副溶血性弧菌的檢測方法
【專利摘要】副溶血性弧菌的檢測方法，涉及副溶血性弧菌。用于副溶血性弧菌檢測的特異性引物是根據副溶血性弧菌種特異性基因tlh的保守區域所設計的一對外圍引物、一對交叉引物和一對特異性檢測探針；副溶血性弧菌種特異性基因tlh是編碼副溶血性弧菌不耐熱溶血毒素TLH的毒力基因。檢測方法：副溶血性弧菌模板DNA的提取；外圍引物的驗證；交叉引物恒溫擴增反應體系的建立；交叉引物恒溫擴增程序；擴增產物的檢測。靈敏度高，是普通PCR的10倍；特異性強，只檢出副溶血性弧菌，對其他致病菌檢測結果均為陰性；快速檢測，檢測時間縮短到1.5h，明顯提高檢測效率；簡便實用，擴增產物通過一次性試紙條進行檢測，10～30min即可完成。
【專利說明】副溶血性弧菌的檢測方法【技術領域】
[0001]本發明涉及副溶血性弧菌，尤其是涉及一種副溶血性弧菌的檢測方法。
【背景技術】[0002]副溶血性弧菌又稱嗜鹽菌，隸屬弧菌科的弧菌屬，是一種革蘭氏陰性人畜共患菌，廣泛分布在近海岸的海水、海底沉積物、海產品及腌制食品中。由該菌引起的食物中毒臨床癥狀多為急性腸炎，表現為腹痛、腹瀉、嘔吐，其潛伏期一般為8~20h，平均為12h，正常2~3天即可痊愈，愈后良好，少數嚴重患者可因搶救不及時而死亡。副溶血性弧菌食物中毒與進食含有該菌的食物有關，生食或食入未煮熟的受到污染的海產品或腌制食品是其主要傳播途徑。已知的重要的傳染源有螃蟹、蝦、扇貝、牡蠣、蛤類、海蜇、墨魚、咸菜、腌肉等。副溶血性弧菌的最適生長溫度為37°C，因此夏秋季成為副溶血性弧菌食物中毒的高發期，8月為高峰期。近年來由該菌引起的食物中毒事件已躍居我國食物中毒之首，快速簡便的檢測方法的建立是預防副溶血性弧菌食物中毒的有效途徑。
[0003]已建立的副溶血性弧菌的檢測方法有傳統方法:增菌培養法、最大可能計數法；免疫學方法:酶聯免疫吸附法、芯片法、膠體金、免疫傳感器、免疫磁珠法；分子生物學方法:常規PCR、多重PCR、熒光定量PCR、納米PCR、EMA-PCR法、核酸探針、LAMP法等([I]王國玲，欒玉明，劉達雄，陸家海.副溶血性弧菌檢測方法的研究進展[J].中國衛生檢驗雜志，2010，20(6):1574-1576)。
[0004]交叉引物恒溫擴增技術(CPA)是一種新穎的恒溫擴增技術，具有較高的特異性和靈敏度，因該方法在恒溫下就能發生反應，所以對設備的要求比較低，操作簡單，反應只需 60min ([2]Fang RD, Li X, Hu L, et al.Cross-priming amplification forrapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens[J].Journalof C linical Microbiology, 2009, 47(3):847-847 ； [3]Xu GL,Hu L,Zhong HY, etal.Cross priming amplification:mechanism and optimization for isothermal DNAamplification[J].Scientific Reports,2012，2:246.do1: 10.1038/srep00246)。較傳統的PCR技術具有高效、快速等優點，尤其適用在基層對副溶血性弧菌進行檢測。目前該方法結合膠體金核酸試紙條的檢測方法已被用在諸如沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌、結核分歧桿菌、惡性瘧疾、霍亂弧菌、志賀氏菌、瓜果類斑病菌的檢測([4]祁軍，左峰，劉國紅，劉紅梅，徐高連，張霞.交叉引物等溫擴增技術檢測沙門氏菌[J].食品研究開發，2013, 34 (2):67-70； [5]祁軍，于智睿，詹曦菁，黃吉城，李智慧.交叉引物等溫擴增技術在惡性瘧疾快速檢測中的應用[J].中國媒介生物學及控制雜志，2013，24(3):204-207)，尚未有用于檢測副溶血性弧菌的報道。
【發明內容】
[0005]本發明的第一目的是提供用于副溶血性弧菌檢測的特異性引物。
[0006]本發明的第二目的是提供副溶血性弧菌的檢測方法。[0007]所述用于副溶血性弧菌檢測的特異性引物是根據副溶血性弧菌種特異性基因tlh的保守區域所設計的一對外圍引物、一對交叉引物和一對特異性檢測探針；所述副溶血性弧菌種特異性基因tlh是編碼副溶血性弧菌不耐熱溶血毒素TLH的毒力基因，廣泛存在副溶血性弧菌中，且具有種特異性；
[0008]所述一對外圍引物為:
[0009]正向外圍引物VPOF: TGCGAAAGTGCTTGAGAT ；
[0010]反向外圍引物VPOR:GATGAGCGGTTGATGTCCo
[0011]所述一對交叉引物為:
[0012]正向交叉引物VPIF:TTCTGGCGCAGAAGTTAGGTTCATCAAGGCACAAGC ；
[0013]反向交叉引物VPIR:GTTCATCAAGGCACAAGCTTCTGGCGCAGAAGTTAG。
[0014]所述一對特異性檢測探針為:
[0015]正向特異性檢測探針VPDF:CAAAGCGCAAGGTTACAACATCA，3’端標記異硫氰酸熒光素(Fitc)；
[0016]反向特異性檢測探針VPDR:GAACAAGGCGTGAGTATCAAACAAC, 5 ’端標記生物素(Biotin)0
[0017]所述副溶血性弧菌的檢測方法，包括以下步驟: [0018]I)副溶血性弧菌模板DNA的提取
[0019]利用CTAB/NaCl法(參考微生物學實驗(第四版)主編沈萍陳向東)或者細菌基因組DNA提取試劑盒(購于TIANGEN廈門泰京生物技術有限公司)提取副溶血性弧菌的總DNA作為模板；
[0020]2)外圍引物的驗證
[0021]用一對外圍引物VP0F/VP0R對模板進行擴增，擴增后的產物進行質粒克隆得到所需的質粒，通過對質粒進行測序證明:外圍引物擴增的片段即為副溶血性弧菌tlh的保守區域核酸序列，說明該外圍引物合適，可用于后續交叉引物恒溫擴增法實驗；
[0022]3)交叉引物恒溫擴增反應體系的建立
[0023]20 μ L的恒溫反應體系包括:外圍引物0.1 μ mol/L、交叉引物0.4 μ mol/L、特異性檢測探針 0.3 μ mol/L, dNTPs0.4 μ mol/L, MgS046mmol/L, 10 X Thermopol buffer2 μ L, BstDNA Polymerase (U/ μ L) 8U, Betaine0.5mol/L, DNAl μ L ；
[0024]4)交叉引物恒溫擴增程序
[0025]將待反應PCR管放置于微量恒溫器中63°C恒溫擴增60min，得到擴增產物；
[0026]5)擴增產物的檢測
[0027]擴增產物通過商品化的一次性核酸檢測試紙條(3號)(購自杭州優思達生物技術有限公司)進行判讀，通過觀察試紙條檢測線和質控線的顏色變化來判斷反應是否發生；若結果為陽性，則樣本中含有檢測的核酸，試紙條出現兩條紅色條帶，一條位于質控區，一條位于檢測區；若結果是陰性，則只有質控區出現一條紅色條帶，檢測區沒有條帶。
[0028]與現有技術相比，本發明具有以下突出的優點和實用性:
[0029]①靈敏度高，本發明的靈敏度是普通PCR的10倍；
[0030]②特異性強，本發明只檢出副溶血性弧菌，對其他致病菌檢測結果均為陰性；
[0031]③快速檢測，與傳統的檢測方法相比，本發明將檢測時間縮短到1.5h，明顯提高了檢測效率；
[0032]④簡便實用，擴增產物通過一次性試紙條進行檢測，10~30min即可完成檢測結果的判讀，尤其適用在基層實用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1為交叉引物恒溫擴增產物電泳圖。在圖1中，各標記為，M:100bp laddermarker ；1:副溶血性弧菌CPA擴增產物；2:陰性對照。
[0034]圖2為交叉引物法擴增產物的核酸試紙條檢測結果圖。在圖2中，各標記為，1:副溶血性弧菌CPA擴增產物；2:陰性對照
[0035]圖3為交叉引物恒溫擴增檢測副溶血性弧菌特異性電泳圖。在圖3中，各標記為，M:1OObp ladder marker ；1:陰性對照；2:副溶血性弧菌；3:霍亂弧菌；4:溶藻弧菌；5:倉丨J傷弧菌；6:金黃色葡萄球菌；7:大腸桿菌；8:沙門氏菌。
[0036]圖4為交叉引物恒溫擴增結合核酸試紙條檢測副溶血性弧菌的特異性圖。在圖4中，各標記為，1:陰性對照；2:副溶血性弧囷；3:霍亂弧囷；4:溶操弧囷；5:創傷弧囷；6:金黃色葡萄球菌；7:大腸桿菌；8:沙門氏菌。
【具體實施方式】
[0037]以下實施例將結合附圖對本發明作進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。
[0038]實施例1引物的設計與合成
[0039]根據副溶血性弧菌不耐熱溶血毒素基因tlh的保守區域設計了兩對引物和一對特異性檢測探針，序列如下:
[0040]所述一對外圍引物為:
[0041 ]正向外圍引物 VPOF: TGCGAAAGTGCTTGAGAT ；
[0042]反向外圍引物VPOR: GATGAGCGGTTGATGTCC。
[0043]所述一對交叉引物為:
[0044]正向交叉引物VPIF:TTCTGGCGCAGAAGTTAGGTTCATCAAGGCACAAGC ；
[0045]反向交叉引物VPIR: GTTCATCAAGGCACAAGCTTCTGGCGCAGAAGTTAG。
[0046]所述一對特異性檢測探針為:
[0047]正向特異性檢測探針VPDF:CAAAGCGCAAGGTTACAACATCA，3’端標記異硫氰酸熒光素(Fitc)；
[0048]反向特異性檢測探針VPDR: GAACAAGGCGTGAGTATCAAACAAC, 5 ’端標記生物素(Biotin)0
[0049]實施例2CPA方法的建立
[0050]20 μ L的恒溫反應體系包括:外圍引物0.1 μ mol/L、交叉引物0.4 μ mol/L、特異性檢測探針 0.3 μ mol/L, dNTPs0.4 μ mol/L, MgS046mmol/L, 10 X Thermopol buffer2 μ L, BstDNA Polymerase (U/ μ L) 8U, Betaine0.5mol/L, DNAl μ L。
[0051]CPA反應程序:63°C恒溫擴增60min。
[0052]擴增產物的檢測:擴增結束后取8~10 μ L擴增產物滴加到核酸試紙條的加樣區。將試紙條放入含有100 μ L緩沖液的微孔板中。15~30min后即可通過試紙條的顯色進行判讀。
[0053]實施例3CPA-核酸試紙條法檢測特異性
[0054]分別對10株不同的副溶血性弧菌進行檢測，結果均為陽性。為了進一步驗證其特異性，分別選取霍亂弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為對照菌進行測試，結果顯示，對照菌結果均為陰性。證明本發明對副溶血性弧菌具有較好的特異性。
[0055]CPA-核酸試紙條檢測副溶血性弧菌的靈敏性。通過就平板菌落計數計算出純培養物的濃度并對其進行10倍梯度稀釋，稀釋后的培養物用細菌基因組提取試劑盒進行基因組的提取，將提取后的基因組取I μ L用于CPA反應檢測該方法的靈敏性。經檢測，本發明的最低檢測限為5.6Χ 102CFU/mL，其靈敏度是普通PCR的10倍。
【權利要求】
1.用于副溶血性弧菌檢測的特異性引物，其特征在于所述用于副溶血性弧菌檢測的特異性引物是根據副溶血性弧菌種特異性基因tlh的保守區域所設計的一對外圍引物、一對交叉引物和一對特異性檢測探針；所述副溶血性弧菌種特異性基因tlh是編碼副溶血性弧菌不耐熱溶血毒素TLH的毒力基因，廣泛存在副溶血性弧菌中，且具有種特異性； 所述一對外圍引物為: 正向外圍引物 VPOF: TGCGAAAGTGCTTGAGAT ； 反向外圍引物 VPOR:GATGAGCGGTTGATGTCC ； 所述一對交叉引物為: 正向交叉引物 VPIF:TTCTGGCGCAGAAGTTAGGTTCATCAAGGCACAAGC ； 反向交叉引物 VPIR:GTTCATCAAGGCACAAGCTTCTGGCGCAGAAGTTAG ； 所述一對特異性檢測探針為: 正向特異性檢測探針VPDF:CAAAGCGCAAGGTTACAACATCA，3’端標記異硫氰酸熒光素； 反向特異性檢測探針VPDR:GAACAAGGCGTGAGTATCAAACAAC，5’端標記生物素。
2.副溶血性弧菌的檢測方法，其特征在于包括以下步驟: O副溶血性弧菌模板DNA的提取 利用CTAB/NaCl法或細菌基因組DNA提取試劑盒提取副溶血性弧菌的總DNA作為模板； 2)外圍引物的驗證 用權利要求1所述一對外圍引物VP0F/VP0R對模板進行擴增，擴增后的產物進行質粒克隆得到所需的質粒，通過對質粒進行測序證明:外圍引物擴增的片段即為副溶血性弧菌tlh的保守區域核酸序列，說明該外圍引物合適，可用于后續交叉引物恒溫擴增法實驗； 3)交叉引物恒溫擴增反應體系的建立 .20 μ L的恒溫反應體系包括:外圍引物0.1 μ mol/L、交叉引物0.4 μ mol/L、特異性檢測探針 0.3 μ mol/L, dNTPs0.4 μ mol/L, MgS046mmol/L, 10 X Thermopol buffer2 μ L, Bst DNAPolymerase (U/ μ L)8U,Betaine0.5mol/L,DNAl μ L ;所述外圍引物、交叉引物、特異性檢測探針為權利要求1所述外圍引物、交叉引物、特異性檢測探針； 4)交叉引物恒溫擴增程序 將待反應PCR管放置于微量恒溫器中63°C恒溫擴增60min，得到擴增產物； 5)擴增產物的檢測 擴增產物通過商品化的一次性核酸檢測試紙條3號進行判讀，通過觀察試紙條檢測線和質控線的顏色變化來判斷反應是否發生；若結果為陽性，則樣本中含有檢測的核酸，試紙條出現兩條紅色條帶，一條位于質控區，一條位于檢測區；若結果是陰性，則只有質控區出現一條紅色條帶，檢測區沒有條帶。
【文檔編號】C12N15/11GK103667498SQ201310732988
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】劉靜雯, 徐苗苗 申請人:集美大學