玫煙色棒束孢scau-ifcf02菌株液體發酵環境條件優化工藝的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種玫煙色棒束孢SCAU-IFCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝。本發明針對所述菌株的特點確定影響發酵效果的關鍵單因素，在單因素實驗基礎上，建立了產孢量與培養溫度、培養液初始pH值以及搖床轉速之間的特定二次回歸數學模型。各因素對產孢量的作用大小依次為：培養液初始pH值＞搖床轉速＞培養溫度；經過分析總結出玫煙色棒束孢SCAU-IFCF02菌株液體發酵的最佳環境條件為：培養溫度24℃、培養液初始pH值6、搖床轉速170rpm，在此條件下該菌株產孢量可達3.1568×108個孢子/mL。本發明采用二次通用旋轉回歸設計，基于本發明可以保證所述菌株液體發酵中，優化試驗次數少、周期短、精度高、綜合性好、系統性強、信息量大，并有效消除了各回歸系數之間的相關性。
【專利說明】玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工
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【技術領域】
[0001]本發明屬于無公害微生物農藥液體發酵工藝領域。更具體地，涉及一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝。
【背景技術】
[0002]玫煙色棒束孢Usaria fumosorosea)是一種重要的蟲生真菌，屬半知菌亞門{Deuteromycotina)、絲抱綱{Hyphomycetes、、絲抱目(Moniliales、、叢梗抱科(#o/?i7iaceai?)、棒束孢屬(Jsaria)。其地理分布廣泛，寄主多樣，已記載的有25個不同科的昆蟲，包括小菜蛾、麥雙尾蚜和煙粉虱等一些重要農業害蟲，是生物防治中極具開發應用潛力的種類。玫煙色棒束孢的致病力強，對人畜作物及環境安全，是研究和應用最廣的一類微生物殺蟲劑之一。
[0003]玫煙色棒束孢(Jsaria /i/fflosoriosea)在發酵生產過程中,環境條件是影響產孢量的重要因素之一。例如一定的溫度、濕度、PH值和光照等。此前的研究表明，玫煙色棒束孢的菌絲生長適溫為8~32°C，最適溫為24~28°C，高溫(30~40°C)比低溫(6~11°C)對生長的影響大，孢子萌發所需溫度一般比菌絲生長所需溫度范圍更窄。Hall等將玫煙色棒束孢在25 °C條件下，進行光照培養4 d后，再轉入黑暗中再培養4 d，產孢量比未經光照處理的菌株高。陳宜濤等研究表明，玫煙色棒束孢在PH 3~10的范圍內均能生長，但中性偏微酸(pH5~7)的環境比偏酸性(pH3~4)或堿性(pH8~10)環境更適于其生長，并確定其液相發酵生產的最適PH值為5~7。吳偉等研究表明，通氣條件對玫煙色棒束孢培養形狀和產孢影響很大。但是這些研`究成果僅僅是單一因素的研究，根據已有的發酵條件，玫煙色棒束孢的產孢量仍然很低，且獲得的均是分生孢子。目前用于商品化的真菌制劑大部分是以分生孢子為原料制成，因為芽生孢子在干燥、貯存及在田間應用環境過程中均不穩定，容易受到外界不利條件的影響，嚴重影響了玫煙色棒束孢相關生物制劑的生產，大大制約了玫煙色棒束孢菌在防治農業害蟲中的推廣應用。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是克服現有玫煙色棒束孢菌液體發酵工藝的技術不足，提供一種能夠快速、精確的玫煙色棒束孢菌液體發酵環境條件優化工藝及其確定方法。
[0005]本發明的目的是提供一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝。
[0006]本發明另一目的是提供所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝的確定方法。
[0007]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
本發明提供了一種玫煙色棒束抱fumosorosea (Wize) Brown & Smith)菌株SCAU-1FCF02液體發酵環境條件優化工藝的篩選方法，所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株于2013年11月I日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013526，保藏地址為中國武漢市武漢大學；
所述確定方法為在針對所述菌株的特點確定影響發酵效果的關鍵單因素；根據所確定的關鍵單因素進行篩選分析，結合二次通用旋轉回歸組合設計方法，以培養溫度、初始PH值和搖床轉速為3個試驗因子，以各單因素篩選的最佳值為中心點，以產孢量為測定指標，設計3因素5水平的二次通用旋轉組合試驗，建立所述菌株的產孢量與培養溫度、培養液初始PH值以及搖床轉速之間的二次回歸數學模型；根據所得的二次回歸數學模型總結出玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵的環境條件優化工藝。
[0008]本發明還提供了一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝，發酵的各環境條件為培養溫度24°C、培養液初始pH值6、搖床轉速170 rpm。
[0009]根據此工藝進行發酵，玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的產孢量高達3.1568 X IO8個孢子/mL。
[0010]上述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝，具體的發酵步驟如下:
51.制備玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液；
52.以上述孢子懸浮液為種子液，按照5%體積比的接種量，將玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液接種到發酵培養液，在培養溫度24°C、搖床轉速170 rpm的條件下進行發酵培養。
[0011]其中，步驟SI所述孢子懸浮液的制備方法為:
511.取玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，在無菌條件下，用接菌環取一環接種于PDA平板進行活化，于25°C、光照(14 L:10D)恒溫培養箱中培養,最佳培養時間為15d ；
512.待菌絲長滿培養皿后，加入20mL含有0.03%吐溫-80的無菌水，用接種針輕刮真菌的菌絲及孢子，將菌液倒入燒杯中，用磁力攪拌器攪拌30 min ；
513.待孢子完全分散后，用雙層醫用紗布過濾菌液，棄去雜質和培養基殘物，獲得分生孢子懸浮液；
514.用血球計數器計數孢子懸浮液的孢子濃度，孢子濃度可用含有0.03%吐溫-80的無菌水調整。
[0012]S2所述發酵培養為密閉發酵時，發酵液與發酵空間的體積比為3:10。
[0013]如250mL的三角瓶進行發酵時，裝樣量為75mL。
[0014]S2所述的發酵培養液配方為:葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L，水定容，pH值為6，滅菌備用。
[0015]S3所述發酵培養的時間為5~8天。
[0016]更優選地，S3所述發酵培養的時間為6天。
[0017]本發明具有以下有益效果:
本專利發明人分離得到的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株對小菜蛾具有非常好的防治效果，是國內外所報道的玫煙色棒束孢菌株中致死速度最快的菌株，也是開發防治小菜蛾真菌制劑的優良候選菌株。因此，以玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的常見侵染體分生孢子為活性成分，制備成各種生物制劑農藥，能夠為玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的產業化應用奠定基礎，為該菌株的田間應用提供理論指導，具有良好的應用前景。但是同樣地，目前玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的發酵存在產孢量低的問題，本領域技術人員公識，培養溫度、初始PH值和搖床轉速等等因素并不是單獨影響真菌的產孢量，往往幾個因素之間是相互影響、相互制衡的，對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的發酵環境條件的優化仍然是一個復雜龐大的課題。另外，目前用于商品化的真菌制劑大部分是以分生孢子為原料制成，但是對靶標害蟲有致病力的侵染體包括菌絲、分生孢子、氣生分生孢子和芽生孢子等。其中，氣生分生孢子能夠較好地抵抗不利條件和環境的影響，更適合做害蟲生物防治的的理想原料。本發明發酵優化工藝能夠使菌株在較短時間內達產孢高峰，收獲其氣生分生孢子，進而縮短工藝時間，為制劑提供原料。
[0018]本發明人首次將二次通用旋轉回歸組合設計應用于玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的發酵環境條件優化工藝的確定，結合所述菌株的發酵特點和單因素實驗，總結得到二次通用旋轉回歸方程，進一步發揮二次通用旋轉回歸組合設計方法在優化菌株發酵工藝方面的應用，既能分析各處理因子的影響，又能建立定量的數學模型，獲得試驗次數少、周期短、精度高、綜合性好、系統性強、信息量大等優點，并消除了回歸系數之間的相關性，取得了非常好的效果。
本發明建立了產孢量與培養溫度、培養液初始PH值以及搖床轉速之間的二次回歸數學模型，總結了各環境因素對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株產孢量的作用大小依次為:培養液初始卩!1值>搖床轉速> 培養溫度，且其中培養液初始pH值為正效應，培養溫度和搖床轉速為負效應，隨著培養溫度、初始PH值與搖床轉速的不斷增加，玫煙色棒束孢產孢量表現出先增后減的趨勢，表明培養溫度、初始PH值與搖床轉速存在一個最適的提取范圍。
[0019]根據本發明建立的產孢量與培養溫度、培養液初始pH值以及搖床轉速之間的二次回歸數學模型，能夠非常方便的分析出玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵的最佳環境條件為:培養溫度24°C、培養液初始pH值6、搖床轉速170 rpm，在此條件下該菌株產孢量最高可達3.1568 X IO8個孢子/mL。
另外，本發明采用二次通用旋轉組合設計對本菌株液體發酵工藝條件進行優化，與目前傳統的產用的單因素試驗和正交試驗相`比較，它既能分析各處理因子對發酵的影響和各處理因子之間的相互作用，又能建立定量的數學模型。顯示出在一定的搖床轉速(X3)下，產孢量隨著溫度的增加而增加，當達到最大值后，溫度(X1)的增加會使產孢量下降，尤其是在較低或者較高搖床轉速的條件下，過低或者過高的溫度(X1)均對產孢表現不利影響，且高溫條件下更明顯；同理，在較低或較高的溫度(X1)下，較低或者較高的搖床轉速(X3)均對產孢表現不利影響，可能是因為搖床轉速太低，溶氧量不足，搖床轉速過高，容易造成菌絲的機械損傷，進而影響產孢。
[0020]本發明采用二次通用旋轉組合設計對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵工藝條件進行優化，與目前傳統的常用的單因素試驗和正交試驗相比較，它既能分析各處理因子的影響，又能建立定量的數學模型，屬于更高級的試驗設計技術，具有試驗次數少、周期短、精度高、綜合性好、系統性強、信息量大等優點，并消除了回歸系數之間的相關性。從所建立的回歸方程的偏回歸系數絕對值的大小可以判斷各因子的重要程度，系數的正負表示各因子效應作用的方向，本試驗得出的回歸方程可以非常好地應用于玫煙色棒束孢液體發酵工藝的確定，具有很好的實踐指導應用價值。
[0021]本發明獲得的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵的最佳環境條件工藝為培養溫度24°C、培養液初始pH值6、搖床轉速170 rpm,在此條件下該菌株產孢量最高可達
3.1568X IO8個孢子/mL，為該菌株的進一步開發利用和規模化生產提供了理論依據。
[0022]通過所述工藝發酵獲得的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的分生孢子懸浮液的對小菜蛾具有良好的控制能力，是一種理想的防治十字花科蔬菜小菜蛾的無公害農藥，并且具有高效、低毒、低殘留，與環境相容性好，效果更為穩定，是替代高殘留農藥的新型生物農藥，可以很好的應用于該菌株商品制劑的生產。另外，通過本發明優化工藝獲得的分生孢子和芽生孢子可作為進一步固體發酵擴大培養的種子，為液固雙相發酵工藝的探索提供理論支撐，從而進一步縮短發酵工藝流程和擴大工藝生產量。對于我國開發無公害蔬菜，維護生態環境，實現可持續農業具有重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為培養溫度對菌絲生物量和產孢量的影響曲線圖。
[0024]圖2為初始pH值對菌絲生物量和產孢量的影響曲線圖。
[0025]圖3為搖床轉速對菌絲生物量和產孢量的影響曲線圖。
[0026]圖4為各單因子效應曲線，X1為培養溫度，X2為培養液初始pH值，X3為搖床轉速。
[0027]圖5為培養溫度(X1)與搖床轉速(X3)交互作用圖，圖中，當溫度和搖床轉速均在1、2、3或4所示區域內，產孢量分別為70~100、100~200、200~300或300~400百萬孢子/mL。
【具體實施方式】
[0028]以下結合附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，`本發明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規試劑、方法和設備。
[0029]以下實例中涉及的玫煙色棒束孢具體為玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，于2013年11月I日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013526，保藏地址為中國武漢市武漢大學。
[0030]實施例中所用的含有0.03%吐溫-80的無菌水，所述的0.03%指的是體積比。
[0031]實施例1玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株孢子懸浮液的制備 玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液的制備方法如下:
51.取玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，在無菌條件下，用接菌環取一環接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)平板進行活化，于25°C、光照(14L:10D)恒溫培養箱中培養15 d ；
52.待菌絲長滿培養皿后，加入20mL含有0.03%吐溫-80的無菌水，用接種針輕刮真菌的菌絲及孢子，將菌液倒入燒杯中，用磁力攪拌器攪拌30 min ；
53.待孢子完全分散后，用雙層醫用紗布過濾菌液，棄去雜質和培養基殘物，獲得分生孢子懸浮液；
54.用血球計數器計數孢子懸浮液的孢子濃度，孢子濃度可用含有0.03%吐溫-80的無菌水調整。
[0032]用含有0.03%吐溫-80的無菌水配成濃度為I X IO6孢子/mL的孢子懸浮液，供以下實施例使用。[0033]實施例2培養溫度對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株菌絲生物量和產孢量的影響
1、試驗設置
(O以實施例1制備的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液為種子液進行發酵。發酵培養液成分為葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L。裝樣量75mL/250mL，玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02 菌株接種量 5% (V/V)。
[0034](2)搖床培養過程中，遵循單一因子變量原則。初始pH值為培養液的自然pH值，搖床轉速為150 rpm ο溫度條件設置為19°C、22°C、25°C、28°C和31°C，測定不同培養溫度對菌絲生物量和產孢量的影響，搖床培養6 d。每隔24 h進行菌絲生物量及產孢量的測定，每個處理重復5次，根據結果獲得最佳產孢培養溫度。
[0035]2、結果顯示，不同培養溫度對玫煙色棒束孢液體發酵過程中菌絲生物量和產孢量的影響如附圖1所示，在5種不同的培養溫度條件下，本菌株菌絲生物量和產孢量均表現出顯著的差異(P < 0.05)，隨著培養溫度的升高，菌絲生物量和產孢量均表現出先上升后下降的趨勢，整體趨勢大致相同。在25°C時產孢量達最大值2.9230 X IO8孢子/mL，適溫范圍大致為25~28°C ;而在28°C時菌絲生物量達到最大值23.17mg/mL，適溫范圍大致為25~31°C。由此可以看出，產孢量和菌絲生物量并非同一溫度條件下達最大值，產孢量的最佳溫度較菌絲生物量的最佳溫度略低，最適溫區也相對較窄。
[0036]實施例3初始pH值對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株菌絲生物量和產孢量的影響
1、試驗設置
(O以實施例1制備的玫煙色棒束孢SCAU-`1FCF02菌株的孢子懸浮液為種子液進行發酵。發酵培養液成分為葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L。裝樣量75mL/250mL，玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02 菌株接種量 5% (V/V)。
[0037](2)在所篩選出的產孢量的最佳培養溫度的基礎上，控制搖床轉速為150 rpm。培養液的初始pH值設置如下:4、5、6、7、8和9，初始pH值通過NaOH和HCl稀釋液進行調配，測定不同初始PH值對菌絲生物量和產孢量的影響，其它條件和測定方法同前所述，獲得最佳產孢初始pH值。
[0038]2、結果顯示，不同初始pH值對玫煙色棒束孢液體發酵過程中菌絲生物量和產孢量的影響如附圖2所示，在6種不同初始pH值的培養液中，本菌株菌絲生物量和產孢量均表現出顯著的差異(P < 0.05)。兩者的變化趨勢整體上一致，菌絲生物量和產孢量在近中性偏微酸性環境下產量較高，堿性條件則表現出不利影響，下降趨勢顯著(P < 0.05)。在初始PH值為5~6時，菌絲生物量呈現出最大值約為22 mg/mL，兩者之間差異不顯著(P >
0.05);而在初始pH值為6時，產孢量達到最大值2.9480 X IO8孢子/mL。由此可見，產孢量對初始PH值的要求更加嚴格。
[0039]實施例4搖床轉速對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株菌絲生物量和產孢量的影響
1、試驗設置
(O以實施例1制備的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液為種子液進行發酵。發酵培養液成分為葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L。裝樣量75mL/250mL，玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02 菌株接種量 5% (V/V)。
[0040](2)在所篩選出的產孢量的最佳培養溫度和最佳初始pH值的基礎上，搖床轉速設置如下:90、120、150、180、210、240和270 rpm，測定不同搖床轉速對菌絲生物量和產孢量的影響，其它條件和測定方法同前所述，獲得最佳產孢搖床轉速。
[0041]2、結果顯示，不同搖床轉速對玫煙色棒束孢液體發酵過程中菌絲生物量和產孢量的影響如附圖3所示，在7種不同的搖床轉速條件下，本菌株菌絲生物量和產孢量均表現出較明顯的差異。隨著搖床轉速的升高，菌絲生物量和產孢量均表現出先上升后下降的趨勢，從整體上來看，兩者的變化程度大致相同。在搖床轉速為150 rpm時，菌絲生物量達到最大值21.43 mg/mL，顯著高于其它轉速條件(P < 0.05);在搖床轉速為180 rpm條件下，產孢量達最大值為3.1140X 108孢子/mL，顯著高于其它轉速條件(P < 0.05)。
[0042]實施例5 二次通用旋轉回歸組合設計優化玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株發酵環境條件
由上述實施例2~4可知，在單因素試驗確定的發酵條件下進行發酵，產孢量達最大值為3.1140X IO8孢子/mL，且幾個因素的配比有成千上萬種組合，因此，本發明人通過利用二次通用旋轉回歸組合設計，建立一種二次回歸數學模型，能夠準確快速的確定玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株發酵環境條件最優工藝。
[0043]1、根據單因素試驗結果，以培養溫度(X1X初始pH值(X2)和搖床轉速(X3)為3個試驗因子，以單因素試驗確定的最佳值為中心點，以產孢量為測定指標，設計3因素5水平的二次通用旋轉組合試驗，用以優化本菌株液體發酵產孢的培養條件，每個處理重復5次。試驗因子及水平如表1所示。
[0044]表1因素水平編碼表
【權利要求】
1.一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝的確定方法，其特征在于，所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株于2013年11月I日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013526 ； 所述確定方法為在針對所述菌株的特點確定影響發酵效果的關鍵單因素；根據所確定的關鍵單因素進行篩選分析，結合二次通用旋轉回歸組合設計方法，以培養溫度、初始PH值和搖床轉速為3個試驗因子，以各單因素篩選的最佳值為中心點，以產孢量為測定指標，設計3因素5水平的二次通用旋轉組合試驗，建立所述菌株的產孢量與培養溫度、培養液初始PH值以及搖床轉速之間的二次回歸數學模型；根據所得的二次回歸數學模型總結出玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵的環境條件優化工藝。
2.一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝，其特征在于，發酵的各環境條件為培養溫度24°C、培養液初始pH值6、搖床轉速170 rpm。
3.根據權利要求2所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝，其特征在于，具體的發酵步驟如下: 51.制備玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液； 52.以上述孢子懸浮液為種子液，按照5%體積比的接種量，將玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液接種到發酵培養液，在培養溫度24°C、搖床轉速170 rpm的條件下進行發酵培養。
4.根據權利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝，其特征在于，步驟SI所述孢子懸浮液的制備方法為: 511.取玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，在無菌條件下，接種于PDA平板進行活化，光照周期為光照:黑暗=14:10，25°C恒溫培養；` 512.待菌絲長滿培養皿后，加入含有0.03%吐溫-80的無菌水，洗出菌絲及孢子，對洗出的菌液進行攪拌； 513.待孢子完全分散后，過濾，獲得分生孢子懸浮液。
5.根據權利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝，其特征在于，S2所述的發酵培養液的配方為葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L，水定容，pH值為6，滅菌備用。
6.根據權利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝，其特征在于，S2所述發酵培養為密閉發酵時，發酵液與發酵空間的體積比為3:10。
7.根據權利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝，其特征在于，S3所述發酵培養的時間為5~8天。
8.根據權利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發酵環境條件優化工藝，其特征在于，S3所述發酵培養的時間為6天。
【文檔編號】C12R1/645GK103756950SQ201310721114
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】何余容, 張偉, 呂利華, 謝梅瓊, 念曉歌 申請人:華南農業大學