胰島素樣生長因子重組乳酸菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種重組胰島素樣生長因子的編碼基因、含有所述編碼基因的乳酸菌及其應用，屬于生物基因工程領域。胰島素樣生長因子是一類多功能細胞增殖調控因子，在細胞的分化、增殖、個體的生長發育中具有重要的促進作用，但與大多基因工程獸藥一樣存在著生產量不足、價格昂貴、產品需純化、給藥困難等問題。為獲取大量的重組豬胰島素樣生長因子，本發明采用乳酸菌表達系統對密碼子優化后的重組豬胰島素樣生長因子基因進行異源表達，并利用上述重組乳酸菌作為活菌制劑或飼料添加劑以增強豬非特異性免疫力。
【專利說明】胰島素樣生長因子重組乳酸菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種含有胰島素樣生長因子重組乳酸菌，以及胰島素樣生長因子的編碼基因及其蛋白在重組乳酸菌中的表達方法和應用。
【背景技術】
[0002]動物腸道不僅是動物體內最大的消化吸收器官，是所有營養物質最終的吸收場所，同時也是體內最大的免疫器官，仔豬腸道健康發育是快速生長與高成活率的生理基礎。新生仔豬由于腸道處于快速發育之中，結構與功能不完善，養分的消化吸收與免疫屏障功能有很大的局限性，難以適應營養與環境的變化，增加了飼養的困難。仔豬哺乳期間，初乳和常乳中都含有高水平的、可促進腸道發育和成熟的生長因子，如谷氨酰胺、表皮生長因子、胰島素樣生長因子和多胺等，斷奶后這些因子消失，對腸細胞生長、分化及細胞功能的發育產生不良影響。[0003]胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,簡稱IGFs)是一類多功能細胞增殖調控因子。在細胞的分化、增殖、個體的生長發育中具有重要的促進作用。胰島素樣生長因子在腸道中，可以調節消化腺的分泌，刺激黏膜增生，影響營養物質的轉運，而且在腸道組織的成熟、再生和修復以過程中都起重要的作用。胰島素樣生長因子作為豬乳中含量較高的生長因子之一，它對初生仔豬胃腸道發育有著極其重要影響。早期斷奶是縮短母豬生育周期的重要手段，而早期斷奶導致的斷奶應激是影響早期斷奶仔豬生產性能的主要原因，通過在飼料中添加胰島素樣生長因子可以緩解斷奶應激。盡管豬胰島素樣生長因子憑借其獨特的理化特性以及顯著的生理作用，作為飼料添加劑具有廣闊的發展前景，但是目前生產的豬胰島素樣生長因子都是從乳產品中獲得或利用大腸桿菌表達系統表達所得，這兩種途徑都具有一定的局限性，從乳中分離豬胰島素樣生長因子的量有限，很難滿足市場需要，而利用大腸桿菌表達系統表達的豬胰島素樣生長因子，由于宿主菌大腸桿菌的局限性不能直接作為飼料添加使用，存在著分離純化的難題，增加了成本，很難滿足市場需要。因此，開發出有效的、成本較低的豬胰島素樣生長因子將進一步拓展其在生豬養殖和疾病防御方面的應用。
[0004]乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類可發酵碳水化合物并產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的統稱。它們在自然界分布廣泛，在工業、農業和醫藥行業等與人類生活密切相關的重要領域應用價值很高。乳酸菌在食品工業中應用廣泛，是被公認為安全的(generally recognized as safe, GRAS)食品級微生物。乳酸菌是腸道益生菌,有多種生理功能，如控制腸內感染、抗腫瘤活性等，還能促進小腸局部細胞免疫和體液免疫。利用乳酸菌在腸胃道、泌尿、生殖系統或粘膜部位粘附存活且無病原性等特點，將其開發成為蛋白多肽類藥物粘膜給藥遞呈載體的研究，受到了廣泛的重視。因此，發明人嘗試采用重組乳酸菌表達豬胰島素樣生長因子，并利用重組乳酸菌作為豬胰島素樣生長因子的藥物呈遞系統應用到生豬養殖和疾病預防領域。但是，發明人經過實驗嘗試直接以基因庫豬胰島素樣生長因子基因轉入重組乳酸菌的方式表達豬胰島素樣生長因子，但是由于種屬差異，豬胰島素樣生長因子的表達量極低，蛋白活性也較低，因此需要尋找出更適合的豬胰島素樣生長因子基因。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是:首先，是提供一種更適合于乳酸菌表達系統的豬胰島素樣生長因子基因；其次，是開發出有效的、成本較低的胰島素樣生長因子給藥劑型或給藥途徑。
[0006]因此，本發明的一個目的是提供一種編碼重組豬胰島素樣生長因子的基因，所述基因為:
[0007]I)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0008]2)與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼重組豬胰島素樣生長因子的核苷酸序列。
[0009]本發明還提供了一種包含了上述所述編碼重組豬胰島素樣生長因子的基因的質粒。所述的質粒優選為原核表達質粒。最優選為PCYT質粒。
[0010]本發明還提供了一種包含有上述所述質粒的乳酸菌菌株。所述的乳酸菌為乳酸乳球菌、植物乳酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌或發酵乳桿菌。優選地，所述菌株為乳酸乳球菌，更優選的所述菌株為乳酸乳球菌L.1actis NZ9000。
[0011]本發明還提供了一種重組豬胰島素樣生長因子的表達方法，包括如下步驟:
[0012]I)以上述所述乳酸菌菌株接種培養，加入Nisin進行誘導表達；
[0013]2)收集重組豬胰島素樣生長因子`蛋白。
[0014]本發明還提供了上述所述乳酸菌菌株在制備食品及動物飼料中的新用途。
[0015]本發明還提供了一種含有乳酸菌的動物飼料，所述乳酸菌為可表達細胞因子的重組乳酸菌。作為優選的所述乳酸菌為可表達豬胰島素樣生長因子的重組乳酸菌。
[0016]本發明的有益效果主要有:
[0017]本發明利用乳酸菌作為腸道益生菌的優勢，制備了表達豬胰島素樣生長因子的重組乳酸菌。該重組乳酸菌甚至可以不經滅活處理直接添加到飼料中，豬進食后，該重組乳酸菌可在腸道內增殖，并穩定的表達胰島素樣生長因子，有效促進生豬腸道發育，從而提高生豬生長速度，帶來較好的經濟效益。同時也在很大程度上降低了含有豬胰島素樣生長因子飼料的制作成本。基于本發明理念，也完全可以加入含有其他來源的胰島素樣生長因子的乳酸菌制備成相應來源動物飼料甚至是人用食品。
[0018]本發明表達的豬胰島素樣生長因子在豬腸道內原位表達，避免了傳統胰島素樣生長因子制備過程所需的復雜、繁瑣、高成本的分離純化過程，大大節約了胰島素樣生長因子的制備成本。
[0019]本發明提供的豬胰島素樣生長因子可通過重組乳酸菌在腸道內表達而有效促進生豬腸道發育，提高生豬生長速度。這種胰島素樣生長因子的遞呈方式相對于成本低，更易接受，且無侵害性。同時，這樣也可以盡量避免直接服用胰島素樣生長因子原蛋白而造成的在消化系統中的損失。
[0020]此外，乳酸菌自身作為一種常見的豬飼料添加劑，能夠提高仔豬免疫力，促進腸道正常菌群的快速形成。這就從另外一方面抑制了有害菌群在腸道的繁殖，一定程度上預防了仔豬腹瀉和其他胃腸道疾病的發生。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1表示重組豬胰島素樣生長因子優化前后核苷酸序列比較。
[0022]其中，偶數行(B卩“原始序列”對應的行)為豬胰島素樣生長因子天然基因核苷酸序列，即密碼子優化前的序列；奇數行(即“優化序列”對應的行)為本發明的重組豬胰島素樣生長因子的基因核苷酸序列，即密碼子優化后的序列。
[0023]圖2_a、圖2_b為重組豬胰島素樣生長因子密碼子優化前后在乳酸菌表達宿主中CAI指數。
[0024]其中，圖2_a表示豬胰島素樣生長因子天然基因核苷酸序列在乳酸菌表達宿主中CAI指數經過程序計算為0.37 ;圖2-b表示優化后的本發明的重組豬胰島素樣生長因子密碼子在乳酸菌表達宿主中CAI指數經過程序計算為0.92。
[0025]圖3-a、圖3-b為豬胰島素樣生長因子密碼子優化前后在乳酸菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖。
[0026]其中，圖3_a表示豬胰島素樣生長因子天然基因核苷酸序列在乳酸菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖 ，從圖中可以看出:豬胰島素樣生長因子天然基因核苷酸序列的低利用率密碼子出現百分比為73% ;圖3-b表示優化后的本發明的重組豬胰島素樣生長因子密碼子在乳酸菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖，優化后的本發明的重組豬胰島素樣生長因子密碼子序列的低利用率密碼子出現百分比為1%。
[0027]圖4_a、圖4_b為重組豬胰島素樣生長因子密碼子優化前后在乳酸菌表達宿主中平均GC堿基含量分布區域圖。
[0028]其中，圖4_a表示豬胰島素樣生長因子天然基因核苷酸序列在乳酸菌表達宿主中平均GC堿基含量為:64.16% ;圖4-b表示優化后的本發明的重組豬胰島素樣生長因子密碼子在乳酸菌表達宿主中平均GC堿基含量為:38.43%。
[0029]圖5-a、圖5-b為重組豬胰島素樣生長因子密碼子優化前后mRNA的二級結構預測圖。
[0030]圖5-a豬胰島素樣生長因子天然基因mRNA的二級結構預測圖，圖5_b為密碼子優化后的本發明的重組豬胰島素樣生長因子mRNA的二級結構預測圖。
[0031]圖6為重組豬胰島素樣生長因子表達質粒構建過程圖。
[0032]圖7為重組豬胰島素樣生長因子基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0033]其中，泳道1為500bp DNA Ladder ;泳道2為兩端含有Nsi I和Xho I酶切位點的重組豬胰島素樣生長因子基因PCR產物。
[0034]圖8為表達載體PCYT-poIGF的酶切鑒定圖。
[0035]其中，泳道1 為 500bp DNA Ladder ;泳道 2 為 Nsi I 和 Xho I 雙酶切 PCYT-poIGF載體的電泳鑒定圖。
[0036]圖9為重組豬胰島素樣生長因子促結腸細胞增殖的活性檢測(MTT法)。
[0037]其中，圖9-a為重組豬胰島素樣生長因子促C0L0205細胞增殖實驗結果圖。實驗結果顯示，與陰性對照相比，本發明表達的豬胰島素樣生長因子可明顯促進C0L0205細胞增殖；圖9-b為重組豬胰島素樣生長因子促1Vo細胞增殖實驗結果圖。實驗結果顯示，與陰性對照相比，本發明表達的豬胰島素樣生長因子可明顯促進1Vo細胞增殖。
【具體實施方式】
[0038]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解，引用實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0039]實施例1重組豬胰島素樣生長因子的基因優化設計
[0040]發明人根據GenBank已公開的豬胰島素樣生長因子(insulin-like growthfactor I，IGFl)的cDNA序列(GenBank登錄號:NP_999421.1)，對該基因進行密碼子優化后得到本發明的重組豬胰島素樣生長因子基因，如SEQ ID No:l所示。下面是對豬胰島素樣生長因子基因進行密碼子優化，優化前后各參數對比如下:
[0041]1.密碼子適應指數(Codon Adaptation Index, CAI)
[0042]由圖2_a可知，密碼子沒有優化前，豬胰島素樣生長因子基因在乳酸菌中密碼子適應指數(CAI)為0.37。由圖2-b可知，通過密碼子優化后，使得本發明的豬胰島素樣生長因子基因在乳酸菌中CAI指數為0.92。通常CAI=I時被認為該基因在該表達系統中是最理想的高效表達狀態，CAI指數越低表明該基因在該宿主中表達水平越差，因此可以看出經過了密碼子優化后得到的基因序列可以提高豬胰島素樣生長因子基因在乳酸菌中的表達水平。
[0043]2.最優密碼子使用頻率(Frequency of Optimal Codons, FOP)
[0044]由圖3_a可知，基于乳酸菌表達載體，密碼子沒有優化前，豬胰島素樣生長因子基因序列的低利用率密碼子出現百分比為73%。這條未進行優化的基因含有串聯稀有密碼子，這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物。由圖3-b可知，通過密碼子優化后，本發明的豬胰島素樣生長因子基因在乳酸菌系統中出現低利用率密碼子的頻率為1%。
[0045]3.GC 喊基含量(GC curve)
[0046]GC含量理想分布區域為30%_70%，在這個區域外的出現任何峰都會不同程度地影響轉錄和翻譯效率。由圖4-a、圖4-b的豬胰島素樣生長因子基因的GC堿基平均含量分布區域圖對比可知，由圖4-a中顯示豬胰島素樣生長因子基因中在優化前GC堿基平均含量為64.16%，由圖4-b中顯示最終得到優化后重豬胰島素樣生長因子基因的GC堿基平均含量為38.43%，更有利于豬胰島素樣生長因子基因的表達。
[0047]4.優化前后順式作用元件情況如下:
[0048]
【權利要求】
1.一種編碼重組豬胰島素樣生長因子的基因，其特征在于，所述基因為如SEQ ID NO:I所示的核苷酸序列。
2.一種包含了如權利要求1所述編碼重組豬胰島素樣生長因子的基因的質粒。
3.如權利要求2所述的質粒，其特征在于，所述質粒為PCYT。
4.一種包含了如權利要求2所述的質粒的乳酸菌菌株。
5.如權利要求4所述的乳酸菌菌株，其特征在于，所述菌株為乳酸乳球菌。
6.如權利要求4所述的乳酸菌菌株，其特征在于，所述菌株為乳酸乳球菌NZ9000。
7.一種重組豬胰島素樣生長因子的表達方法，包括如下步驟: O以上述所述乳酸菌菌株接種培養，加入Nisin進行誘導表達； 2)收集重組豬胰島素樣生長因子蛋白。
8.權利要求4至6中任一項所述的乳酸菌菌株在制備食品及動物飼料中的新用途。
9.一種含有乳酸菌的動物飼料或人食品，所述乳酸菌為可表達細胞因子的重組乳酸菌。
10.如權利要求9所述的動物飼料或人食品，其特征在于，所述乳酸菌為如權利要求4至6中任一項所述的 乳酸菌菌株。
【文檔編號】C12N15/63GK103627711SQ201310716773
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】馬永, 侯景, 羅成, 章成昌, 姚翔, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司, 常州千紅生化制藥股份有限公司