一種提高普魯蘭多糖產量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種發酵過程中分段添加生長因子來提高普魯蘭多糖產量的方法，屬于生物發酵工程【技術領域】。利用出芽短梗霉CGMCC?NO.7055發酵生產普魯蘭多糖，并在菌體生長處于對數期初期時，加入0.03-0.05‰的維生素B1，當菌體生長處于穩定期前期時，加入0.02-0.04‰的尿嘧啶核苷酸，從而達到引導促進次級代謝產物即普魯蘭多糖的積累。本發明有針對性的根據不同生長周期和發酵過程中產糖的特點來添加生長因子，操作便捷，效果明顯，極大地縮短了發酵周期，提高了底物的轉化率，降低了普魯蘭多糖的成本。
【專利說明】—種提局普魯蘭多糖產量的方法
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種微生物發酵生產普魯蘭多糖的方法，具體涉及一種發酵過程中分段添加生長因子來提高普魯蘭多糖產量的方法。屬于生物發酵工程【技術領域】。
【背景技術】:
[0002]普魯蘭多糖是一種水溶性的不定形葡聚糖并作為水溶性多糖的模式多糖，它已作為乳化劑、懸浮劑、增稠劑、穩定劑、膠凝劑、成膜劑和潤滑劑等廣泛應用于食品、制藥、石油、化工等多個領域。普魯蘭多糖將是今后新型發酵工程的一個重要發展方向，越來越受到國內企業的重視。
[0003]生長因子是指微生物生長過程中必須的，必須由外界直接提供的營養成分，常見的生長因子有維生素、氨基酸、嘌呤嘧啶等。生長因子可以提供微生物重要化學物質、輔助因子(輔酶和輔基)的組分和參與代謝。普魯蘭多糖屬于次級代謝產物，在菌體處于對數期后期，穩定期前期開始產生。
[0004]目前文獻當中關于普魯蘭多糖產量提高主要是通過菌種誘變、培養基成分優化，往往效果不太明顯，發酵周期長，且底物的轉化率不高，導致普魯蘭多糖成本居高不下。申請號為201210594876.4的中國發明專利《大量生產普魯蘭多糖的誘變菌株及其培養方法》，公開了一株產普魯蘭多糖的出芽短梗霉CGMCC N0.7055，并公開了利用該菌株生產普魯蘭 多糖的方法，以及發酵培養基組成。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)BCSffGHPLlOl在發酵培養基發酵生產普魯蘭多糖產量為96g/L，較原始菌株68 ±5.2g/L的產量，提高了 41.2%，發酵條件為281:，200±20印111下培養3(1。但仍存在發酵周期較長，且底物轉化率較低，底物利用率不高的問題，導致普魯蘭多糖成本較高，不利于大批量、規模化生產。
【發明內容】
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[0005]為了解決普魯蘭多糖傳統優化過程中的不足，有針對性的提高普魯蘭多糖產量，縮短普魯蘭多糖發酵周期，提高底物轉化率，本發明提供了一種分段添加生長因子來提高普魯蘭多糖產量的方法，不僅操作方便，而且在提高產量的同時也減少了色素的產生。
[0006]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:
[0007]1.一種提高普魯蘭多糖產量的方法，包括以下步驟:
[0008]I)種子培養
[0009]將出芽短梗霉菌株進行活化后挑一環轉接到500ml擋板瓶中，培養基裝液量100ml，培養溫度為32°C，搖床轉速為180rpm，培養時間為28_32h。
[0010]所述種子培養基組成:蔗糖Sg，酵母浸粉0.2g，氯化鈉0.15g，磷酸氫二鉀0.lg，硫酸銨0.1g,硫酸鎂0.04g,硫酸亞鐵0.05g,蒸懼水定容至100mL。
[0011]2)發酵培養
[0012]500mL擋板瓶瓶裝液量IOOmL,接種量為4% (V/V)，溫度28°C，搖床轉速為400rpm進行培養。菌體生長處于對數期初期時，加入0.03-0.05%。的維生素B1,當菌體生長處于穩定期前期時，加入0.02-0.04%。的尿嘧啶核苷酸，培養57-63h，從而達到引導促進次級代謝產物即普魯蘭多糖的積累，提高底物轉化率，縮短發酵周期。
[0013]所述發酵培養基組成:蔗糖10g，蛋白胨0.4g，氯化鈉0.3g，磷酸氫二鉀0.7g，硫酸鎂0.(Mg，硫酸亞鐵0.05g，蒸餾水定容至IOOmL,初始pH5.5-6.5。
[0014]所述維生素B1及尿嘧啶核苷酸用去離子水配制成濃度0.01g/L的溶液然后通過
0.45um無菌濾膜過濾制備。
[0015]3)普魯蘭多糖的分離
[0016]發酵液濾除菌體后，加入三倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品。
[0017]所述出芽短梗霉BCSWGHPL101 (Aureobasidium pullulans)是由實驗室保藏的一株產色素量少的出芽短梗霉TKPM10017經篩選誘變獲得，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日期2012年12月25日，保藏編號為CGMCC N0.7055。
[0018]所述出芽短梗霉TKPM10017產量比較穩定約50_60g/L，色素產生較少，但發酵周期較長，底物轉化率較低。
[0019]所述誘變過程包括如下步驟:
[0020]1.打開紫外燈預`熱30min。取5mL孢子懸浮液,加入放有無菌轉子的50mm培養皿中，置于磁力攪拌器上，放于至波長254nm，功率30w的紫外誘變箱中，調整培養皿與紫外燈的距離為30cm。打開蓋，開啟磁力攪拌器恒速攪拌，紫外燈下分別照射Os，60s，120s, 180s,240s, 300s, 360s。所有操作均避光進行，將照射后的菌懸液做梯度稀釋，涂布于PDA固體培養基上28 °C恒溫避光培養72h。
[0021]2.將涂布于PDA培養基上的經過誘變的孢子懸浮液28°C培養72小時，利用游標卡尺測定單菌落的直徑，并觀察顏色，挑取出芽短梗霉(菌落直徑大、表面濕潤、顏色淺或白色)的變異株。
[0022]3.將通過平板初篩得到的單菌落，挑取單個菌落接種到發酵培養基(100mL/500mL)中，28°C、180r/min，利用搖床振蕩培養96h，測定發酵液顏色并測定普魯蘭
多糖產量。
[0023]4.將復篩選出的菌株在斜面上連續轉接十五代，挑取第三代、第六代、第九代、第十二代和第十五代進行發酵實驗，測定其顏色并測定普魯蘭多糖產量，選擇產量穩定且色素產生少，發酵周期短，底物轉化率高的菌株進行保藏，得到普魯蘭多糖高產菌株CGMCCN0.7055。
[0024]所述出芽短梗霉CGMCC N0.7055特性如下:
[0025]發酵液中主要呈現酵母樣形態，橢圓形且大小均一，菌株的繁殖方式類似于酵母的出芽生殖方式；菌落呈圓形，中心隆起，表面光滑，濕潤，不易挑取，生長后期有菌絲體產生。可以利用的碳源:葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、糊精其中之一。可以利用的氮源:牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、硝酸鈉、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨等，上述氮源可以混合使用，也可單一使用。
[0026]所述添加生長因子優化過程:[0027]普魯蘭多糖屬于次級代謝產物，已證實在微生物對數期后期、穩定期前期開始產生；為了縮短發酵周期，提高底物轉化率，采取添加生長因子促進菌體快速生長，迅速進入產糖階段，在產糖階段通過篩選添加某種生長因子，從而促進菌體利用底物轉化為多糖。
[0028]實驗室對出芽短梗霉的發酵研究中發現出芽短梗霉缺乏合成B族維生素的能力，而B族維生素不足正是制約出芽短梗霉生產普魯蘭多糖的產量和產率的原因所在。實驗室對此進行了大量研究，對維生素B族元素進行了篩選，對用量進行了優化，結果如表1:
[0029]表1:不同B族維生素不同用量對發酵周期的影響
[0030]
【權利要求】
1.一種提高普魯蘭多糖產量的方法，包括以下步驟: (1)種子培養 將出芽短梗霉菌株進行活化后挑一環轉接到500ml擋板瓶中，培養基裝液量100ml，培養溫度為32°C，搖床轉速為180rpm，培養時間為28_32h ； (2)發酵培養 500mL擋板瓶瓶裝液量IOOmL,接種量為4% (V/V)，溫度28°C，搖床轉速為400rpm，培養 57-63h ； (3)普魯蘭多糖的分離 發酵液濾除菌體后，加入三倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品； 其特征在于，菌體生長處于對數期初期時，加入0.03-0.05%。的維生素B1,當菌體生長處于穩定期前期時，加入0.02-0.04%。的尿嘧啶核苷酸； 所述出芽短梗霉 BCSWGHPL101 (Aureobasidium pullulans)保藏編號為 CGMCCN0.7055。
2.根據權利要求1所述 提高普魯蘭多糖產量的方法，其特征在于，所述維生素B1及尿喃唳核苷酸經過0.45um無菌濾膜過濾。
3.根據權利要求1所述提高普魯蘭多糖產量的方法，其特征在于，所述種子培養，培養基組成為:蔗糖Sg，酵母浸粉0.2g，氯化鈉0.15g，磷酸氫二鉀0.1g,硫酸銨0.1g,硫酸鎂0.04g,硫酸亞鐵0.05g,蒸懼水定容至100mL。
4.根據權利要求1所述提高普魯蘭多糖產量的方法，其特征在于，所述發酵培養，培養基組成為:蔗糖10g，蛋白胨0.4g，氯化鈉0.3g，磷酸氫二鉀0.7g，硫酸鎂0.04g，硫酸亞鐵0.05g，蒸餾水定容至IOOmL,初始ρΗ5.5-6.5。
5.根據權利要求1所述提高普魯蘭多糖產量的方法，包括如下步驟: (1)種子培養 將出芽短梗霉菌株進行活化后挑一環轉接到500ml擋板瓶中，培養基裝液量100ml，培養溫度為32°C，搖床轉速為180rpm，培養時間為28h ； (2)發酵培養 500mL擋板瓶裝液量IOOmL,接種量為4% (V/V)，溫度28 V，搖床轉速為400rpm培養58h ;菌體生長處于對數期初期時，加入0.03%。的維生素B1,當菌體生長處于穩定期前期時，加入0.04%。的尿嘧啶核苷酸； (3)普魯蘭多糖的分離 發酵液濾除菌體后，加入三倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品76.3g/L。
6.根據權利要求1所述提高普魯蘭多糖產量的方法，包括如下步驟: (1)種子培養 將出芽短梗霉菌株進行活化后挑一環轉接到500ml擋板瓶中，培養基裝液量100ml，培養溫度為32°C，搖床轉速為180rpm，培養時間為30h ； (2)發酵培養 500mL擋板瓶瓶裝液量IOOmL,接種量為4% (V/V)，溫度28 V，搖床轉速為400rpm培養59h ;菌體生長處于對數期初期時，加入0.04%。的維生素B1,當菌體生長處于穩定期前期時，加入0.03%。的尿嘧啶核苷酸； (3)普魯蘭多糖的分離 發酵液濾除菌體后，加入三倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品76.4g/L。
7.根據權利要求1所述提高普魯蘭多糖產量的方法，包括如下步驟: (1)種子培養 將出芽短梗霉菌株進行活化后挑一環轉接到500ml擋板瓶中，培養基裝液量100ml，培養溫度為32°C，搖床轉速為180rpm，培養時間為32h ； (2)發酵培養 500mL擋板瓶瓶裝液量IOOmL,接種量為4% (V/V)，溫度28°C，搖床轉速為400rpm，培養61h ;菌體生長處于對數期初期時，加入0.05%。的維生素B1,當菌體生長處于穩定期前期時，加入0.02%。的尿嘧啶核苷酸； (3)普魯蘭多糖的分離 發酵液濾除菌體后，加入三倍乙醇，攪拌，4°C靜置過夜，離心后，再使用無水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品75.6g/L。
8.根據權利要求1-7任一所述提高普魯蘭多糖產量的方法在普魯蘭多糖生產中的應用。
9.根據權利要求1-7任一所述提高普魯蘭多糖產量的方法制備的普魯蘭多糖。
【文檔編號】C12P19/10GK103695500SQ201310755715
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】喬長晟, 王建梓, 宋亞瓊, 郝華旋 申請人:天津北洋百川生物技術有限公司