一種產纖維素酶的菌株的制作方法
【專利摘要】本發明公開一株里氏木霉(Trichoderma?reesei)菌株，本發明屬于微生物發酵領域，利用一株保藏編號為CCTCC?NO：M2013540的里氏木霉(Trichoderma?reesei)菌株發酵生產纖維素酶。所述菌株產纖維素酶的最適pH3.0-6.0，最適溫度為23～35℃。所述菌株的種子液接種于發酵培養基中，25℃培養104小時，發酵液纖維素酶的外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。
【專利說明】一種產纖維素酶的菌株
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物領域，特別涉及一種產纖維素酶的真菌。
【背景技術】:
[0002]纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細菌、真菌、動物體內等都能產生纖維素酶。一般用于生產的纖維素酶來自于真菌，比較典型的有木酶屬(Trichodema)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)。纖維素酶在食品行業和環境行業均有廣泛應用。在進行酒精發酵時，纖維素酶的添加可以增加原料的利用率，并對酒質有所提升。
[0003]纖維素酶種類繁多，來源很廣。不同來源的纖維素酶其結構和功能相差很大。由于真菌纖維素酶產量高、活性大，故在畜牧業和飼料工業中應用的纖維素酶主要是真菌纖維素酶。
[0004]纖維素酶根據其催化反應功能的不同可分為內切葡聚糖酶(l，4-13-D-glucanglucanohydrolase 或 endo-l, 4_β-D-glucanase, EC3.2.1.4),來自真菌的簡稱EG,來自細菌的簡稱Cen、外切葡聚糖酶(1，4_β-D-glucan cel1biIhydrolase或exo-1, 4-β -D-glucannase, EC.3.2.1.91),來自真菌的簡稱CBH,來自細菌的簡稱Cex)和β -葡聚糖苷酶(β -1, 4-glucosidase, EC.3.2.1.21)簡稱BG。內切葡聚糖酶隨機切割纖維素多糖鏈內部的無定型區，產生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。β -葡萄糖苷酶水解纖維二糖產生兩分子的 葡萄糖。真菌纖維素酶產量高、活性大，在畜牧業和飼料工作中主要應用真菌來源的纖維素酶。
[0005]纖維素酶反應和一般酶反應不一樣，其最主要的區別在于纖維素酶是多組分酶系，且底物結構極其復雜。由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成的ES復合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上，然后在幾種組分的協同作用下將纖維素分解成葡萄糖。
[0006]1950年，Reese等提出了 Cl-Cx假說，該假說認為必須以不同的酶協同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。協同作用一般認為是內切葡聚糖酶(Cl酶)首先進攻纖維素的非結晶區，形成Cx所需的新的游離末端，然后由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由β_葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個葡萄糖。不過，纖維素酶的協同作用順序不是絕對的，隨后的研究中發現，Cl-Cx和β -葡聚糖苷酶必須同時存在才能水解天然纖維素。若先用Cl酶作用結晶纖維素，然后除掉Cl酶，再加入Cx酶，如此順序作用卻不能將結晶纖維素水解。
[0007]菌種選育是纖維素酶生產的基礎性工作，國內外許多專家進行了大量研究，為了生產高質量的纖維素酶產品，王家林等(1996)在吸收國內外經驗的基礎上，先后引進了綠色木霉木10、綠色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑曲霉XX-15A，在此基礎上，采用了紫外線、特定電磁波輻射、線性加速器，亞硝基胍等物理、化學的誘變方法，獲得了高產菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。其中木霉NT-15H固體培養活力經輕工部食品質量監督檢測中心南京站檢測表明，濾紙活力為3670u/g，Cl-酶活力24460u/g，Cx-酶活力1800u/g，已達到國際先進水平。此菌種在工廠化生產中性能穩定。張苓花等(1998)采用康氏木霉W-925，J-931，經過濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線(15W、30cm、2min)復合誘變后，得到了產酶活性高的Wu-932菌種，該菌種CMC糖化力達到2975，濾紙糖酶活性為531，比出發菌W-925分別提高了 100%和81%。化工部飼料添加劑技術服務中心王成書等(1997)采用該中心的里氏木霉A3先進行紫外線和亞硝基胍復合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，30°C培養5-8天，15°C放置7-10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進行三角瓶固態發酵再篩選，得到了產纖維素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。
[0008]纖維素酶的生產工藝主要有兩種，即固體發酵和液體發酵，其工藝如下:
[0009]1、影響產酶量和活力的因素:影響纖維素酶產量和活力的因素很多，除菌種外，還有培養溫度、pH、水分、基質、培養時間等。這些因素不是孤立的，而是相互聯系的。張中良等(1997)采用均勻設計C112 (1210)，以綠色木霉(T.ViriclePers.expr)為菌種，研究了影響產纖維素酶的五大因素對產酶量和活力的作用，認為基質粗纖維含量為40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31°C條件下培養45h可獲得最大產酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g *h。王成華等(1997)也研究了其誘變篩選的里氏木霉91-3的產酶條件，結果表明該菌種以7:3的秸桿粉和麥麩，另添加4%硫酸銨、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養基，28-320C為適宜培養溫度，30°C為最佳溫度，4%為最佳接種量，96h到達發酵高峰。張苓花等 (1998)研究了以康氏木霉W-925為出發菌，經誘變后得到的Wu-932纖維素酶高產菌的最佳發酵條件。結果表明，以1:2的麥麩和稻草粉為培養基，5%的接種量，稻草粉碎平均長度3-5mm，初始PH4-5，溫度在28-35°C，發酵時間72h為最佳發酵條件。
[0010]專利申請號為201010040047， 申請人:浙江大學，本發明提供了一種生產纖維素酶的方法，包括以下步驟:將里氏木霉(TriCh。derma reesei)接種至發酵培養基中，發酵后開始流加培養，流加培養過程中，當發酵液PH值高于4.8時，流加培養基，當發酵液pH值低于4.5時，停止流加培養基，總發酵時間達到192-240小時，停止發酵。本發明方法將不溶性碳源和可溶性碳源有機結合，協同誘導纖維素酶基因的表達。通過流加培養使菌種的生長與目的代謝產物的形成過程達到協調平衡，解決了單純以纖維素或可溶性糖為誘導物生產纖維素酶的工藝中存在的問題，有效提高了纖維素酶的發酵水平，而且獲得的纖維素酶對纖維素底物的降解性能較強。
[0011]申請號2013102687288 —種低溫中性纖維素酶的制備方法，所述低溫中性纖維素酶以里氏木霉為菌株制備，該制備方法包括:活化菌種，紫外誘變，然后在低溫下培養、純化，并將純化菌株于10_15°C下發酵制備種子液，將種子液接種于產酶培養基中，10_15°C下培養96-144小時，便獲得低溫中性纖維素酶；本發明還提供了一種所述低溫中性纖維素酶的復配方法。本發明的有益效果為:操作簡單，發酵周期短，可降低酶的應用溫度，從而降低工業應用的耗能，使其更環保，具有廣闊的應用前景；此外，本發明還提供了一種該纖維素酶的復配方法，其可廣泛用于造紙纖維的改性，降低造紙工業纖維改性的成本。
【發明內容】
[0012]本發明所要解決的技術問題是提供一株產纖維素酶活力高且穩定性好的里氏木霉菌株。本發明所提供的里氏木霉(Trichodema reesei) 601-17,該菌株于2013年11月3日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2013540，分類命名為里氏木霉601-17Trichodema reesei601_17,保藏地址:武漢市武昌區洛珈山武漢大學生命科學學院，郵編430072。
[0013]所述菌株生理生化特征:
[0014]該菌株在PDA固體培養基上生長，形成的菌落特征為菌落呈棉絮狀，菌落呈淡綠色，菌落扁平，高0.1-0.75mm,菌落邊緣白色，整齊；生長速度快，48h菌落直徑達
1.0-8.5mm, 72h達30-50mm ;菌絲白色，有隔膜，菌絲壁光滑，直徑在2_5微米。分生孢子梗從菌絲的短側枝發生，側枝上對生。分生孢子梗呈瓶狀，直立，無色，孢子呈球形，綠色，直徑20-100 微米。
[0015]該菌株可在麥麩上生長，主要代謝產物為纖維素酶(內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖苷酶)。根據((An Introduction industrial mycology)) (George Smithl954)、《真菌鑒定手冊》(魏景超1982)、《常見與常用真菌》(中科院微生物研究所1973)，鑒定該菌株為:里氏木霉。
[0016]培養特征:該菌株產纖維素酶的最適pH3.0-6.0 ;最適溫度為23~35°C。
[0017]種子液接種于發酵培養基中，25°C培養104小時，發酵液纖維素酶的的外切β -葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到680U/mL、1389U/mL、486U/mL 和 792U/mL。
[0018]利用里氏木霉菌株，通過紫外誘變、培養、發酵生產纖維素酶的方法如下。
[0019]里氏木霉菌株接種到斜面活化培養基上,活化菌種；培養活化后的菌種,挑取單菌落制備孢子懸浮液，并用紫外線照射孢子懸浮液，誘變得到孢子菌落；
[0020]誘變選育后的孢子菌落涂布于初篩培養基`中，在20_35°C下培養3-5天，挑選初篩菌株并純化該菌株；純化菌株按5%的接種量接種于發酵培養基中，逐級擴大培養制備種子液，培養時間為72-96小時；種子液按發酵液體積5-10%的接種量接種于發酵培養基中，20-35°C培養96-144小時，即里氏木霉發酵生產纖維素酶結束；將發酵液在4000-6000rpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進行超濃縮過濾，得到濃縮酶液。
[0021]本發明的有益效果為:得到了一株產纖維素酶活力高且穩定性好的里氏木霉菌株，改菌株發酵生產高活力的酸性纖維素酶，其制備方法簡單，發酵周期短，可大大降低工業應用的耗能，使其更環保，具有廣闊的工業應用前景。
【具體實施方式】:
[0022]菌種初篩:原始菌株里氏木霉(Trichodema reesei) HYX01采自津市市保河堤食用菌培植基地中的土樣篩選分離出。里氏木霉菌株接種到斜面活化培養基上，活化菌種；培養活化后的菌種，挑取單菌落制備孢子懸浮液，并用紫外照射孢子懸浮液，誘變得到孢子菌落；適當稀釋將孢子濃度調節為103個/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL,稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養基上。在30°C培養2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容1000mL,pH 值 5-6，121°C滅菌 20min)。
[0023]復篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養基，30°C培養至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復篩培養基的250mL三角瓶中進行發酵，接種量10%(V/V)，30°C、100r/min培養96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。(所述復篩培養基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進行放大實驗。
[0024]復篩選出菌株為里氏木霉(Trichodema reesei) 601-17，保藏編號為CCTCC NO:M2013540。
[0025]培養特征:該菌株產纖維素酶的最適pH3.0-6.0 ;最適溫度為23~35°C。
[0026]遺傳穩定性試驗:將該菌株在斜面上連續十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發酵情況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩定性較強。
[0027]放大試驗
[0028]種子培養:將纖維素酶酶活力最高的菌株接入500mL三角瓶中，種子培養基裝量100毫升，300C、150rpm搖床培養72_96h。，種子培養基:纖維素粉5%、硫酸銨0.3%、硫酸鎂
0.025%、磷酸二氫鉀0.1%、氯化鈉0.01%、其余為水，pH值5-6，121°C滅菌20min。
[0029]種子罐培養:將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發酵培養基的IOL發酵罐中，控制pH值恒定為5.0±0.2，培養溫度27±0.1°C，攪拌速度300rpm，通風量(v/v)1:0.8-1.2,培養時間104h，溶解氧20-30%。所述發酵培養基制備方法為:纖維素粉10%、硫酸銨0.5%、硫酸鎂0.025%、磷酸二氫鉀0.1%、氯化鈉0.01%、其余為水，pH值5-6，121°C滅菌20mino
[0030]發酵結束后，取發酵上清液(粗酶液)進行酶活力檢測，經測定，外切β -葡聚糖酶、內切β -葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和`濾紙酶活力分別達到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。
[0031]本發明中使用的里氏木霉(Trichodema reesei)誘變后的菌株在4°C環境中可保存2個月，在10-20%的山梨醇溶液中，于零下80°C下可長期保存。
[0032]斜面培養基:馬鈴薯20%、葡萄糖1%、瓊脂2%，其余為水，pH自然，溫度28°C。
【權利要求】
1.一種產纖維素酶的菌株,其特征在于，所述菌株為里氏木霉菌種(Trichodermareesei) 601-17，保藏編號為 CCTCC NO:M2013540。
2.根據權利要求1所述的產纖維素酶的菌株，其特征在于，所述菌株生理生化特征如下:該菌株在PDA固體培養基上生長，形成的菌落呈棉絮狀，淡綠色，菌落扁平，高0.1-0.75mm,菌落邊緣白色,整齊；生長速度快,48h菌落直徑達1.0-8.5mm, 72h達30_50mm ；菌絲白色，有隔膜，菌絲壁光滑，直徑在2-5微米；分生孢子梗從菌絲的短側枝發生，側枝上對生；分生抱子梗呈瓶狀，直立，無色，孢子呈球形，綠色，直徑20-100微米。
3.根據權利要求1或2所述的產纖維素酶的菌株，其特征在于，所述菌株產纖維素酶的最適ρΗ3.0-6.0，最適溫度為23-35°C。
4.根據權利要求1或2所述的產纖維素酶的菌株，種子液接種于發酵培養基中，25°C培養104小時，發酵液纖維素酶的的外切β-葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到680U/mL`、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。
【文檔編號】C12N1/14GK103740600SQ201310716663
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】李洪兵, 張錦杰, 朱永明, 孫明芳, 陳香 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司