一套高效銅抗性標記釀酒酵母表達系統及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一套高效銅抗性標記釀酒酵母表達系統及其應用，包括一種銅離子敏感型釀酒酵母W303-1A?cup1Δ及含有CUP1銅抗性篩選標記的酵母表達載體，本發明通過基因敲除釀酒酵母銅抗性基因cup1，獲得一株銅離子敏感型釀酒酵母W303-1A?cup1Δ，其對Cu2+的最低抑制濃度（SC培養基上）由1.2mM降為0.08mM；以pYX212載體為基本構架，以銅離子敏感型釀酒酵母為宿主菌，構建了以CUP1作為銅抗性標記的pYX212M釀酒酵母高效表達系統，并成功表達了綠色熒光蛋白基因（gfp），可用于釀酒酵母高效表達外源蛋白，拓寬了釀酒酵母的使用領域。
【專利說明】一套高效銅抗性標記釀酒酵母表達系統及其應用發明領域
[0001]本發明涉及一種釀酒酵母表達系統及其應用，特別是一種高效銅抗性標記釀酒酵母表達系統的構建方法與應用。
【背景技術】
[0002]釀酒酵母是一種極為重要的工業微生物，常被用于生產多種物質如酒精、酶、谷胱甘肽、氨基酸等行業，它被美國食品與藥品管理局認證為安全的微生物，廣泛用于食品、制藥等行業。釀酒酵母同時也是實驗室研究中常用的真核模式生物，它具有許多內在的優勢:⑴易于培養和操作、增殖快。⑵能夠穩定的在單倍體和二倍體的狀態下生長，并且可以控制單倍體與二倍體的相互轉化。⑶有很多適合真核生物基因表達的穿梭表達載體。⑷基因組測序已經完成。篩選標記是釀酒酵母表達體系的重要組成部分，特定異源抗性基因的抗生素(如G418、Zeocin、腐草霉素等)可以作為釀酒酵母遺傳操作的選擇壓力，進行有效篩選轉化，但這些抗性因子不僅成本較高，而且對安全具有潛在危害性。
[0003]金屬硫蛋白(Metallothionein,簡稱MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，其主要功能是參與體內微量元素的平衡及重金屬的解毒作用，同時具有很強的清除氧自由基的能力。釀酒酵母的銅金屬硫蛋白基因(cupl)決定其銅離子抗性，位于8號染色體上的CUPl基因座中，該基因的開放閱讀框由183個堿基組成，編碼含有一條61個氨基酸殘基的肽鏈-金屬硫蛋白(Cu-ΜΤ),屬于第II型金屬硫蛋白，具有與動物金屬硫蛋白相似的功能和性質對銅有特別親和力。然而，目前對釀酒酵母銅抗性的研究多集中在生物修復功能應用方面與及其分子機理研究方面，而以酵母銅抗性作為篩選標記并構建其相應表達體系的相關報道較少 ，以釀酒酵母銅抗性作為篩選標記不僅廉價、靈敏度高，而且可以解決抗藥性標記基因帶來的安全性問題，是一種理想的抗性篩選標記。本專利旨在利用釀酒酵母cupl基因作為篩選標記，構建一種廉價、安全、高效的銅抗性釀酒酵母表達體系，并應用于外源蛋白的表達，豐富酵母的表達系統，拓寬了釀酒酵母的使用領域。
【發明內容】
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[0004]本發明公開了一種高效銅抗性標記釀酒酵母表達系統，一種銅離子敏感型釀酒酵母W303-1A cupl Δ及含有CUPl銅抗性篩選標記的酵母表達載體，所述釀酒酵母W303-1Acupl Δ的構建方法為:
[0005]I)以質粒pFA6a_His3Mx6為模板，設計引物，PCR擴增出敲除片段Pl-his_P2 ；
[0006]2)將步驟I)獲得的敲除片段醋酸鋰轉化進入野生型釀酒酵母W303-1A，得到銅離子敏感型釀酒酵母W303-1A cupl Λ ；
[0007]所述含有CUPl銅抗性篩選標記的構建方法為:
[0008]3)以野生釀酒酵母為模版，設計引物，擴增出cupl基因；
[0009]4)將步驟3)獲得的cupl基因連接到酵母表達載體上。
[0010]所述表達載體為pYX212 ;所述含有CUPl銅抗性篩選標記的酵母表達載體為PYX212M。
[0011]本發明還公開了一種上述表達系統的應用，具體為將表達載體PYX212M承載的基因轉化釀酒酵母W303-1A cupl Λ，選擇0.3mMCu2+的SC培養基作為篩選培養基，得到了含有以CUPl為高效篩選標記的PYX212M表達載體的酵母轉化子。
[0012]具體的采用上述表達系統表達了綠色熒光蛋白基因，將gfp基因插入表達載體PYX212M，采用醋酸鋰轉化釀酒酵母W303-1A cupl Λ，可高效表達綠色熒光蛋白。
[0013]本發明提供了一種聞效的釀酒酵母聞效表達系統，并成功表達了綠色突光蛋白基因(gfp)，拓寬了釀酒釀酒酵母比較少的表達途徑，可以實現無外源篩選標記使用，具有更好生物安全性。
【專利附圖】
【附圖說明】:[0014]圖1表達載體pYX212M的質粒圖譜
[0015]圖2含有GFP基因重組表達載體的質粒圖譜
[0016]圖3不同Cu2+濃度下野生型釀酒酵母(A)、釀酒酵母cup Λ (B)菌落形態
[0017]圖4不同Cu2+濃度下釀酒酵母cupl Δ (A)、轉入ρΥΧ212的釀酒酵母cupl Δ (B)、轉入pYX212M的釀酒酵母cupl Δ菌落形態
[0018]圖5轉化銅離子敏感型釀酒酵母W303-1A cupl Δ中綠色熒光蛋白的檢測
[0019]具體實施:
[0020]實施實例1:構建銅離子敏感型釀酒酵母W303-1A cuplA (參見附圖3)
[0021]利用PCR-mediated Technique 方法(Longtine, 1998, yeast, 14:953 - 961),以pFA6a-His3Mx61(WACH ET AL.:' New heterologous modules for classical or PCR-basedgene disruptions in Saccharomyces cerevisiae’YEAST vol.10, 1994, pagesl793-1808)為模版，設計引物 P1、P2 (P15 ‘-TCATTGAAAGTGACGGGGAT AACAGCATTTTACCGGATCCCCGGGTTAATTAA-3’，P2:5^-TTTGAGCTGTCTGTTAA GCTTCCAGATAAAAGATTTCAAGTTATTCCATTGAATTCGAGCTCGTTTAAAC-3’)，PCR擴增出敲除片段Pl-his_P2 (PCR條件為:94°C預變性4min ;變性lmin，52°C退火40s，72 °C延伸120s，循環40次；72°C保溫IOmin)。將PCR產物醋酸鋰轉化釀酒酵母W303-1A感受態細胞，提取轉化子的DNA作為模版，以P3、P4(P3:5‘-CGAAGAAACCCACGAAGATGACATG-3 ’，P4:5 ‘ -GAAACCTCTCAGACAATCAACATGC-3 ’)為引物進行 PCR 擴增。由于轉化子中的cupl被敲除片段Pl-his-P2替換，P3位于cupl基因的上游，P4位于his基因內部，野生菌株是組氨酸缺陷性，因此，經瓊脂糖凝膠電泳轉化子能PCR得到1496bp的條帶，野生型沒有條帶，表明釀酒酵母的cupl基因已經被敲除，即為S.cerevisiae W303-1A cupl Δ。
[0022]S.cerevisiae W303-1A cupl Δ獲得的方法不限與上述交代的方法，本領域的普通技術人員按照本發明的設計思路，可采用其它方法獲得S.cerevisiae W303-1A cupl Δ。將此銅離子敏感型釀酒酵母在SC培養基中預培養后，按?ο—1，?ο-2, ?ο-3,10_4進行稀釋，然后取4μ L點種至含有不同銅離子濃度下的SC完全培養基上，結果表明，該菌株在
0.08mmol/LCu2+停止生長,而野生型的釀酒酵母則生長良好,表明S.cerevisiae W303-1Acupl Δ銅離子的抑制濃度明顯降低，其對銅離子抗性的靈敏度大大提高。
[0023]實施實例2:構建以CUPl作為高效銅抗性篩選標記的釀酒酵母表達系統(參見附圖1)[0024]以釀酒酵母基因為模板以P5:5 ‘-GGGGTACCTAAGCCGATCCCATTACCGACA-3’，P6:5GGGGTACCGAGATCTTCTAGCGAGCTTGT-3’為引物進行 PCR 反應。PCR 條件為:94°C預變性 4min ；變性lmin，61°C退火40s，72°C延伸120s，循環30次；72°C保溫lOmin。將將純化后的PCR產物與質粒PMD18T連接，測序正確后，將pMD18T-Cup和pYX212同時用KpnI進行單酶切，割膠回收。將酶切后的載體與目的基因片段用T4DNA連接酶16°C連接過夜，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，涂布在含有氨芐青霉素的LA平板上。提取陽性克隆的質粒DNA，瓊脂糖電泳驗證，單酶切驗證，得到PYX212M。
[0025]pYX212M經醋酸鋰轉化分別導入到銅離子敏感型釀酒酵母W303-1A cupl Δ，選擇
0.3mM Cu2+的SC培養基作為篩選培養基，挑取轉化子，酵母細胞培養至對數生長期OD=L 2，按10' 1O-2, 1O-3,10_4進行稀釋，然后取4 μ L點種至含有不同銅離子濃度下的SC完全培養基上，30°C生長兩天(參見附圖4)。
[0026]實施實例3:利用以CUPl為高效銅抗性篩選標記的釀酒酵母表達系統表達gfp基因
[0027]以實驗室保存的pCAMBIA1302 為模版，以 P7:5‘-CCGGAATTCATGGTAGATCTGATGACTAG-3’，P8:5 ‘-CCCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAG-3’為引物，或采用化學全合成方法獲得gfp基因，將gfp基因插入表達 載體中得到PYX212MGFP (參見附圖2)，醋酸鋰轉化進入銅離子敏感型釀酒酵母W303-1A cupl Λ，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。
【權利要求】
1.一套高效銅抗性標記釀酒酵母表達系統，其特征在于包括一種銅離子敏感型釀酒酵母W303-lAcupl及含有CUPl銅抗性篩選標記的酵母表達載體，所述釀酒酵母W303_lAcupl的構建方法為: 以質粒pFA6a-His3Mx6為模板，設計引物，PCR擴增出敲除片段Pl_his_P2 ； 將步驟I)獲得的敲除片段醋酸鋰轉化進入野生型釀酒酵母W303-1A，得到銅離子敏感型釀酒酵母W303-lAcupl ； 所述含有CUPl銅抗性篩選標記的構建方法為: 以野生釀酒酵母為模版，設計引物，擴增出cupl基因； 將步驟3)獲得的cupl基因連接到酵母表達載體上。
2.權利要求1所述的表達系統，其特征在于所述表達載體為PYX212;所述含有CUPl銅抗性篩選標記的酵母表達載體為PYX212M。
3.權利要求1所述表達系統的應用，其特征在于將表達載體PYX212M承載的基因轉化釀酒酵母W303-lAcupl，選擇0.3mMCu2+的SC培養基作為篩選培養基，得到了含有以CUPl為高效篩選標記的PYX212M表達載體的酵母轉化子。
4.一種表達系統表達綠色熒光蛋白基因(gfp)的方法，其特征在于，將gfp基因插入表達載體pYX212Μ，采用醋酸鋰轉化釀酒酵母W303-lAcup I，可高效表達綠色熒光蛋白。
5.一種釀酒酵母表達表達異源蛋白的方法，其特征在于，將異源蛋白基因插入表達載體pYX212Μ，采用醋酸鋰轉化釀酒酵母W303-lAcup I，可高效表達綠色熒光蛋白。
【文檔編號】C12N15/81GK103695456SQ201310722485
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】諸葛斌, 盛冠一, 宗紅, 陸信曜, 方慧英, 諸葛健 申請人:江南大學