一種胞外丙酮酸產量提高的基因工程菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種胞外丙酮酸產量提高的基因工程菌及其應用，在光滑球擬酵母(Torulopsis?glabrata)CCTCC?M202019中過量異源表達編碼抗逆性蛋白CutA的基因，所述編碼抗逆性蛋白CutA的基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明通過異源過量表達抗逆性蛋白CutA,提高了光滑球擬酵母對溫度的抗逆性，并提高了基因重組菌株生產丙酮酸過程中最適生產溫度，使得該基因重組菌株發酵液中丙酮酸含量，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】—種胞外丙酮酸產量提高的基因工程菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提高光滑球擬酵母產丙酮酸的方法，屬于代謝工程領域。
【背景技術】
[0002]丙酮酸(Pyruvic acid)，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不僅在生物能量代謝中具有十分重要的作用，而且是多種有用化合物的前體，它在化工、制藥和農用化學品等工業及科學研究中有著廣泛的用途。作為一種重要的化工產品，傳統化學法和生物發酵法生產丙酮酸都已實現工業化，傳統化學法生產丙酮酸大規模推廣受制于高昂的原材料成本和低生產率，而生物發酵法生產該有機酸過程中，由于生產過程中的復雜性，能高產丙酮酸的微生物細胞容易受到環境因素如金屬離子和溫度脅迫，這些因素都限制了細胞的正常生長和代謝，因此，如能提高微生物細胞對這些不利環境因素抗逆性對生物發酵法生產丙酮酸起重要作用。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題是提供一種胞外丙酮酸產量提高的基因工程菌，是在光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019中過量異源表達編碼抗逆性蛋白CutA的基因。
[0004]所述編碼抗逆性蛋白CutA的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2。
[0005]SEQ ID N0.2 序列如下:
[0006]ATGATCATCG TTTACACTAC TTTCCCAGAC TGGGAATCTG CTGAAAAGGT TGTTAAGACT 60
[0007]TTGTTGMGG MAGATTGAT CGCTTGTGCT AACTTGAGAG AACACAGAGC TTTCTACTGG 120
[0008]TGGGAAGGTA AGATCGAAGA AGACAAGGAA GTTGGTGCTA TCTTGAAGAC TAGAGAAGAC 180
[0009]TTGTGGGAAG MTTGMGGA MGAATCAAG GMTTGCACC CATACGACGT TCCAGCTATC 240
[0010]ATCAGAATCG ACGTTGACGA CGTTAACGAA GACTACTTGA AGTGGTTGAT CGAAGAAACT 300
[0011]AAGAAGTAAG310
[0012]本發明要要解決的另一個技術問題是提供兩種構建上述基因工程菌的方法，
[0013]方法I為:
[0014](1)獲得外源目的基因:對已知的掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列(SEQ ID N0.1)，進行優化獲得SEQ ID N0.2所示序列；
[0015]SEQ ID N0.1 序列如下:
[0016]ATGATAATAG TTTACACGAC TTTTCCGGAC TGGGAGAGTG CTGAGAAAGT TGTGAAAACT 60
[0017]CTTTTAMAG AGAGGTTGAT TGCATGCGCA AATTTAAGGG AGCACAGGGC CTTTTACTGG 120
[0018]TGGGAAGGTA AGATCGAGGA AGATAMGAA GTTGGAGCTA TCCTTAAAAC TAGGGAAGAT 180
[0019]CTGTGGGAAG MCTTMGGA MGGATAAAG GAGCTTCATC CTTACGATGT TCCGGCCATA 240
[0020]ATCAGGATTG ACGTTGATGA TGTTAACGAG GATTACCTCA AATGGTTAAT TGAAGAGACG 300
[0021]AAAAAATGAG310[0022](2)構建重組表達質粒:全化學合成步驟I)中的SEQ ID N0.2序列，并克隆至多拷貝表達載體PRS306TEF1中的Bam H1-Eco RI插入位點，獲得重組表達質粒pRS306TEFl-CutA ；[0023](3)獲得基因工程菌:利用電穿孔轉化方法將被分離純化的重組質粒pRS306TEFl-CutA 轉化 T.glabrata CCTCC M202019 Δ ura3，在 YNB 培養基平板中篩選原養型細胞，T.glabrata Ql。
[0024]方法2為:
[0025](1)獲得外源目的基因:對已知的掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列(SEQ ID N0.1)，進行優化獲得SEQ ID N0.2所示序列；
[0026](2)構建重組表達質粒:全化學合成步驟I)中的SEQ ID N0.2序列，并克隆至多拷貝表達載體PRS306TEF1中的Bam H1-Eco RI插入位點，獲得重組表達質粒pRS306TEFl_CutA ;化學合成釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)熱擊蛋白 HSP150編碼基因的啟動子序列，克隆至pRS306TEFl-CutA質粒上的Sac 1-Xho I插入位點，替換pRS306TEFl-CutA質粒上的組成型啟動子TEFl為溫度誘導型啟動子，并獲得pRS306HSP150-CutA 質粒；
[0027](3)獲得基因工程菌:利用電穿孔轉化方法將被分離純化的重組質粒pRS306HSP150-CutA 質粒轉化 T.glabrata CCTCC M202019 Δ ura3，在 YNB 培養基平板中篩選原養型細胞，獲得的基因工程菌命名為T.glabrata Q2。
[0028]本發明還提供一種以所述基因工程菌發酵生產丙酮酸的方法，將獲得的新鮮基因工程菌斜面培養物接種至含有25mL種子培養基的250mL三角搖瓶中，30°C、200rpmin，培養24小時；按10%(v/v)的接種量接入3L發酵罐中，發酵培養基裝液量為1.5L，發酵罐培養條件為通氣量4vvm，攪拌轉速400r/min，溫度30°C，pH值和溶氧通過自動流加泵流加濃度為8mol.L-1NaOH和2mol.L^1HCl濃度的溶液維持培養基pH控制在穩定范圍內。
[0029]與對照菌相比:33°C和36°C對異源表達CutA的重組菌株T.glabrata Ql都有具有促進作用，此時最大生物量分別是30°C條件下的112.4%和120.7% ;并且在36°C、200rpm條件下，所述的T.glabrata菌株Ql細胞外丙酮酸含量從56.8g.L—1上升至74.2g.L—1。
[0030]本發明的有益之處:本發明通過異源過量表達抗逆性蛋白CutA，提高了光滑球擬酵母對溫度的抗逆性，并提高了基因重組菌株生產丙酮酸過程中最適生產溫度，使得該基因重組菌株發酵液中丙酮酸含量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1CutA提高T.glabrata對溫度抗逆性。A:不同溫度條件對出發菌株T.glabrataC的影響，:30°C ;.:33°C ; A:36°C ; ?:39°C0B:不同溫度條件對重組菌株T.glabrataQl 的影響，.:30°C ;.:33°C ; ▲:36°C ; ?:39°C。
[0032]圖2溫度誘導調控異源CutA表達。
[0033]圖3高溫促進重組T.glabrata菌株的合成丙酮酸，:T.glabrata C;.:T.glabrata Ql0
【具體實施方式】[0034]材料與方法
[0035]YPD培養基(g.L-1):蛋白胨10，酵母浸膏5，葡萄糖20，固體培養基另加20g.L-1瓊脂。
[0036]YNB 培養基(g.L-1):葡萄糖 20，Yeast Nitrogen Basel.7，(NH4)2S045,用2mol.L-1NaOH調節pH至5.0,固體培養基另加20g.L-1瓊脂。
[0037]種子培養基(g.I/1):葡萄糖 20，蛋白胨 10，MgSO4.7H200.5g.?Λ KH2PO410 用稀鹽酸調pH至5.5，115°C維持15min滅菌。固體斜面另添加20g.L-1瓊脂粉。
[0038]發酵培養基(g.I/1):葡萄糖 100，NH4Cl7, KH2P045, MgSO4.7Η200.8，乙酸鈉 6，煙酸4 X ΙΟ'鹽酸硫胺素30 X Kr6，煙酸吡哆醇100 X 10-6，生物素10 X 10-6，核黃素50 X 10'培養基初始ΡΗ5.0。維生素液過濾除菌后加入。
[0039]光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)從中國典型培養物保藏中心CCTCC獲得，菌種編號為 CCTCC NO:M202019。
[0040]酮酸含量測定:將發酵液在12000g離心5min后，取上清液，用超純水稀釋50倍，HPLC檢測。細胞內酮酸含量測定:離心收集細胞，用0.9%生理鹽水洗滌，用IOmL0.1mol.L-1KH2PO4-K2HPO4, Immol.L_1EDTA,0.01mmol.L-1DTT ρΗ7.5 緩沖液懸浮細胞，加入石英砂研磨5min, 13000 Xg離心IOmin,去除沉淀,取5ml上清液過0.22 μ m濾膜,用于HPLC分析。
[0041] HPLC 條件:Aminex HPX-87H ion exchange column ;流動相:5mmol.L-1 硫酸溶(550 μ L濃硫酸定容到2L)，用0.22 μ m孔徑的微濾膜抽濾并脫氣；柱溫:35°C ;進樣量:10 μ L ;流速:0.6mL.mirT1。紫外檢測器檢測:波長210nm。
[0042]光滑球擬酵母轉化方法:將在Yro培養基上新鮮長出的T.glabrata CCTCCM202019 Δ ura3 (Zhou, J.ff., Dong, Z.Y., Liu, L.M., Du, G.C., Chen, J., 2009a.A reusablemethod for construction of non-marker large fragment deletion yeast auxotrophstrains:A practice in Torulopsis glabrata.J.Microbiol.Methods76, 70 - 74.)單菌落轉接至液體YPD培養基中，28C，200rpm,過夜培養。按10%接種量轉接至新鮮的液體YPD培養基中28°C，200rpm培養至0D_=1.2左右，離心收集細胞，于30°C用8mL100mmol I1LiAc, IOmmol.L^1DTT, 0.6mol.L-1 sorbitolIOmmol.L^1Tris-HCL,pH=7.5緩沖液處理8X IO8細胞。離心收集細胞，用5mL預冷的Imol *L_1的sorbitol洗漆細胞三次，并用Imol *L_1的sorbitol懸浮細胞至101°細胞加入I μ g預先純化重組表達質粒pRS306TEFl-CutA至細胞懸浮液中，置于冰上溫孕5分鐘，將該混合物轉移至預冷的0.2cm電轉杯中，電擊，電擊條件為
2.5KV，25 μ F，200 Ω，立即加入ImL預冷的Imol.L^sorbitol,室溫靜置I小時，將0.2mL電擊產物涂布于含有YNB培養基的選擇平板中，28°C培養96-144小時。以原養型細胞的基因組為模板，利用驗證引物對Pl/P2(表1)，利用PCR對外源基因的表達驗證。將成功表達外源基因的光滑球擬酵母命名為T.glabrata Ql，轉化帶有不含外源基因的pRS306TEFl的對照菌株命名為T.glabrata C。
[0043] 全化學合成釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)熱擊蛋白HSP150 (NCBI登錄號:YJL159W)編碼基因的啟動子序列，克隆至pRS306TEFl-CutA質粒上的Sac 1-Xho I插入位點，替換pRS306TEFl-CutA質粒上的組成型啟動子TEFl為溫度誘導型啟動子，并獲得pRS306HSP150-CutA 質粒，按上述電穿孔方法轉化 T.glabrata CCTCC M202019 Δ ura3 菌株，在含有YNB培養基的選擇平板中選擇原養型細胞,并以原養型細胞的基因組為模板,利用驗證引物對Pl/P2(表1)，利用PCR對外源基因的表達驗證。將成功表達外源基因的光滑球擬酵母命名為T.glabrata Q2。
[0044]
^C1TTCCCAG ACTGGG A ATCTG
[0045]
P2TTAGTGGTGGTGGTGGTGG
[0046]表1
[0047]實施例1不同溫度條件對重組菌株T.glabrata Ql的影響。
[0048]將新鮮培養的T.glabrata菌株Ql的單`菌落細胞與對照菌株T.glabrata C的單菌落細胞分別接種至含有25mL YPD培養的250mL三角瓶中，分別放置于30°C、33°C、36°C和39°C，200rpm條件下培養，每4h測定細胞生長情況(圖1)。
[0049]如圖1所示，在30°C條件下，與對照菌株相比，異源表達CutA并未對菌株生產造成明顯差異，提高培養溫度至33°C會加快菌株T.glabrata C生長，但是當溫度提高至36°C和39°C時，菌株T.glabrata C的生長受到明顯的抑制作用，此時最大生物量分別是30°C培養條件下的，87.4%和63.6% ;然而提高培養溫度至33°C和36°C對異源表達CutA的重組菌株T.glabrata Ql的生長都有具有促進作用，此時最大生物量分別是30°C條件下的112.4%和120.7%，然而，在39°C條件下該促進作用才消失，菌體生長受到抑制，此時菌株T.glabrataQl的最大生物量分別是`30°C培養條件下的96.2%。
[0050]實施例2溫度誘導調控異源CutA表達
[0051]為進一步驗證過量表達CutA能提高T.glabrata菌株對溫度的抗逆性,將新鮮培養的T.glabrata菌株Q2的單菌落細胞與對照菌株T.glabrata C的單菌落細胞分別接種至含有25mLYPD培養的250mL三角瓶中，放置于30°C，200rpm條件下培養8h后，然后放置在37°C，誘導CutA酶表達，200rpm條件下繼續培養16h，觀察生長情況(圖2)。
[0052]在30°C條件下，T.glabrata Q2與對照菌株T.glabrata C的生長沒有明顯差異，但變換培養溫度后，高溫誘導CutA蛋白的表達，對環境溫度變化不敏感，在此條件下，與T.glabrataQl類似，高溫加快細胞生長，對照菌株C在此溫度下生長受到抑制。
[0053]實施例3高溫促進重組T.glabrata菌株的合成丙酮酸。
[0054]將獲得到T.glabrata菌株Ql分布至固體斜面種子培養基中,將新鮮的斜面培養物接種至含有50mL種子培養基的500mL三角瓶中，溫度為30°C，轉速200rpmin，培養24小時。按10%的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，36°C、200rpm條件下培養72小時，對照菌株T.glabrata C發酵培養條件為30°C、200rpm條件下培養60小時。與對照菌相比:所述的T.glabrata菌株Ql細胞外丙酮酸含量從56.8g.L-1上升至74.2g.L—1 (圖3)。
[0055]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所 界定的為準。
【權利要求】
1.一種胞外丙酮酸產量提高的基因工程菌，其特征在于，在光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)CCTCC M202019中過量異源表達編碼抗逆性蛋白CutA的基因。
2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述編碼抗逆性蛋白CutA的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.構建權利要求1或2所述的基因工程菌的具體包括以下步驟: (1)獲得外源目的基因:對已知的掘越氏熱球菌(Pyrococcushorikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列(SEQ ID N0.1 )，進行優化獲得SEQ ID N0.2所示序列； (2)構建重組表達質粒:全化學合成步驟I)中的SEQID N0.2，并克隆至多拷貝表達載體pRS306TEFl中的Bam H1-Eco RI插入位點，獲得重組表達質粒pRS306TEFl_CutA ； (3)獲得基因工程菌:利用電穿孔轉化方法將被分離純化的重組質粒pRS306TEFl-CutA 轉化 T.glabrata CCTCC M202019 Δ ura3，在 YNB 培養基平板中篩選原養型細胞。
4.權利要求1或2所述基因工程菌的方法，具體包括以下步驟: (1)獲得外源目的基因:對已知的掘越氏熱球菌(Pyrococcushorikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列進行優化獲得SEQ ID N0.2所示序列； (2)構建重組表達質粒:全化學合成步驟I)中的SEQID N0.2所示序列，并克隆至多拷貝表達載體PRS306TEF1中的Bam H1-Eco RI插入位點，并獲得重組表達質粒pRS306TEFl_CutA ;化學合成釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)熱擊蛋白 HSP150編碼基因的啟動子序列，克隆至pRS306TEFl-CutA質粒上的Sac 1-Xho I插入位點，替換pRS306TEFl-CutA質粒上的組成型啟動子TEFl為溫度誘導型啟動子，并獲得pRS306HSP150-CutA 質粒； (3)獲得基因工程菌:利用電穿孔轉化方法將被分離純化的重組質粒pRS306HSP150-CutA 質粒轉化 T.glabrata CCTCC M202019 Δ ura3，在 YNB 培養基平板中篩選原養型細胞。
5.應用權利要求1或2所述的基因工程菌發酵生產丙酮酸的方法，其特征在于，將所得基因工程菌分布至含有種子培養基的斜面培養基上，并將新鮮培養的斜面培養物接種至含有25mL種子培養基的250mL三角搖瓶中，28°C、200rpmin，培養24小時；按10%(v/v)的接種量接入3L發酵罐中，發酵培養基裝液量為1.5L，發酵罐培養條件為通氣量4vvm，攪拌轉速400r/min，溫度30°C，pH值和溶氧通過自動流加泵流加濃度為8mol.!/1NaOH和2mol -L^iHCI濃度的溶液維持培養基PH控制在穩定范圍內。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述種子培養基成分為:葡萄糖蛋白胨 IOg.ΙΛ MgSO4.7Η200.5g.?Λ KH2PO4Ig.L'i周 pH 為 5.5。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基成分為:葡萄糖100g.L-1, NH4Cl7g.L-1, KH2P045g.1/1, MgSO4.7Η200.8g.L-1,乙酸鈉 6g.L-1,煙酸 4m g.L-1,鹽酸硫胺素30 μ g.L4,煙酸批卩多醇100 μ g ?L—1,生物素10 μ g.L4,核黃素50 μ g.L'培養基初始PH5.0。維生素液過濾除菌后加入。
【文檔編號】C12P7/50GK103710274SQ201310722490
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】陳堅, 郭洪偉, 周景文, 堵國成 申請人:江南大學