一種可提高分泌效率的信號肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種可提高分泌效率的信號肽，核苷酸序列如1）或2所示1）核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；2）對SEQ?ID?NO.1序列做出改造，但仍就行使信號肽功能且分泌效率未發生根本改變的核苷酸序列。本發明提供了一種可提高分泌效率的信號肽，使用后可顯著提高菌株的分泌能力，本發明中可將天冬酰胺酶酶活提高了1.5倍。改造后的菌株產酶能力顯著提高，更適合工業應用，可降低生產成本，提高生產效率。
【專利說明】一種可提高分泌效率的信號肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分泌能力提高的信號肽，特別是一種提高天冬酰胺酶活力的信號肽。
技術背景
[0002]L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一種有抗癌活性的蛋白酶，能專一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和nh3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現為對某些腫瘤的抑制作用，尤其對急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效。L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物，對骨髓細胞沒有抑制作用。
[0003]L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的還原糖和天冬酰胺在高溫加熱過程中通過美拉德反應生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，從源頭上減少丙烯酰胺的生成。
[0004]一些微生物、哺乳動物及植物被證實含有L-天冬酰胺酶。因為動物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工藝復雜，微生物具有易培養，成本低等優點，成為學者研究的重點，目前研究的產L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia col1、Erwinia carotovora、Erwinia chrysanthemi等,但野生菌株L-天冬酰胺酶產量低,近年來利用基因工程技術將L-天冬酰胺酶基因克隆到大腸桿菌中，獲得L-天冬酰胺酶的高效表達，利用工程菌產L-天冬酰胺酶已成為一個重要來源。
[0005]L-天冬酰胺酶有兩種類型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II, Escherichiacol1、Erwinia chrysanthem1、B.subtilis等均包含這兩種L-天冬酰胺酶,研究證實僅L-天冬酸胺酶II具有抗癌作用，來自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被開發為治療急性淋巴細胞白血病的有效藥物，目前研究的大部分是具有抗腫瘤效果的L-天冬酰胺酶II。
[0006]本發明基于枯草芽孢桿菌來源天冬酰胺酶基因在枯草芽孢桿菌中表達的平臺，通過改造信號肽，實現的天冬酰胺酶在枯草芽孢桿菌中高效表達，以期得到天冬酰胺酶分泌能力提聞的菌株。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題為提供一種可提高分泌效率的信號肽，核苷酸序列I)或2所示:
[0008]I)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0009]SEQ ID N0.1 序列如下:
[0010]ATGAAAAAAAGAAAGAGGCGAAACTTTAAAAGGTTCATTGCAGCATTTTTAGTGTTGGCTTTAATGATTTCATTAGTGCCAGCCGATGTACTAGCAAAATCTACA
[0011]2)對SEQ ID N0.1序列做出改造，但仍就行使信號肽功能且分泌效率未發生根本改變的核苷酸序列。[0012]本研究通過融合信號肽，使天冬酰胺酶的分泌途徑發生改變，轉向SEC分泌方式，使天冬酰胺酶分泌量增加，酶活得到進一步的提高。
[0013]本發明還提供一株天冬酰胺酶分泌能力增強的枯草芽孢桿菌。
[0014]先前的工作中，本研究團隊已將枯草芽孢桿菌168來源的天冬酰胺酶基因在枯草芽孢桿菌WB600中得到表達。基于枯草芽孢桿菌以構建好的平臺，通過融合信號肽，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的新菌株；所述信號肽融合到需要表達基因的N端。
[0015]本發明所用到的培養基:
[0016]LB 培養基:胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，ρΗ7.0 ；
[0017]枯草芽孢桿菌發酵培養基:大豆蛋白胨10g/L,玉米衆15g/L,尿素3g/L,葡萄糖40g/L,磷酸氫二鉀2.3g/L，磷酸二氫鉀1.7g/L，硫酸鎂0.75g/L，氯化鈉5g/L ;調節pH6.8-7.00
[0018]本發明中天冬酰胺酶酶活力的測定:
[0019]采用分光光度法測定天冬酰胺酶酶活。I個單位天冬酰胺酶酶活定義為:酶活定義:在37°C反應條件下，每分鐘內能催化L-天冬酰胺釋放lymol NH3所需要的酶量為一個酶活單位(U/ml)。酶活測定條件:37°C條件下，ImllOmM K2HPO4-KH2PO4CPH7.5),0.lmll89mM天冬酰胺，0.3ml發酵上清液，保溫30分鐘，0.1mll.5M TCA終止反應。利用ShimadzuUV-1240在436nm處測定吸光值，通過硫酸銨繪制標準曲線，根據標準曲線計算酶活。[0020]本發明提供了一種可提高分泌效率的信號肽，使用后可顯著提高菌株的分泌能力，本發明中可將天冬酰胺酶酶活提高了 1.5倍。改造后的菌株產酶能力顯著提高，更適合工業應用，可降低生產成本，提高生產效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1 pMA0911-wapA-SP_ansZ 質粒圖譜
[0022]圖2天冬酰胺酶生產菌株產酶鑒定
[0023]I:PMA5-ansZ/WB600
[0024]2:pMA0911-wapA-SP-ansZ/WB600
【具體實施方式】
[0025]實施例1 一種新型信號肽
[0026]本發明提供的信號肽(WapA-SP )核苷酸序列如SEQ ID N0.1:ATGAAAMAAGAAAGAGGCGAAACTTTAAAAGGTTCATTGCAGCATTTTTAGTGTTGGCTTTAATGATTTCATTAGTGCCAGCCGATGTACTAGCAAAATCTACA所示或者是對SEQ ID N0.1序列做出改造，但仍就行使信號肽功能且分泌效率未發生根本改變的核苷酸序列。上述信號肽序列為化學全合成或者通過PCR方法獲得。
[0027]將上述目的信號肽WapA-SP與克隆到載體pMA5，構建質粒pMA0911-WapA_SP，酶切驗證正確后，轉化子由上海生工進行測序。
[0028]本研究通過融合信號肽，使天冬酰胺酶的分泌途徑發生改變，轉向SEC分泌方式，能使天冬酰胺酶分泌量增加，酶活得到進一步的提高。
[0029]實施例2天冬酰胺酶基因獲取
[0030]根據NCBI枯草芽孢桿菌全基因組核酸序列中ansZ基因序列，設計L-天冬酰胺酶基因的PCR引物G19Sence和G19Antisence。通過PCR的方式，擴增缺失信號肽(N端19個氨基酸)的ansZ基因。
[0031]G19Sence:CCGGAATTCTGTTCACATTCTCCTGAAACAA (EcoR I)
[0032]G19Antisence:CGCGGATCCTCAATACTCATTGAAATAAGCTTG (BamH I)
[0033]以pET22b_ansZ (上海生工合成)為模版，利用上面提供的引物做PCR擴增進行，PCR條件:98°C預變性，3min, 一個循環；98°C變性，30s, 50°C退火，30s, 72V延伸，70s，34個循環；72°C，10min，一個循環；12°C，lOmin，一個循環。PCR擴增體系:模板lyL，上下游引物各 I μ L，dNTP Mix4 μ L, 5XprimeSTAR BufferlO μ L，滅菌的雙蒸水 32.5 μ L，primeSTAR DNA聚合酶0.5 μ L。采用膠回收試劑盒對PCR產物進行純化和回收，電泳檢驗回收產物的濃度。EcoR I7BamH I酶切膠回收產物(目的基因ansZ)及pMA0911-wapA_SP質粒(表達載體)，柱回收試劑盒對酶切后的膠回收產物進行純化和回收，膠回收試劑盒對酶切后質粒進行純化回收，電泳檢驗回收產物的濃度。
[0034]實施例3高效分泌天冬酰胺酶菌株構建
[0035]目的基因ansZ與載體pMA0911-wapA-SP連接，連接體系:目的基因4yL，載體pMA0911-wapA-SPl μ L，solution 15 μ L，16 °C過夜連接。將連接好的重組質粒pMA0911-wapA-SP-ansZ轉化到感受態E.coil JM109，用氨芐青霉素LB平板，挑取陽性菌落。37°C搖床過夜培養后提取質粒，命名為pMA0911-WapA-SP-ansZ，酶切驗證正確后，轉化子由上海生工進行測序。
[0036]將測序正確的質粒，轉化枯草芽孢桿菌WB600，獲得產天冬酰胺酶基因工程菌。
[0037]實施例4高分泌能力天冬酰胺酶生產菌株的驗證
[0038] 將實施例2中構建的重組菌pMA0911-wapA_SP-ansZ/B.subtilisWB600，與出發菌株WB600PMA5-ansZ分別接種于IOmL含卡那霉素的LB養基中，37°C振蕩培養過夜，次日按4%的接種量轉接于枯草芽孢桿菌發酵培養基中，37°C培養24h，取發酵液于4°C，1000Or/min離心lOmin，上清為胞外粗酶液，細胞破碎上清液為胞內粗酶液，用于酶活力的測定。枯草芽孢桿菌發酵培養基:大豆蛋白胨10g/L，玉米漿15g/L，尿素3g/L，葡萄糖40g/L，磷酸氫二鉀2.3g/L，磷酸二氫鉀1.7g/L，硫酸鎂0.75g/L，氯化鈉5g/L。調節ρΗ7.0。
[0039]對天冬酰胺酶活力進行測定，結果如圖2所示。實驗結果表明與出發菌株比較，pMA0911-wapA-SP-ansZ/WB600 酶活力提高了 1.5 倍，最高達到 8.42U/ml。
【權利要求】
1.一種可提高分泌效率的信號肽，其特征在于核苷酸序列I)或2所示 1)核苷酸序列如SEQID N0.1所示； 2)對SEQID N0.1序列做出改造，但仍就行使信號肽功能且分泌效率未發生根本改變的核苷酸序列。
2.應用權利要求1所述信號肽構建的表達效率提高的基因工程菌。
3.權利要求2所述基因工程菌的構建方法，其特征在于將權利要求1)中所述信號肽融合到需要表達基因的N端。
4.權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌分泌天冬酰胺酶能力提高的基因工程菌。
5.權利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述工程菌為枯草芽孢桿菌基因工程菌。
【文檔編號】C12N1/21GK103709236SQ201310716775
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】陳堅, 馮岳, 劉松, 堵國成, 王彬晨, 陳璇 申請人:江南大學