一種含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶及其制備方法

一種含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶及其制備方法
【專利摘要】本發公開了一種含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，屬于飼料酶制劑領域。所述含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，其特征在于，所述乳仔豬專用復合酶由以下重量份數的組分組成：中草藥粉1-3份，木聚糖酶15-20份，纖維素酶5-10份，β-葡聚糖酶及其培養物10-20份，甘露聚糖酶3-5，蛋白酶2-10，中溫α-淀粉酶2-5份。其中纖維素酶的生產菌種為里氏木霉(Trichoderma?reesei)601-17，保藏編號為CCTCC?M?2013540，制備方法如下：斜面菌株培養獲得液體種子；發酵階段采用低溫、逐級接種相結合的方法；發酵液經離心，收集、濃縮、過濾、干燥獲得纖維素酶。本產品中添加的纖維素酶、β-葡聚糖酶及其培養物含有益生菌和酶制劑，可有效提高飼料消化吸收效率且提高動物腸道健康。
【專利說明】一種含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于酶制劑領域，具體涉及一種復合酶及其制備方法。
【背景技術】
[0002]為了克服乳豬在斷奶后所出現的種種問題，多數企業從斷奶前補飼、誘食、日糧酸化、使用適口性好且易消化吸收的飼料原料、添加外源酶、降低日糧的抗原性、降低日糧的粗蛋白含量以及使用促進劑等多個方面進行了改善和優化，但實際效果參差不齊。
[0003]考慮到仔豬在斷奶時，其自身的蛋白酶、淀粉酶等酶活應激而大幅下降到斷奶時的三分之一，而這些酶類對于仔豬獲取營養和能量起著至關重要的作用。同時，飼料用酶在畜禽生產中具有不俗的效果，比如前蘇聯科學家在早期斷奶仔豬日糧中添加淀粉糊精酶，使得日增重提高14.6%，碳水化合物消化率提高77.2%。
[0004]添加酶制劑能補充蛋白酶和淀粉酶，是輔助分解日糧中的蛋白和淀粉，降解日糧中的抗營養因子，并能有效分解玉米/豆柏型日糧中的植物細胞壁，使細胞內的營養物質如淀粉、蛋白質等釋放出來。同時分解可溶性纖維，降低植物纖維物質的吸水能力和腸道內容物的粘度。另外，大量的生產時間和科學實驗也證明了中草藥具有很多營養成分和生物活性物質，兼有藥性和營養性的雙重作用，既可以防病又可以提高生產性能。因此，我們經過多次飼喂實驗，研制出了一種乳仔豬專用復合酶，其能有效地提高飼料的利用率、降低腹瀉率、促進動物生長，針對性強，效果好，經濟效益顯著。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種酶活力高、抗腹瀉效果顯著的含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶及其制備方法。
[0006]本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:
[0007]—種含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，其特征在于，所述乳仔豬專用復合酶由以下重量份數的組分組成:中草藥粉1-3份，木聚糖酶15-20份，纖維素酶5-10份，β -葡聚糖酶及其培養物10-20份，甘露聚糖酶3-5，蛋白酶2-10，中溫α -淀粉酶2_5份。
[0008]所述木聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白酶和中溫α-淀粉酶均為湖南鴻鷹翔生物工程股份有限公司或市售產品；
[0009]所述中草藥為黨參、麥冬和當歸的混合物，黨參、麥冬和當歸的質量比為1:2:1-2。
[0010]所述纖維素酶制備方法如下:
[0011]所述纖維素酶的生產菌種為里氏木霉(Trichodema reesei) 601-17,該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:中國.武漢.武漢大學，郵編:430072)，保藏編號為CCTCC NO:M2013540，分類命名為里氏木霉601-17Trichodema reesei601_17。里氏木霉菌株接種到斜面活化培養基上，逐級擴大培養制備種子液，培養時間為72-96小時；種子液按發酵液體積5-10%的接種量接種于發酵培養基中，20-35 V培養96-144小時，即里氏木霉發酵生產纖維素酶結束；將發酵液在4000-600orpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進行超濃縮過濾、干燥獲得纖維素酶。
[0012]所述β -葡聚糖酶及其培養物制備方法如下:
[0013](I)種子培養
[0014]將地衣芽孢桿菌斜面菌種經三級搖瓶發酵劑一級種子罐發酵；
[0015]所述種子培養的培養基為:酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，海藻糖1-3%，硫酸鈣Ig,氯化鎂2g，檸檬酸鈉l_3g，不足部分純凈水補足，pH4.5-7.0,121-123°C滅菌30_40min。
[0016](2)發酵罐發酵
[0017]將一級種子罐發酵液以3%接種量接入含有3L發酵培養基的發酵罐中，培養溫度35-45 °C，攪拌速度200-300r/min，通風量(V/V) 1:1-3，培養時間10_15h ;然后將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發酵培養基補入發酵罐，待溫度升至35_45°C時恒溫培養15-20h ;此時，將一級種子罐發酵液以2%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養10-15h ;繼續將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發酵培養基補入發酵罐，待溫度升至35_45°C時恒溫培養10-15h ;
[0018]所述發酵培養基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水IOOOmL, pH值4.5-7.0,121°C滅菌20min ；
[0019]所述發酵培養基的調配方法為:按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節PH值3-7，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C保溫15-30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始PH3-7，121_123°C滅菌30_40min備用。
[0020]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15-30% ；
[0021]PH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在3-7 ；
[0022]補料控制:當發酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補料培養基，補料量以維持發酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0023]放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0024](3)發酵液經離心分離、濃縮、精濾、干燥得β -葡聚糖酶，離心所獲得地衣芽孢桿菌菌體經清洗后冷凍干燥獲得地衣芽孢桿菌菌體，將β-葡聚糖酶和地衣芽孢桿菌菌體混合獲得葡聚糖酶及其培養物。
[0025]所述地衣芽孢桿菌具體為地衣芽孢桿菌(B acillus licheniformis) β-10-25。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:中國.武漢.武漢大學，郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO:Μ2013538，分類命名為地衣芽孢桿菌 β-10-25 B acillus licheniformis β-10-25。
[0026]該菌株由一株本公司實驗室保藏的產葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌經原始出發菌種地衣芽孢桿菌(B acillus licheniformis) β-10 —試管活化一紫外線(UV)-氯化鋰(LiCl)-硫酸二乙酯(DES)復合誘變一平板初篩(高產)一搖瓶復篩(高產)一熱穩定性測定一傳代穩定性試驗等步驟篩選獲得，特點如下:[0027]所述菌株在固體平板上菌落為白色，邊緣不整齊，表面干燥不透明，鏡檢為革蘭氏陽性細菌，細胞形態呈短桿狀，芽孢中生，橢圓形，不膨大。
[0028]所述菌株生理生化特征:V-P試驗( + )，淀粉水解( + )，酪素水解( + )，明膠水解( + )，硝酸鹽還原( + )，吲哚試驗(_)，利用檸檬酸鹽( + )，硝酸還原( + )，甘露醇( + )，木糖(+ )。
[0029]優選的，一種乳仔豬專用復合酶按如下重量份數組成:中草藥粉2份，木聚糖酶18份，纖維素酶8份，β_葡聚糖酶及其培養物15份，甘露聚糖酶4，蛋白酶8，中溫α-淀粉酶4份。中草藥粉的組成為黨參、麥冬和當歸的質量比為1:2:1。
[0030]所述乳仔豬專用復合酶適用于飼料加工廠和養殖場自配飼料，使用時應與飼料中的其它原料混合均勻，可事先將本發明與少量飼料混合均勻，再混合到大批飼料中，直接飼喂。建議每噸全價料添加量為80-150g。
[0031]有益效果:
[0032]本發明根據乳仔豬消化生理特點，并經過動物實驗篩選復合配方，設置復合酶酶譜，有效補充乳仔豬消化道內源酶的不足， 有效提高乳仔豬對飼料的消化利用率，防止營養性腹瀉的產生。針對玉米、豆柏等植物性飼料原料抗營養因子的特點，合理添加非淀粉多糖類酶制劑，高效降解飼料中的抗營養因子。并且本發明所使用纖維素酶活力高、作用條件寬泛、熱穩定性強、適于工業化生產。采用專為飼用酶開發的微生物菌株生產的酶制劑，動物適應性好，生物學效價高，在動物體溫(37-40°C )和消化道較寬的pH范圍內發揮較高活性的作用。本發明中添加了中草藥粉劑，其具有天然抗菌和增強免疫力的作用，可以有效的提乳仔豬的抗應激能力、免疫功能以及抗病防御機能。另外，中草藥粉劑中添加了具有抗熱應激原作用的黃芩、柴胡，使得本發明產品具有更好的穩定性和保存活性，較沒有添加中草藥粉劑的產品在長時間高溫條件下的保存活性提高了 11%。產品中添加的纖維素酶、β_葡聚糖酶及其培養物含有益生菌和酶制劑可有效提高飼料消化吸收效率且提高動物腸道健康。
【具體實施方式】
[0033]所述纖維素酶的生產菌種為里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17,該菌株于2013年11月3日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2013540，分類命名為里氏木霉(Trichoderma reesei)，保藏地址:武漢市武昌區珞珈山武漢大學生命科學學院，郵編430072。
[0034]所述菌株產纖維素酶的最適pH3.0-6.0 ;最適溫度為23~35°C。
[0035]所述菌株生理生化特征:
[0036]該菌株在PDA固體培養基上生長，形成的菌落特征為菌落呈棉絮狀，菌落呈淡綠色，菌落扁平，高0.1-0.75mm,菌落邊緣白色，整齊；生長速度快，48h菌落直徑達
1.0-8.5mm, 72h達30-50mm ;菌絲白色，有隔膜，菌絲壁光滑，直徑在2-5?πι。分生孢子梗從菌絲的短側枝發生，側枝上對生。分生孢子梗呈瓶狀，直立，無色，孢子呈球形，綠色，直徑
20-100伽。
[0037]該菌株可在麥麩上生長，主要代謝產物為纖維素酶(內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖苷酶)。根據((An Introduction industrial mycology)) (George Smithl954)、《真菌鑒定手冊》(魏景超1982)、《常見與常用真菌》(中科院微生物研究所1973)，鑒定該菌株為:里氏木霉。
[0038]利用里氏木霉菌株，通過紫外誘變、培養、發酵生產纖維素酶的方法如下。
[0039]菌種初篩:原始菌株里氏木霉HYXOl采自津市市保河堤食用菌培植基地中的土樣篩選分離出。里氏木霉菌株接種到斜面活化培養基上，活化菌種；培養活化后的菌種，挑取單菌落制備孢子懸浮液，并用紫外照射孢子懸浮液，誘變得到孢子菌落；適當稀釋將孢子濃度調節為IO3個/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養基上。在30°C培養3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容IOOOmL, pH值5-6,121°C滅菌20min)。
[0040]復篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養基，30°C培養至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復篩培養基的250mL三角瓶中進行發酵，接種量10%( v/v)，30°C、100r/min培養96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。(所述復篩培養基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進行放大實驗。
[0041]復篩選出菌株為里氏木霉(Trichoderma reesei) 601-17,保藏編號為CCTCC NO:M2013540。
[0042]培養特征:該菌株產纖維素酶的最適pH3.0-6.0 ;最適溫度為23?35°C。
[0043]遺傳穩定性試驗:將該菌株在斜面上連續十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發酵情況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩定性較強。
[0044]放大試驗
[0045]種子培養:將纖維素酶酶活力最高的菌株接入500mL三角瓶中，種子培養基裝量100 毫升，300C、150rpm 搖床培養 72_96h。
[0046]種子罐培養:將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發酵培養基的IOL發酵罐中，控制pH值恒定為5.0±0.2，培養溫度27±0.1°C，攪拌速度300rpm，通風量(v/v)1:0.8-1.2,培養時間104h，溶解氧20-30%。所述發酵培養基制備方法為:纖維素粉10%、硫酸銨0.5%、硫酸鎂0.025%、磷酸二氫鉀0.1%、氯化鈉0.01%、其余為水，pH值5-6，121°C滅菌20mino
[0047]發酵結束后，取發酵上清液(粗酶液)進行酶活力檢測，經測定，外切β -葡聚糖酶、內切β -葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。
[0048]例1: 一種乳仔豬專用復合酶按如下重量份數組成:中草藥粉2份，木聚糖酶18份，纖維素酶8份，β_葡聚糖酶及其培養物15份，甘露聚糖酶4，蛋白酶8，中溫α-淀粉酶4份。所述中草藥為黨參、麥冬和當歸的混合物，黨參、麥冬和當歸的質量比為1:2:1。
[0049]例2:所述乳仔豬專用復合酶由以下重量份數的組分組成:中草藥粉3份，木聚糖酶20份，纖維素酶10份，β -葡聚糖酶及其培養物10份，甘露聚糖酶3，蛋白酶8，中溫α -淀粉酶3份；所述中草藥為黨參、麥冬和當歸的混合物，黨參、麥冬和當歸的質量比為1:2:2。
[0050]例3 —種含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，中草藥粉3份，木聚糖酶20份，纖維素酶5份，β -葡聚糖酶及其培養物20份，甘露聚糖酶5，蛋白酶10，中溫α -淀粉酶5份。
[0051]所述中草藥為黨參、麥冬和當歸的混合物，黨參、麥冬和當歸的質量比為1:2:2。
[0052]例4中草藥粉I份，木聚糖酶15份，纖維素酶10份，β -葡聚糖酶及其培養物15份，甘露聚糖酶5，蛋白酶2，中溫α-淀粉酶2份。
[0053]所述中草藥為黨參、麥冬和當歸的混合物，黨參、麥冬和當歸的質量比為1:2:1。
[0054]實施例5效果對比實驗
[0055]選取120頭斷奶仔豬，按體重、血統及性別無差異分為實驗組和對照組，每組3個重復，每個重復20頭豬。實驗期為28天，實驗期間所飼喂的日糧組成見下表:實驗組和對照組每噸飼料均添加復合酶制劑120g，實驗組所用復合酶制劑為實施例2所述復合酶制齊U，對照組所用復合酶制劑為市售同類產品。本發明產品，相對對照組，實驗組日增重達到432g，比對照組提高了 27g，料重比顯著增加為1.77，對照組為1.85 ;腹瀉率也極大減少，實驗組為8次，對照組為10次，五分制皮膚和毛色評分(5分為最高)，實驗組達到4.0分，而對照組為3.0分，以上數據結果表明本發明飼料產品具有良好飼喂價值。可以有效提高飼喂效果和效益。
[0056]實施例6中草藥粉劑對酶保存活性的影響
[0057]以實施例2中所述的制備方法獲得的乳仔豬專用復合酶為樣品1，以去除實施例2中所有的中草藥粉劑的制備方法獲得的小麥日糧酶為樣品2，比較兩種樣品的保存活性。在45°C下保存上述樣品18h，之后測定酶活，結果表明:樣品I的殘余酶活在76%以上，樣品2的殘余酶活保持在60%左右。
【權利要求】
1.一種含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，由以下重量份數的組分組成:中草藥粉1-3份，木聚糖酶15-20份，纖維素酶5-10份，β -葡聚糖酶及其培養物10-20份，甘露聚糖酶3-5，蛋白酶2-10，中溫α-淀粉酶2-5份。
2.根據權利要求1所述含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，所述中草藥為黨參、麥冬和當歸的混合物，黨參、麥冬和當歸的質量比為1:2:1-2。
3.根據權利要求1所述含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，所述纖維素酶制備方法如下: 生產菌種為里氏木霉(Trichoderma reesei) 601-17，保藏編號為 CCTCC NO:M2013540,里氏木霉菌株接種到斜面活化培養基上，逐級擴大培養制備種子液，培養時間為72-96小時；種子液按發酵液體積5-10%的接種量接種于發酵培養基中，20-35°C培養96-144小時，即里氏木霉發酵生產纖維素酶結束；將發酵液在4000-600Orpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進行超濃縮過濾、干燥獲得纖維素酶。
4.根據權利要求1所述含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，按如下重量份數組成:中草藥粉2份，木聚糖酶18份，纖維素酶8份，β -葡聚糖酶及其培養物15份，甘露聚糖酶4，蛋白酶8，中溫α-淀粉酶4份。
5.根據權利要求1所述含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，按如下重量份數組成:中草藥粉2份，木聚糖酶18份，纖維素酶8份，β -葡聚糖酶及其培養物15份，甘露聚糖酶4，蛋白酶8，中溫α-淀粉酶4份。
6.根據權利要求1所述含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶，由以下重量份數的組分組成:中草藥粉3份，木聚糖酶20份，纖維素酶10份，β -葡聚糖酶及其培養物10份，甘露聚糖酶3，蛋白酶8，中溫α-淀粉酶3份。
7.根據權利要求1-6所述含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶的制備方法，由以下組分混合組成:中草藥粉，木聚糖酶，纖維素酶，β_葡聚糖酶及其培養物，甘露聚糖酶，蛋白酶，中溫α-淀粉酶；所述纖維素酶制備方法如下:生產菌種為里氏木霉(Trichodermareesei) 601-17，保藏編號為CCTCC NO:M2013540，里氏木霉菌株接種到斜面活化培養基上，逐級擴大培養制備種子液，培養時間為72-96小時；種子液按發酵液體積5-10%的接種量接種于發酵培養基中，20-35°C培養96-144小時，即里氏木霉發酵生產纖維素酶結束；將發酵液在4000-600Orpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進行超濃縮過濾、干燥獲得纖維素酶。
8.根據權利要求7所述含有纖維素酶的乳仔豬專用復合酶的制備方法，所述β-葡聚糖酶及其培養物制備方法如下:發酵液經離心分離、濃縮、精濾、干燥得葡聚糖酶，離心所獲得地衣芽孢桿菌菌體經清洗后冷凍干燥獲得地衣芽孢桿菌菌體，將β -葡聚糖酶和地衣芽孢桿菌菌體混合獲得葡聚糖酶及其培養物；地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) β-10-25 保藏號為 CCTCC NO:Μ2013538。
【文檔編號】C12N9/42GK103750011SQ201310716901
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】李洪兵, 李海清, 張錦杰, 易繼云, 劉文明 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司