，標記物是熒光標記，其中在 這樣的【具體實施方式】中采用的標記試劑是熒光標記的核苷酸，例如熒光標記的CTP (諸如 Cy3-CTP、Cy5-CTP)等。可以用于標記核酸以產生標記的探針核酸的熒光部分包括但不限 于：熒光素，花青染料如Cy3、Cy5、Alexa555、Bodipy630/650,等。其它標記，如上所述的那 些，是本領域已知的，因此也可被采用。
[0226] 在某些【具體實施方式】中，特異性標記的探針核酸是使用"能量轉移"標記進行標記 的。如本文所用，"能量轉移"是指熒光基團的熒光發射被熒光修飾基團轉變的過程。如果 熒光修飾基團是淬滅基團，那么來自熒光基團的熒光發射減弱（淬滅）。能量轉移可以通過 熒光共振能量轉移，或通過直接能量轉移而發生。在這兩種情況下確切的能量轉移機制是 不同的。應當理解的是，在本申請中所提到的任何能量轉移包括所有這些在機制上不同的 現象。如本文所用，"能量轉移對"是指參與能量轉移的任意兩個分子。通常地，一個分子充 當熒光基團，另一個充當熒光修飾基團。"能量轉移對"用來指形成單一復合物的分子的基 團，在所述復合物中發生能量轉移。這樣的復合物可以包括，例如，彼此不同的兩個熒光基 團和一個淬滅基團，兩個淬滅基團和一個熒光基團，或包括多個熒光基團和多個淬滅基團。 在有多個熒光基團和/或多個淬滅基團的情況下，單個基團可以彼此不同。如本文所用，"熒 光共振能量轉移"或"FRET"是指能量轉移現象，其中由激發熒光基團發射的光至少部分地 被熒光修飾基團吸收。如果熒光修飾基團是淬滅基團，那么基團可以作為不同波長的光發 出吸收光，或可以作為熱散失。FRET取決于熒光基團的發射光譜和淬滅基團的吸收光譜之 間的重疊。FRET還取決于淬滅基團和熒光基團之間的距離。超過一定的臨界距離后，淬滅 基團不能吸收由熒光基團發射的光，或僅能很差地吸收。如本文所用，"直接能量轉移"是指 熒光轉移機制，其中熒光基團和熒光修飾基團之間的光子未發生傳遞。不被單一的機理束 縛，可以認為在直接能量轉移中，熒光基團和熒光修飾基團干擾彼此的電子結構。如果熒光 修飾基團是淬滅基團，這將導致淬滅基團甚至阻止熒光基團發射光。
[0227] 能量轉移標記探針核酸，例如，寡核苷酸，可以按照各種不同的方式構成，只要它 包括供體、受體和靶標核酸結合結構域。因此，在本方法的這些【具體實施方式】中采用的能量 轉移標記寡核苷酸是核酸檢測器，所述核酸檢測器包括熒光團結構域，其中放置了熒光能 量供體，即供體，并放置了熒光能量受體，即受體。如上所述，供體結構域包括供體熒光團。 供體熒光團可以位于核酸檢測器的任意部位，但是通常存在于檢測器的5'端。受體結構域 包括熒光能量受體。受體可以放置在核酸檢測器受體結構域的任意部位，但通常存在于核 酸檢測器或探針的3'端。
[0228] 除了熒光團和受體結構域，能量轉移標記的探針寡核苷酸還包括靶標核酸結合結 構域，所述結構域結合于令人感興趣的擴增產物中所發現的靶標核酸序列（如上所述），所 述的結合例如是在嚴格的雜交條件下結合（如上所述）。這樣的靶標結合結構域的長度通 常是約10至約60個核苷酸，通常為約15至約30nt。根據寡核苷酸和分析本身的性質，靶 標結合結構域可以雜交于模板核酸的區域或引物延伸產物的區域。例如，當分析是5'核酸 酶分析時，例如當采用TaqMan?型寡核苷酸探針時，靶標結合結構域在嚴格的條件下雜 交于模板核酸的靶標結合位點，所述結合位點是引物結合位點的下游或3'端。在可選的

【具體實施方式】中，例如，在分子信標型分析中，靶標結合結構域雜交到引物延伸產物的結構 域。在這些【具體實施方式】中采用的包括上述所有三個結構域的能量轉移標記寡核苷酸的總 長度，通常是約10至約60個核苷酸，通常是約15至約30個核苷酸。
[0229] 在某些【具體實施方式】中，當能量轉移標記寡核苷酸不雜交于靶標核酸時，對能量 轉移標記的寡核苷酸進行構造以使熒光團激發后在熒光團和能量轉移標記的寡核苷酸探 針的受體之間發生能量轉移。
[0230] 在某些【具體實施方式】中，寡核苷酸是不形成分子內結構的單鏈分子，并且由于供 體和受體的間距使得能按照單鏈線性形式進行能量轉移，因此其中發生能量轉移。在這 些【具體實施方式】中，當標記的寡核苷酸探針雜交于靶標核酸時，能量轉移也在熒光團和標 記的寡核苷酸探針的受體之間在熒光團激發時發生。這樣的標記寡核苷酸探針的具體 例子包括TaqMan?型探針，如美國專利第6, 248, 526號所描述，其公開的內容通過引 用整體并入本文（以及Held等人，基因組研究（1996)6:986-994(Held et al.，Genome Res. (1996)6:986-994) ;Holland 等人，美國科學院院刊（1991)88:7276-7280(Holland et al.，Proc. Natl Acad. Sci. USA (1991) 88:7276-7280);和 Lee 等人，核酸研究 (1993) 21:3761-3766 (Lee et al.，Nuc. Acids Res. (1993) 21:3761-3766))。在許多這些具 體實施方式中，靶標核酸結合結構域是與模板核酸的序列雜交的結構域，也即與其互補的 結構域，即靶標核酸結合結構域的靶標核酸是存在于模板核酸中的序列（即，偽靶標或替 代核酸）。
[0231] 在其它【具體實施方式】中，當能量轉移標記寡核苷酸探針雜交于靶標核酸時，對探 針寡核苷酸進行構造以使在熒光團激發時在熒光團和能量轉移標記的寡核苷酸探針的受 體之間不發生能量轉移。這些類型的探針結構的例子包括：蝎形探針（Scorpion probe) (描述于 Whitcombe 等人，自然生物技術（1999) 17:804-807(Whitcombe et al.，Nature Biotechnology(1999) 17:804-807);美國專利第6,326, 145號，其公開的內容通過引 用整體并入本文），日出探針（Sunrise probe)(描述于Nazarenko等人，核酸研究 (1997)25:2516-2521 (Nazarenko et al.，Nuc.Acids Res. (1997)25:2516-2521);美國專 利第6, 117, 635號，其公開的內容通過引用整體并入本文），分子信標（Tyagi等人，自然生 物技術（1996) 14:303-308 (Tyagi et al·，Nature Biotechnology (1996) 14:303-308);美 國專利第5, 989, 823號，其公開的內容通過引用整體并入本文），和構象輔助探針（描述于 臨時申請第60/138, 376號，其公開的內容通過引用整體并入本文）。在許多的這些具體實 施方式中，靶標結合序列或結構域包括與擴增反應的引物延伸產物的序列互補的雜交結構 域，而不是與偽靶標核酸中發現的序列互補的序列。
[0232] 本發明方法的下一步是由令人感興趣的標記的擴增產物進行的信號檢測，其中信 號檢測可以根據所采用的具體的信號產生系統而變化。在某些【具體實施方式】中，僅例如熒 光的可檢測信號的存在與否在所述分析中被測定和使用，以便通過確定偽靶標核酸和/或 其擴增產物來測定或識別靶標核酸是否存在。根據所采用的具體標記，信號的檢測可以指 示靶標核酸的存在或不存在。
[0233] 在信號產生系統是熒光信號產生系統的那些【具體實施方式】中，信號檢測通常包括 檢測來自反應混合物的熒光信號的變化以獲得分析結果。換言之，評估了由反應混合物生 成的熒光信號的任何調節。根據采用的標記的性質，變化可以是熒光的增強或減弱，但在某 些【具體實施方式】中是熒光的增強。可以使用任何便捷的方法針對熒光的增強對樣品進行分 析，所述方法的裝置例如是合適的熒光計，諸如熱穩定的比色皿或板式閱讀熒光計。使用已 知的熒光計對熒光進行合適地監測。來自這些裝置的信號，例如光電倍增管電壓形式的信 號，被發送到數據處理器板并轉化成與每種樣品管相關的光譜。可以同時評估多個管，例如 96個管。
[0234] 當檢測方法是實時方法時，例如，如在實時PCR或定量PCR方法中所采用的，在整 個反應中可以在頻繁的間隔下以這種方式收集數據，例如每3分鐘一次。通過監測在每個 循環的過程中來自樣品的反應性分子的熒光，可以按照各種方式來監測擴增反應的進展。 例如，可以通過計算解鏈峰下面積和根據循環數繪制的這些數據來分析由解鏈峰提供的數 據。在本發明的優選【具體實施方式】中，使用嵌入雙鏈核酸分子的染料來實現熒光信號，優選 地，其中嵌入染料選自SYBR Green?和EvaGreen?。
[0235] 以這種方式生成的光譜能夠被分辨，例如，使用預先選擇的熒光部分如染料的"擬 合"，以形成代表每個信號部分（即熒光團）的峰。可以測定峰下的面積，所述峰下的面積 代表每個信號的強度值，如果需要則將其表達為彼此的商數quotients。信號強度和/或比 率的微分將使得能夠在整個反應中或在不同反應條件下記錄標記探針變化，所述反應條件 例如是溫度。這種變化涉及寡核苷酸探針和靶標序列之間的結合現象或者結合于靶標序列 的寡核苷酸探針的降解。微分峰下的面積的積分將使得能夠計算出標記影響的強度值。
[0236] 根據在引物延伸反應末，例如在擴增反應的每個循環后（例如，如在實時PCR監測 中所做的），樣品是否被篩選了一次或多次，針對熒光變化對混合物進行的篩選提供了一個 或多個分析結果。
[0237] 如上所述生成的數據可以按照多種方式進行解釋。在其最簡單的形式中，在擴增 反應的過程中或末期，來自樣品的熒光的增強或減弱指示著樣品中存在的靶標分析物的量 增加，例如，如與反應混合物檢測中所檢測的擴增產物的量相關，表明擴增反應已進行并且 因此靶標分析物確實存在于初始樣品中的事實。通過在整個擴增過程中監測擴增反應也可 能進行定量。如上所述的定量也可以包括分析反應混合物中的一種或多種核酸對照。
[0238] 以這種方式，可以容易地針對靶標分析物的存在來篩選（或者評估或者分析等） 反應混合物。該方法適合用于檢測單一靶標分析物以及多重分析，其中在樣品中分析兩種 或多種不同的靶標分析物。在這些后者的多重分析的情況下，可以采用的不同組的探針數 目通常是約2至約20或更多，例如高達100或更多，1000或更多，等等。
[0239] 采用本文描述的方法而獲得的提高了的特異性和靈敏性使如下分析成為可能：許 多分析物同時并且使用幾種不同的鄰近探針組（多重）在單一反應中進行的分析。可以對 每個探針組進行設計以產生獨特的延伸產物，所述延伸產物可以用于確定探針組所探測的 分析物的存在或不存在，量和/或部位。可以直接檢測延伸產物，或者優選地在擴增后使用 任意已經建立的用于分析核酸分子的方法來檢測延伸產物，所述方法從文獻中是已知的， 包括液相色譜法、電泳法、質譜法、顯微鏡法、實時PCR(定量PCR)、熒光探針等。本發明方法 優選的【具體實施方式】利用定量或實時PCR。特別令人感興趣的是本發明的方法與"DNA陣 列"讀出形式的結合。來自本文所述的多重鄰近延伸分析的幾種獨特延伸產物可以雜交至 標準化的DNA陣列，所述DNA陣列攜帶許多與延伸產物序列互補的寡核苷酸序列（標記）。 雜交于陣列的每種延伸產物可以通過其在DNA陣列上的位置確定，并且在給定的雜交斑點 中的檢測的強度將表明特異性延伸產物的量，從而也表明產生該延伸產物的分析物的量。 可以通過光譜法、熒光、放射性同位素等來檢測延伸產物。可以在擴增反應（PCR)中使用熒 光標記的引物或熒光標記的核苷酸將熒光部分方便地引入到延伸產物中。DNA陣列可以是 含有少量斑點的膜上的簡單的點印跡陣列，或攜帶成百上千的斑點的高密度陣列。
[0240] 可以對本發明的方法進行修飾以進一步降低與非特異性核酸雜交事件相關的背 景。這樣的修飾包括對降低任何非特異性核酸雜交事件的方法所進行的調整。在一些具 體實施方式中，可以將蛋白質加入含有樣品和鄰近探針的混合物中以減少弱的和非特異 性的DNA雜交事件。例如，已將大腸桿菌單鏈DNA結合蛋白用于提高引物延伸反應和PCR 反應的產率和特異性（美國專利第5, 449, 603號和第5, 534, 407號）。噬菌體T4的基因 32蛋白（單鏈DNA結合蛋白）明顯提高了擴增更大的DNA片段的能力（Schwartz等人， 核酸研究 18:1079 (1990)) (Schwartz, et al.，Nucl. Acids Res. 18:1079 (1990))，并提高 了 DNA 聚合酶的保真度（Huang, DNA 和細胞生物學 15:589-594(1996)) (Huang, DNA Cell. Biol. 15:589-594(1996))。當采用時，這樣的蛋白質將用于在反應混合物中達到的濃度范 圍是約〇· 〇lng/ μ L至約1 μ g/ μ L，如約0· lng/ μ L至約100ng/ μ L，包括約lng/ μ L至約 10ng/μ L〇
[0241] 在一些【具體實施方式】中，可以通過在分析中加入聚-A RNA(poly_A RNA)和/或主 體RNA來降低背景。主體RNA也稱總RNA，S卩，主體RNA僅僅是從例如細胞的樣品中提取的 總RNA，包括存在于所述樣品中一種以上的形式的RNA，優選是所有不同形式的RNA，例如， mRNA,、rRNA、微小 RNA 等。
[0242] 在其它【具體實施方式】中，部分雙鏈的核酸可以用作第一和第二鄰近探針的核酸結 構域以降低弱的和非特異性的DNA雜交事件。
[0243] 如上所述，對本發明的方法進行設計，以使第一和第二探針的核酸結構域之間的 相互作用只有在探針結合于分析物時才發生。然而，在該類型的所有分析的情況下，不能總 是保證這一點，并且如果探針在溶液中隨機地鄰近時，那么可能有核酸結構域的一些背景 相互作用（該可能性在如下【具體實施方式】中會降低：需要探針的核酸結構域借助夾板彼此 雜交以發生此類相互作用；與雙探針分析相比，所有三種結構域隨機鄰近的機會降低，然而 這仍然可以在某些情況下發生）。為了使由于未結合的（即未反應的）探針導致的背景的 可能性降低或最小化，除了上述的和本領域已知的任意其它封閉試劑以外，可以使用封閉 寡核苷酸。在優選的【具體實施方式】中，樣品可以在加入鄰近探針之前與一種或多種封閉試 劑一起培養，所述封閉試劑是BSA等，如國際專利W02012/007511等所描述的封閉試劑。
[0244] 封閉寡核苷酸結合（即，雜交或退火）于第一和第二鄰近探針的核酸結構域的游 離端。因此，封閉寡核苷酸可以結合于5'鄰近探針的核酸結構域的游離3'0H端和3'鄰近 探針的核酸結構域的5'磷酸酯端。封閉寡核苷酸的結合在高的局部濃度的夾板寡核苷酸 存在下可以具有更高的競爭力，如本發明的一些【具體實施方式】中所發生的。以這種方式，在 不存在分析物結合時，封閉寡核苷酸可以阻止第一和第二結構域雜交至夾板。在其它具體 實施方式中，一種或多種特異性"競爭"寡核苷酸可以加入分析中，例如在鄰近探針與靶標 分析物相連之后，以使封閉寡核苷酸從探針的核酸結構域的末端解離，從而使得鄰近探針 的結構域能相互作用。因此，可以阻止5'和/或3'探針的游離端相互作用，直到它們結合 于分析物之后。在夾板寡核苷酸被使用并形成第三鄰近探針的核酸結構域的【具體實施方式】 中，當所有三種探針結合于分析物時，夾板的局部濃度足以超過封閉寡核苷酸；第一和第二 結構域雜交于夾板并且封閉寡核苷酸被取代。
[0245] 因此，封閉寡核苷酸使得能夠使用基于競爭的策略以降低背景，并從而提高分析 的靈敏度。
[0246] 封閉寡核苷酸的長度范圍是約4-100個核苷酸，例如6-75個或10-50個。它們 可以雜交至第一或第二探針的核酸結構域的游離端或游離端附近（"附近"的意思是游離 3'或5'端的1-20個或1-10個核苷酸以內，例如1-6個核苷酸）。雜交區域的長度可以是 3-15 個核苷酸，例如 3-12、3-10、3-8、4-8、3-6、4-6。
[0247] 封閉寡核苷酸通常相對于各探針過量使用，例如，過量2-1000倍，例如，20-500、 50-300、100-500 或 100-300 倍，例如，20、200 或 300 倍。
[0248] 競爭寡核苷酸通常相對于封閉寡核苷酸過量使用，例如，過量2-1000倍，例如， 20-500、50-300、100-500 或 100-300 倍，例如，20、200 或 300 倍。
[0249] 在使用具有低親和力和緩慢的結合動力學的鄰近探針來檢測分析物的情況下，與 鄰近探針在足夠高的濃度下進行預培養的步驟促進了鄰近探針與分析物的結合。該預培養 步驟可以快速在大體積的冷緩沖液中稀釋（例如，不包括分析物或鄰近探針的緩沖液），和 隨后將部分該稀釋液加入延伸反應混合物中。低溫使得存在的鄰近探針分析物復合物的解 離最小化，而大量稀釋導致未結合鄰近探針的濃度降低，從而降低其反應性和背景信號的 最小化，所述低溫例如是約〇°C至約20°C，包括約4°C至約10°C。
[0250] 在這樣的【具體實施方式】中，通過使用如下小的培養體積的樣品和鄰近探針來實施 分析：約1μ 1至約20μ 1，諸如約1μ 1，或約2μ 1，或約3μ 1，或約4μ 1，或約5μ 1或約 6 μ 1。因此，鄰近探針在最終培養體積中的有效濃度是被稀釋的，降低了背景，同時維持了 信號，這是由于在第一和第二核酸結構域被延伸之前沒有時間解離探針和分析之間的結合 從而維持了信號。只要延伸產物可以由較大的體積來濃縮，諸如Ι00μ 1以上或更多，并且 隨后檢測鄰近依賴相互作用，那么該方法能夠具有極高的靈敏度。在這樣的【具體實施方式】 中，通過使用單鏈結合蛋白能夠減少探針-探針相互作用。
[0251] 與復雜樣品相關的問題可以通過在分析之前先稀釋復雜樣品來解決。這極大地減 少了可非特異性結合探針的蛋白質的量，從而降低了所需探針的濃度。雖然樣品還將被稀 釋，但是高敏感性的鄰近探測將提供良好的檢測和定量。
[0252] 可如上所述均質地（即在溶液中）或者可選地異質地使用固相來采用本發明的方 法，所述使用固相例如是其中結合的分析物固定在固相上，允許使用洗滌步驟。固相分析的 使用提供了優點，特別是對困難樣品的檢測提供了優點：洗滌步驟可以有助于除去抑制性 組分，并且可以從不需要的大的樣品體積中富集分析物。由于未結合的分析物和探針可以 通過洗滌而除去，因此可以使用較高濃度和較大量的鄰近探針。通過洗滌除去未結合的或 未綴合的探針的能力也意味著固相分析與均質分析相比可耐受更低純度的鄰近探針。
[0253] 將分析物固定在固相上可以采用多種方式來實現。因此，本發明固相分析的幾種

【具體實施方式】被考慮。在一種這樣的【具體實施方式】中，一個（或多個）第一或第二（或第 三鄰近探針，如果使用）可以被（或者能夠被）固定在固相（或者固體支持物）上。分析 物可以首先被一個（或多個）固定的（或可固定的）探針捕獲，其次再被隨后加入的探針 結合。在這樣的方案中，前述的親和力效果可不存在于結合步驟中，但是與洗滌步驟相關。 優選地，在將非固定的/不可固定的探針加入反應混合物的同時，使分析物與固相結合的 (即，固定的，或可固定的）探針接觸，使得親和力效果也有助于檢測（結合）步驟。
[0254] 固定化的鄰近探針可以被固定，S卩，以任何方便的方式結合于支持物。因此，固定 的方式或手段和固體支持物可以選擇，根據選擇需要，選自本領域眾所周知且在文獻中描 述的任何數量的固定裝置和固體支持物。因此，探針可以直接結合于支持物，例如通過分析 物結合結構域（例如，化學交聯的），它也可以借助連接基團或通過中間結合基團間接地結 合（例如，通過接觸生物素 -鏈酶親和素相互作用）。因此，鄰近探針可以具有用于固定在 支持物上的裝置（例如，能夠結合于其結合伴侶的親和結合伴侶，例如生物素或半抗原，所 述結合伴侶即同源結合伴侶，例如鏈霉素或抗體）。探針可以在結合于分析物之前或之后固 定。此外，這樣的"可固定的"探針可以與支持物一起接觸樣品。
[0255] 固體支持物可以是目前廣泛使用的或建議用于固定、分離等的任何眾所周知的支 持物或基質。這些可以呈現顆粒（例如，磁性或非磁性珠）、片、凝膠、濾器、膜、纖維、毛細管 或微量滴定條、管、板或孔等的形式。
[0256] 支持物可以由玻璃、硅膠、乳膠或聚合材料制成。適合的材料是具有結合分析物的 高表面積的材料。這樣的支持物可以具有不規則的表面并且可以是例如多孔的或顆粒狀 的，例如，顆粒、纖維、纖網、燒結物或篩。顆粒材料，例如珠，由于其較高的結合能力從而是 有用的，特別是聚合珠。
[0257] 便利地，根據本發明所使用的顆粒固體支持物將包括球形珠。珠的尺寸并不是關 鍵的，但是它們的直徑至少是1 μ m且優選至少是2 μ m，并且最大直徑優選不超過10 μ m，例 如不超過6 μ m。
[0258] 單分散顆粒，即尺寸基本均勻的顆粒（例如，具有小于5%的直徑標準偏差的 尺寸），具有提供非常均勻的反應重現性的優點。代表性的單分散聚合物可以通過在 US-A-4336173中描述的技術產生。
[0259] 然而，為了幫助操作和分離，磁性的珠是有利的。如本文所用的術語"磁性的"是 指當置于磁場中時能夠被賦予磁矩的支持物，例如，支持物可以是順磁性的，因此支持物在 該場的作用下可以移動。換言之，包括磁性顆粒的支持物可以容易地通過磁聚集而除去，所 述磁聚集在分析物結合步驟之后提供了快速、簡單和有效的分離顆粒的方式。
[0260] 在另一個【具體實施方式】中，除了均質分析的非固定的鄰近探針以外，可以使用僅 包括結合結構域（即，分析物捕獲探針）的固定化的（或可固定的）分析物特異性探針。因 此，在這樣的【具體實施方式】中，分析物首先被固定的或可固定的捕獲探針所捕獲，所述捕獲 探針僅用于將分析物固定在固相上，隨后固定的分析物與鄰近探針培養。在這樣的具體實 施方式中，捕獲探針可以是能夠直接或間接結合分析物的任何結合伴侶（例如，如以上就 鄰近探針的分析物結合結構域所討論的）。更具體地，這樣的捕獲探針特異性結合于分析 物。由于該方法的這種【具體實施方式】需要至少三種探針（結合結構域）同時結合于分析物 或分析物復合物，因此可能能夠探測至少三種不同的表位，使分析具有高特異性。
[0261] 在進一步的【具體實施方式】中，分析物本身可以通過例如非特異性吸附來固定（或 可固定）在固相上。在具體的這樣的【具體實施方式】中，分析物可以存在于細胞內，可選地被 固定和/或滲透，所述細胞（能夠）連接于固體支持物。
[0262] 上述方法提供對存在于反應混合物的夾板介導的鄰近依賴性相互作用的檢測，其 反過來提供了對被分析的樣品中的靶標分析物的量的測量。所述測量可以是定性或定量 的。
[0263] 因此，上述檢測一種或多種靶標分析物存在的復雜樣品的方法可用于多種不同的 應用。
[0264] 本發明的方法可以用于針對樣品中一種或多種靶標分析物的存在或不存在來篩 選樣品。如上所述，本發明提供了對檢測樣品中一種或多種靶標分析物的存在或者對樣品 中一種或多種靶標分析物的量進行定量的方法。
[0265] 本發明的方法可以用于檢測多種不同類型的樣品中一種或多種靶標分析物的存 在，包括具有大量非靶標實體的復雜樣品，其中本發明的方法提供對靶標分析物的高靈敏 度檢測。因此，本發明的方法是檢測簡單樣品中或復雜樣品中的一種或多種靶標分析物的 高靈敏度方法。在很多【具體實施方式】中，本發明的方法所分析的樣品是生理來源的，如上更 詳細地描述的。
[0266] 除了檢測多種分析物，本發明的方法還用于篩選化合物，所述化合物是用于調節 具有分析物結合區域的鄰近探針的分析物結合結構域之間的相互作用，即，分析物結合結 構域與分析物的結合。術語調節包括降低（例如抑制）和增強兩個分子之間的相互作用。 篩選方法可以是體外或體內形式，其中兩種形式均容易由本領域技術人員研發。
[0267] 多種不同的候選試劑可以通過上述方法篩選。候選試劑包括大量的化學種類，但 是它們通常是有機分子，優選分子量大于50且小于2500道爾頓的小有機化合物。候選試 劑包括與蛋白質結構相互作用所必須的官能團，所述相互作用特別是氫鍵，并且一般包括 至少氨基、羰基、羥基或羧基，優選至少兩個化學官能團。候選試劑通常包括被一個或多個 上述官能團取代的環狀碳或雜環結構和/或芳香或聚芳香結構。候選試劑還可以是生物分 子，包括肽，糖類，脂肪酸，留體，嘌呤，嘧啶，它們的衍生物，結構類似物或組合。
[0268] 候選試劑由多種來源獲得，所述來源包括合成或天然化合物的庫。例如，許多方法 可以用于多種有機化合物和生物分子的隨機和定向合成，包括寡核苷酸和寡肽的隨機化制 備。可選地，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物庫是可得的或容易制備的。此 夕卜，天然或合成制備的庫和化合物容易通過傳統的化學、物理和生物化學手段被修飾，并且 可以用于制備組合庫。已知的藥物試劑可以進行定向或隨機化學修飾，諸如酰化、烷基化、 酯化、酰胺化等，以產生結構類似物。
[0269] 在上述篩選分析中確定的試劑在多種方法中是有用的，包括調節靶標分析物活性 的方法，和與其存在和/或活性相關的條件。
[0270] 本發明還提供了用于實施如上所述方法的試劑盒。例如，在一些【具體實施方式】中， 用于實施本發明方法的試劑盒包括至少一組鄰近探針，所述鄰近探針各自包括如上所述的 分析物結合結構域和核酸結構域。如上所述，某些方案將采用兩個或多個不同的這樣的探 針組，以同時檢測樣品中的兩種或多種分析物，例如，以多重和/或高通量形式。因此，在某 些【具體實施方式】中，試劑盒將包括兩個或多個不同的鄰近探針組。此外，在使用試劑盒組分 來實施的方案中可以存在需要或希望的其它試劑，所述其它試劑包括但不限于：一種或多 種如上所述的室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶，具有3'核酸外切酶活性的組分，夾 板寡核苷酸（任選地以第三鄰近探針的形式），封閉寡核苷酸，競爭寡核苷酸，用于固定探 針、結合結構域或分析物的固體支持物，用于固定探針、結合結構域或分析物的裝置，擴增 和檢測裝置，例如突光標記的核苷酸或寡核苷酸或嵌入染料（例如，SYBR Green?和/或 EvaGreen?)，補充核酸對，單鏈結合蛋白，和PCR擴增試劑（例如，核苷酸、緩沖液、陽離子 等）等。在某些【具體實施方式】中，試劑盒可以包括用于降低如上所述的培養混合物的有效 體積的元件，例如，體積排阻劑。試劑盒組分可以存在于單獨的容器中，或一種或多種組分 可以存在于相同的容器中，其中所述容器可以是儲存容器和/或在針對設計的分析過程的 試劑盒中采用的容器。
[0271] 除了上述組分，本發明試劑盒可以進一步包括用于實施本發明方法的說明。這些 說明可以按照多種形式存在于本發明試劑盒中，所述一種或多種說明可以存在于試劑盒 中。這些說明可能存在的一種形式是作為在適合的介質或基材上的印刷的信息，所述介質 或基材例如是印刷了信息的一張或多張紙，在試劑盒的包裝中，在包裝說明書中等。另一種 裝置可以是記錄了信息的電腦可讀的介質，例如，磁盤、CD、閃存盤等。可以存在的又一種裝 置是網址，所述網址可以通過互聯網使用，以訪問遠離的站點的信息。任何便利的裝置都可 以存在于試劑盒中。
[0272] 因此，在另一方面，本發明提供了一種用于檢測樣品中分析物的試劑盒，所述試劑 盒包括：
[0273] (a)至少第一和第二鄰近探針的至少一組，每個探針包括分析物結合結構域和核 酸結構域并且能夠同時結合至分析物，優選地，其中一個或多個所述鄰近探針的核酸結構 域包括發夾結構；和
[0274] (b)聚合酶，其特征在于，其在40°C的活性小于其最大酶活性的20%，其中所述聚 合酶最大活性的最適溫度大于40°C ;和
[0275] (c)可選地，具有3'核酸外切酶活性的組分；和
[0276] (d)可選地，用于擴增和檢測所述延伸產物的裝置。
[0277] 如上所述，除了聚合酶，試劑盒還可包括延伸核酸結構域的裝置，這樣的裝置可選 地可以進一步包括聚合酶反應所必須的試劑（例如核苷酸等）。用于擴增和檢測延伸產物 的裝置，可以是上述在分析方法部分所討論的任何裝置，例如，擴增裝置和檢測其擴增產物 的裝置，例如，用于PCR反應的試劑（例如，擴增引物，和可選地聚合酶和/或核苷酸等）和 用于檢測PCR擴增子等的試劑（例如Taqman?探針，嵌入染料，諸如SYBR Green?和/或 EvaGreen?,等等）。
[0278] 試劑盒可進一步可選地包括針對第一和第二探針的夾板寡核苷酸和/或封閉寡 核苷酸。
[0279] 試劑盒可進一步可選地包括針對分析物的固定化的捕獲探針，或裝備有用于固定 的裝置的捕獲探針。可選地，試劑盒可以包括用于捕獲或結合于分析物的固相，或一種或多 種所述第一或第二鄰近探針可以固定或裝備有用于固定的裝置。
[0280] 參照以下附圖以及以下非限制性實施例對本發明作進一步描述，其中：
[0281] 圖1顯示了五個不同版本的鄰近延伸分析的示意圖。
[0282] 顯示的條形圖是描繪使用本發明方法檢測白細胞介素 _8 (ΙΟΟρΜ)所用各種 超嗜熱聚合酶和嗜熱聚合酶的活性的，這些酶中的一些具有3'核酸外切酶活性，在所述 檢測過程中，延伸反應在室溫（實驗室溫度）、37°C或45°C進行。Pfu-具有3'核酸外切 酶活性的Pfu DNA聚合酶；TLA-具有3'核酸外切酶活性的超嗜熱古細菌（Thermococcus onnurineus)NAlDNA聚合酶；超超新星（Hypernova)-具有3'核酸外切酶活性的Pwo DNA聚 合酶的變體（突變體）；德爾塔3 (Delta3)-具有降低的3'核酸外切酶活性的Pwo DNA聚 合酶的變體（突變體）；K0D外切+(K0D exo+)-具有3'核酸外切酶活性的超嗜熱始原菌 (Thermococcus kodakaraensis)DNA 聚合酶；K0D 外切-(K0D ex〇-)_ 不具有 3'核酸外切酶 活性的超嗜熱始原菌（Thermococcus kodakaraensis)DNA聚合酶；夢Taq(DreamTaq)-不具 有3'核酸外切酶活性的Taq DNA聚合酶的變體。
[0283] _顯示的條形圖是描繪使用本發明方法檢測白細胞介素 _8 (l〇〇pM)所用不同 超嗜熱聚合酶的活性的。Pfu-具有3'核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；Pfu外切-(Pfu exo-)-不具有3'核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；超超新星（Hypernova)-具有3'核 酸外切酶活性的Pwo DNA聚合酶的變體（突變體）。
[0284] Mi顯示的條形圖是使用本發明方法檢測白細胞介素 -8 (l〇〇pM)所用不同嗜熱聚 合酶的活性進行比較的條形圖，其中包括聚合酶在內的用于反應的延伸步驟的組分在室溫 被加入。Pfu-具有3'核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；T4-具有3'核酸外切酶活性的 T4DNA聚合酶。
[0285] 顯示了條形圖描繪了使用本發明方法檢測白細胞介素 _8 (IL8)或神經膠質 細胞-衍生的神經營養因子（⑶NF)時所用的Pfu DNA聚合酶活性，其中延伸反應在45°C 或50°C進行。被延伸以形成延伸產物的鄰近探針的核酸結構域是線性的（原始Hyb)(Hyb Orig)或包括發夾結構（Hyb#3或Hyb#5)。
[0286] 遷衛是顯示在本發明方法中使用Pw〇 DNA聚合酶來檢測樣品中不同濃度的分析物 所產生的信號的折線圖。該圖顯示了使用偶聯至線性核酸結構域（VEGF org)的鄰近探針 與偶聯至包含發夾結構的核酸結構域（VEGF HP5)的鄰近探針的分析之間的區別。
[0287] S1顯示了偶聯至具有如下結構的核酸結構域的鄰近探針的比較：線性結構（1)， 封閉構象的發夾結構（2)和開放構象的發夾結構（3)。
[0288] _顯示了針對血漿樣品，PEA的不同定量PCR分析的比較。 實施例
[0289] 鄰近-探針的制備
[0290] 使用三份（batch)多克隆抗體（IL8(針對白細胞介素 -8) :RnD系統、AF-208-NA ; VEGF(針對血管內皮生長因子）：AF-193-NA ;⑶NF(針對神經膠質細胞系-衍生的神經營養 因子）：AF-212-NA)。使用Innovas Lightning-Link綴合技術將每一批多克隆抗體偶聯至 兩條不同的ssDNA鏈。每條鏈通過5'端偶聯至抗體：
[0291] A-綴合物（參見圖7)
[0292] 5' TCACGGTAGCATAAGGTGCAGTATGAGAACTTCGCTACAG-3' （SEQ ID N0:3);
[0293] B-綴合物（參見圖7)
[0294] 5, -GGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGATGAGACTGGATGAA-3' （SEQ ID N0:4)。
[0295] 被稱為"延伸寡核苷酸"的第三寡核苷酸以4:1 (寡核苷酸：綴合物）的比值雜交 至A-綴合物。
[0296] 對三種不同的"延伸寡核苷酸"進行了測試，其中它們中的兩種已被設計為在低溫 形成發夾環。
[0297] 原始的（線性寡核苷酸）：
[0298] 5'-CTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCACCTTATGCTACCGTGACCTGCGAATCCAGTCT-3' （SEQ ID NO:5)；
[0299] HP3(發夾寡核苷酸）：
[0300] 5 '-CTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCACCTTATGCTACCGTGAAGACTGAATCCAGTCT-3 ' (SEQ ID NO:6)；
[0301] HP5(發夾寡核苷酸）：
[0302] 5 '-CTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCACCTTATGCTACCGTGAAGGCTGAATCCAGTCT-3 ' (SEQ ID NO: 7)
[0303] 以粗體加下劃線來標出發夾寡核苷酸中的互補核苷酸。
[0304] 鄰沂延伸分析（PEA)中測試不同的聚合酶
[0305] 使用下面描述的方案來測試不同聚合酶以測定它們在鄰近延伸分析中的效率。結 果顯示在圖2中，圖2證實超嗜熱聚合酶，例如Pfu和Pwo (超超新星和德爾塔3)，能夠在室 溫下被加入到包含鄰近探針和靶標分析物的樣品中，當與不含酶的分析比較時，它們在PEA 中不會產生顯著的信號。這表明這些酶在室溫下是無聚合酶活性或只具有聚合酶最小活性 的。對于Pfu和Pwo而言，在37°C和45°C培養的PEA中產生的信號能夠清楚地區別于室溫 下培養的PEA中產生的信號。相反，在上述三個測試溫度中任一溫度下，使用嗜熱聚合酶的 分析中產生的信號不容易被區別開，即，這些聚合酶在PEA中顯示高背景活性。
[0306] 方案 #1
[0307] 將1 μ L樣品（PBS+0. 1 % BSA緩沖液，來自RnD系統的抗原標準品（IL-8 : 208-IL-010/CF ;VEGF :293-VE-010/CF ;⑶NF :212-GD-010/CF)，EDTA 血漿）與 4 μ L 含有如 下物質的pH為6. 7的分析溶液進行混合：0. 084mg/ml山羊IgG(西格瑪奧德里奇19140) (Sigma Aldrich 19140)，50 μ g/ml 單鏈鮭魚精子 DNA(西格瑪奧德里奇 D7656) (Sigma Aldrich D7656)，0.05%魚膠（西格瑪 G7765)(Sigma G7765)，0.1%BSA，4mM EDTA，0.1% Triton-X100,1 μ M 封閉綴合物（Olink AB，國際專利 W02012/007511)和 133pM 的每種 PEA 綴合物（鄰近探針，如上所述）。將反應混合物在37°C培養1小時。
[0308] 在25°C，將96yL含有如下物質的稀釋混合物加入到培養的樣品中：67.7mM 1'1^8-!1(：1口!18.8，171111硫酸銨，2.111111%(：1 2，1.〇1111二硫蘇糖醇，31.3 4]\1(每種）的(1階13和 〇· 5 單位的 DNA 聚合物（Pfu (富酶泰斯，EP0572) (Fermentas，EP0572)，TLA (柏業，E-3200) (Bioneer，E-3200)，超超新星（DNA 格旦斯克，RP23) (DNA Gdansk，RP23)，德爾塔 3(DNA 格旦 斯克，RP22) (DNA Gdansk，RP22)，K0D (東洋紡，K0D-101) (1'〇7〇13〇，1(00-101)，1(00外切-(東 洋紡）（Toyobo)，夢 Taq (富酶泰斯，EP0703) (Fermentas，EP0703))。反應板在 PCR 儀中在 25°C培養10分鐘，隨后在25°C、37°C或45°C培養20分鐘，之后在80°C培養10分鐘。
[0309] 對于延伸產物的qPCR檢測，將4 μ L延伸產物轉移到qPCR板中，并且與6yL 9?〇?混合物（25禮1^8-!1(：1?!18.2，11.31111氯化鎂，5〇1111氯化鉀，8.31111硫酸銨，8.3% 海藻糖（阿克羅斯有機，182550250) (Acros Organics，182550250)，333 μ Μ(每種）dNTP， 1. 67mM 二硫蘇糖醇，833nM 的每種引物（正向：5' -TCGTGAGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGA-3' (SEQIDN0:8)，反向：5，-TGCAGTCTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCA-3'（SEQIDN0:9))，0·25X SYBR Green (GTF 費舍爾科技，307104406) (GTF Fisher Scientific，307104406)，0.25U 白 金 Taq (英駿，300100338) (Invitrogen，300100338)和 2μΜ R0X 參比物（GTF 費舍爾科技， 307101211) (GTF Fisher Scientific, 307101211))進行混合。兩步 qPCR 在如下條件下運 行：起始的變性步驟在95°C進行5分鐘，隨后是45個循環的變性，每次是95°C變性15秒， 之后是在60°C結合的退火和延伸進行1分鐘。
[0310] 鄰沂延伸分析（PEA)中測試不同的鄰沂探針核酸結構域的結構
[0311] 使用下面描述的方案來測試不同鄰近探針核酸結構域以測定它們在鄰近延伸分 析中的效率。結果顯示在圖5中，圖5證實展開鄰近探針，即偶聯至含有發夾結構的核酸結 構域的鄰近探針對于改善在PEA中信號：噪音比是有用的。
[0312] PEA 方案 #2
[0313] 將1 μ L樣品（PBS+0. 1 % BSA緩沖液，來自RnD系統208-IL-010的IL-8抗原 標準品，EDTA血漿）與4 μ L含有如下物質的pH為6. 7的分析溶液進行混合：0. 084mg/ ml山羊IgG (西格瑪奧德里奇19140) (Sigma Aldrich 19140)，50 μ g/ml單鏈鮭魚精子 0嫩（西格瑪奧德里奇07656)(3丨811^41(11^(*07656)，0.05%魚膠（西格瑪67765)(3丨 811^ G7765)，(λl%BSA，4mMEDTA，(λl%Triton-X100，lμM封閉綴合物（01inkAB，國際專利 W02012/007511)和133pM的每種PEA綴合物（鄰近探針，如上所述）。反應混合物在37°C 培養1小時。
[0314] 在25°C，將96yL含有如下物質的稀釋混合物加入到培養的樣品中：67.7mM 1'1^8-!1(：1?!18.8，171111硫酸銨，2.111111%(：12，1.〇1111二硫蘇糖醇和31.3 4]\1(每種）的(1階13。 然后，反應板在45°C或50°C培養30分鐘。
[0315] 對于延伸產物的qPCR檢測，將4yL延伸產物轉移到qPCR板中，并且與6yL qPCR 混合物（25mM Tris-HCl pH8. 2，11.3mM氯化鎂，50mM氯化鉀，8. 3mM硫酸銨，8. 3%海藻糖 (阿克羅斯有機，182550250) (Acros Organics，182550250)，333 μ Μ(每種）dNTP，1. 67mM 二 硫蘇糖醇，833nM 的每種引物（正向：5' -TCGTGAGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGA-3'（SEQ ID NO: 10)，反向：5, -TGCAGTCTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCA-3,（SEQ ID NO: 11)，Biomers 公司）， 0.25X SYBR Green(GTF 費舍爾科技，307104406) (GTF Fisher Scientific，307104406)， 0.25U 白金Taq(英駿，300100338) (Invitrogen，300100338)和 2μΜ ROX參比物（GTF 費舍 爾科技，307101211) (GTF Fisher Scientific, 307101211))進行混合。兩步 qPCR 在如下條 件下運行：起始的變性步驟在95°C進行5分鐘，隨后是45個循環的變性，每次是95°C變性 15秒，之后是在60°C結合的退火和延伸進行1分鐘。
[0316] 圖6顯示來自與上述方案等同分析的結果，其中，使用線性雜交寡核苷酸和一種 發夾寡核苷酸對檢測不同濃度VEGF進行了測定。結果清楚地表明使用本發明方法中的發 夾寡核苷酸可進一步改善信號：噪音比。
[0317] 在鄰沂延伸分析（PEA)中軺嗜熱聚合酶和非耐熱聚合酶的比較
[0318] 使用下面描述的方案對兩種聚合酶，即Pfu和T4DNA聚合酶，進行比較以測定它 們在鄰近延伸分析中的效率。結果顯示于圖4中，圖4證實與室溫下具有高活性的酶例如 T4DNA聚合酶相比，室溫下無活性或具有最小活性的酶，例如Pfu,顯示了改善的信號：噪音 比。
[0319] PEA 方案 #3
[0320] 將1 μ L樣品（PBS+0. 1 % BSA緩沖液，來自RnD系統208-IL-010的IL-8抗原 標準品，EDTA血漿）與4 μ L含有如下物質的pH為6. 7的分析溶液進行混合：0. 084mg/ ml山羊IgG(西格瑪奧德里奇19140) (Sigma Aldrich 19140)，50 μ g/ml單鏈鮭魚精子 0嫩（西格瑪奧德里奇07656)(3丨811^41(11^(*07656)，0.05%魚膠（西格瑪67765)(3丨 811^ G7765)，(λl%BSA，4mMEDTA，(λl%Triton-X100，lμM封閉綴合物（01inkAB，國際專利 W02012/007511)和133pM的每種PEA綴合物（鄰近探針，如上所述）。反應混合物在37°C 培養1小時。
[0321] 探針培養后，將樣品轉移至熱循環儀，放置在37°C。將76 μ L含有如下物質的稀 釋混合物加入到培養的樣品中：56. 5mM Tris-HCl pH8. 8，16. 8mM硫酸銨，l.OlmM氯化鎂和 ImM二硫蘇糖醇。在37°C 5分鐘之后，第二次加入20 μ L延伸混合物（59. 3mM Tris-HCl pH8. 8,17. 7mM硫酸銨，1. 05mM二硫蘇糖醇，ImM氯化鎂，和1單位的T4DNA聚合酶（富酶 泰斯，#EP0062) (Fermentas，#EP0062)或 0· 5 單位的 Pfu DNA 聚合酶（富酶泰斯，EP0572) (Fermentas，EP0572))。延伸反應在25°C或37°C進行1或20分鐘，然后在85°C加熱滅活 10分鐘。
[0322] 對于延伸產物的qPCR檢測，將4yL延伸產物轉移到qPCR板中，并且與6yL qPCR 混合物（24. 3mM Tris-HCl pH8. 2,10. 6mM氯化鎂，48. 3mM氯化鉀，8. ImM硫酸銨，8. 1%海藻 糖（阿克羅斯有機，182550250) (Acros Organics，182550250)，333 μ Μ(每種）dNTP，1. 62mM 二硫蘇糖醇，806nM 的每種引物（正向：5' -TCGTGAGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGA-3'（SEQ IDN0:12)，反向：5'-TGCAGTCTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCA-3'（SEQIDN0:13)，Biomers公 司），403nM 分子信標（FAM-CCCGCTCGCTTATGCTACCGTGACCTGCGAATCCCGAGCGGG-DABSYL, (SEQ ID NO: 14)Biomers 公司），白金Taq(英駿，300100338) (Invitrogen，300100338)和 1· 93 μ Μ R0X 參比物（GTF 費舍爾科技，307101211) (GTF Fisher Scientific, 307101211))進行混合。 兩步qPCR在如下條件下運行：起始的變性步驟在95°C進行5分鐘，隨后是45個循環的變 性，每次是95°C變性15秒，之后是在60°C結合的退火和延伸進行1分鐘。
[0323] 俥用不同的實時（定量）PCR分析的鄰沂延伸分析的比較
[0324] 圖8說明了標準化的熒光信號，隨和每次PCR循環（A-C)其是增加的。當使用分子 信標時觀察到了基線的明顯不同，這在使用非序列特異性的嵌入染料時是不會觀察到的， 嵌入染料諸如是SybrGreen?或EvaGreen?(比較A與B，和A與C)。相比于等體積的含 PBS的緩沖液，100 μ 1的總反應體積中少至1 μ 1的血漿或血清可提高基線。血漿樣品中這 種升高的基線會影響對數期曲線的斜率，使得難以正確設置閾值，從而導致Ct值的誤算并 經常導致回收率遠超過100%。使用整合至雙鏈DNA的SybrGreen'?或EvaGreen?的分析 看起來并沒有受到?μ 1血漿或血清的影響，且更一致的給出了更接近約100%的回收率。
[0325] ΡΕΑ 方案 #4
[0326] 綴合于探針Α或探針Β (如上所述）的50ρΜ的VEGF抗體的混合物與1 μ 1緩沖液 或者1 μ 1人血漿（EDTA)或血清一起以4μ 1的總體積在37°C培養1小時。
[0327] 培養后，將96 μ 1延伸溶液與0. 25 μ Μ分子信標、0.15x SybrGreen?或〇. i25x EvaGreen?加入到上述培養混合物（50mM三羥甲基氨基甲烷（Tris)，0. 75mM MgCl2， 0.75mM DTT，12.5mM AmS04,2mM Mg2S04,0.15% 曲通（Triton)，0.15%BSA，2.08%Trealos， 0. ImM的每種dNTP，lyM正向引物和反向引物，0. 6μΜ R0X，1U超超新星聚合酶（+1U獵豹 Taq(Cheeta Taq)，用于分子信標分析））。起始延伸步驟（50°C20分鐘）之后進行預擴增 步驟（對于分子信標，95°C，15秒；60°C，30秒；76°C，30秒；xlO個循環，對于SybrGreen和 EvaGreen，95°C，15秒；60°C，1分鐘；xlO個循環）。預擴增步驟之后，將20 μ 1反應混合物轉 移到實時PCR板，并采用如下條件進行分析和擴增：分子信標（MB) :95°C，5分鐘+ (95°C，10 秒；5CTC，30 秒；72°C，30 秒）x40 個循環；SybrGreen 和 EvaGreen (Sybr/EvaGreen) :95°C，5 分鐘+ (95°C，15秒；60°C，1分鐘）x40個循環）。
[0328] 表 1
[0329]

【權利要求】
1. 一種檢測樣品中分析物的方法，包括： (a) 將所述樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個探針包括分析物結 合結構域和核酸結構域，并能夠同時結合至分析物； (b) 在所述鄰近探針與所述分析物結合時，使鄰近探針的核酸結構域彼此相互作用，其 中所述相互作用包括雙鏈體的形成； (c) 延伸所述雙鏈體的至少一個核酸結構域的3'端以生成延伸產物，其中，延伸反應 包括將分析的溫度提高至超過室溫并使用聚合酶，所述聚合酶的特點是40°C時其具有小于 最大酶活性的20%的活性，且25°C時其具有小于最大酶活性的10%的活性，其中，所述聚 合酶的最大活性的最適溫度是高于40°C，且其中所述聚合酶選自強烈火球菌（Pfu) DNA聚 合酶和沃氏火球菌（Pwo) DNA聚合酶，或者它們的衍生物或其突變體，優選地其中所述衍生 物是序列-修飾的衍生物；和 (d) 擴增和檢測延伸產物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，在其它參數是最適的分析條件下來測定不同溫 度下聚合酶的活性。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述聚合酶的特點是在40°C時，其具有小于 最大酶活性的15%的活性,優選地，其具有小于最大酶活性的10%的活性。
4. 根據權利要求1-3任一項所述的方法，其中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度是 至少50°C，優選至少60°C或70°C。
5. 根據權利要求1-4任一項所述的方法，其中，所述聚合酶由包括SEQ ID NO: 1的核苷 酸序列或者與其具有至少80^^85%或90%序列一致性的核苷酸序列所編碼。
6. 根據權利要求1-5任一項所述的方法，其中，所述聚合酶包括SEQ ID NO: 2的多肽序 列或者與其具有至少80^^85%或90%序列一致性的多肽序列。
7. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中，將所述分析的溫度提高到至少30°C，優 選至少 35°C、40°C、45°C、50°C或 55°C。
8. 根據權利要求1-7任一項所述的方法，其中，鄰近探針組中的至少一個鄰近探針是 展開鄰近探針，包括偶聯至具有至少一個發夾結構的核酸結構域的分析物結合結構域，優 選地其中所述展開鄰近探針的核酸結構域的發夾結構包括核酸結構域的游離3'可延伸端。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中，展開后，所述第一和第二鄰近探針的核酸結構域 互相互補，或者與通用模板互補。
10. 根據權利要求1-9任一項所述的方法，其中，在所述樣品與聚合酶接觸之前，將步 驟（d)擴增反應所用的一些或全部試劑加入到樣品中，或者其中，所述一些或全部試劑與 聚合酶同時接觸樣品，優選地其中，在步驟（b)和（c)之間加入所述試劑。
11. 根據權利要求1-10任一項所述的方法，其中，步驟（d)包括聚合酶鏈式反應，優選 地其中，聚合酶鏈式反應是定量聚合酶鏈式反應。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中，定量聚合酶鏈式反應使用插入核酸分子以提 供檢測信號的染料，優選熒光信號。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中，插入核酸分子以提供檢測信號的染料是 SYBR Green?或 EvaGreen?。
14. 根據權利要求1-13任一項所述的方法，其中，第一和第二鄰近探針的一個或兩個 核酸結構域在步驟（C)被延伸。
15. 根據權利要求1-13任一項所述的方法，其中，至少一個核酸結構域是部分雙鏈的。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中，部分雙鏈的核酸結構域包括雜交至夾板寡核 苷酸的單個單鏈核酸結構域，優選地其中，步驟（a)之前，夾板寡核苷酸預雜交至所述鄰近 探針之一的核酸結構域。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中，夾板寡核苷酸在步驟（c)被延伸以形成延伸產 物。
18. 根據權利要求16或17所述的方法，其中，夾板寡核苷酸作為游離核酸分子而被單 獨提供。
19. 根據權利要求1-18任一項所述的方法，包括使用幾組的至少第一和第二鄰近探針 的多重分析，其中每組產生唯一的延伸產物。
20. 根據權利要求1-19任一項所述的方法，其中，所述至少第一和第二鄰近探針中的 至少一個的分析物結合結構域是抗體，或者其結合片段或其衍生物。
21. -種用于檢測樣品中分析物的方法所用的試劑盒，所述試劑盒包括： (a) 至少第一和第二鄰近探針的至少一組，每個探針包括分析物結合結構域和核酸結 構域并且能夠同時結合至分析物，優選地，其中一個或多個所述鄰近探針的核酸結構域包 括發夾結構；和 (b) 聚合酶，其特點是其在40°C的活性小于其最大酶活性的20%并且其在25°C的活性 小于其最大酶活性的10%，其中所述聚合酶的最大活性的最適溫度是高于40°C，且其中所 述聚合酶選自強烈火球菌（Pfu) DNA聚合酶和沃氏火球菌（Pwo) DNA聚合酶，或者它們的衍 生物或其突變體，優選地其中所述衍生物是序列-修飾的衍生物；和 (c) 可選地，具有3'核酸外切酶活性的組分；和 (d) 可選地，用于擴增和檢測所述延伸產物的裝置。
22. 根據權利要求21所述的試劑盒，進一步包括針對第一和/或第二探針的夾板寡核 苷酸和/或封閉寡核苷酸。
23. 根據權利要求21或22所述的試劑盒，其中，所述聚合酶如權利要求2-6任一項所 定義。
24. 根據權利要求21-23任一項所述的試劑盒，包括擴增和檢測延伸產物的方法，其 中，所述用于擴增的方法包括擴增引物，并且所述用于檢測的方法包括嵌入染料，優選地其 中，所述染料是 SYBR GreeiT? 或 EvaGreen?。
【文檔編號】C12Q1/68GK104114718SQ201380007279
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年1月29日 優先權日:2012年1月30日
【發明者】S·弗雷德里克松, M·倫德伯格, A·埃里克松, E·倫內爾-狄更斯 申請人:歐凌科公司