一種針對鐮刀菌的多重pcr檢測的引物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種針對鐮刀菌的多重PCR檢測的引物及其應用，所述引物由三組引物對組成，夠一次性通過多重PCR擴增體系快速準確鑒定引起玉米穗腐病的三種鐮刀菌：禾谷鐮刀菌、輪枝鐮刀菌和層出鐮刀菌，檢測引物具有很好的特異性，僅能從目標菌中擴增到特異大小的條帶，不能從近源種或其他病原真菌中檢測到條帶；而且整個PCR和電泳過程僅耗時2h，快速、簡便、準確區分引起玉米穗腐的三種不同鐮刀菌。
【專利說明】—種針對鐮刀菌的多重PCR檢測的引物及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種鑒定鐮刀菌的引物序列及其應用。
【背景技術】
[0002]玉米是重要的糧食作物和飼料來源，穗腐病是玉米生長后期最常見的病害之一，在各玉米產區均有發生，由多種病原菌引起。鐮刀菌是引起玉米穗腐病的主要病原菌，不僅給玉米生產造成巨大的經濟損失，鐮刀菌在致病過程中積累的真菌毒素還降低玉米的品質，給食品安全和飼料安全造成嚴重威脅。
[0003]在不同氣候帶的玉米產區中，引起玉米穗腐病的鐮刀菌種群結構不同。在歐洲中東部，玉米穗腐病的主要致病菌是禾谷鐮刀菌graminearum,輪枝鐮刀菌F.verticillioides則遍布整個歐洲，其他的一些鐮刀菌也會引起玉米穗腐病，包括/7.subglu tinans, F.pro Ii fera turn和F.cu Imorum。在中國，引起玉米穗腐病的鐮刀菌種群主要包括禾谷鐮刀菌F.graminearum,輪枝鐮刀菌F.verticillioide和層出鐮刀菌/7.其中輪枝鐮刀菌/7.verticillioide為優勢種群，禾谷鐮刀菌/7.其次,層出鐮刀菌/7.也經常有檢出。由于不同的鐮刀菌產生的
真菌毒素的種類不一樣，再加上傳統的形態學檢測方法耗時費事，因此，急需通過多重PCR檢測的引物建立一種快速簡便且能一次準確區分這三種不同鐮刀菌的檢測方法對于玉米穗腐病的種群分布和動態分析奠定理論基礎，為該病害的綜合治理提供科學依據。
[0004]此外,禾谷鐮刀菌/7.還是引起麥類作物赤霉病的主要病原菌,因此多重PCR檢測的引物還可以直接用于檢測引起麥類作物赤霉病的病原菌。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于，為同時檢測禾谷鐮刀菌、輪枝鐮刀菌和層出鐮刀菌，基于不同鐮刀菌編碼的酮酸-還原異構酶的ILV5基因和編碼留醇24-C還原酶的ERG24B基因的堿基差異，提供一種用于多重PCR檢測的引物及其應用。
[0006]本發明目的是這樣實現的:
一種針對鐮刀菌的多重PCR檢測的引物，其特征在于:多重PCR檢測的引物由三組引物對組成，它們分別是序列號為SEQ ID N0.1的Fg-F和序列號為SEQ ID N0.2的Fg-R,序列號為SEQ ID N0.3的Fv-F和序列號為SEQ ID N0.4的Fv-R,以及序列號為SEQ ID N0.5的Fp-F和序列號為SEQ ID N0.6的Fp-R0
[0007]本發明中，所述多重PCR檢測的引物在針對禾谷鐮刀菌(/7.CraffiiflearwffiA輪枝鐮刀菌iF.Verticillioide)和層出鐮刀菌iF.Proliferatum)檢測中的應用。 [0008]本發明中，所述的應用，其具體步驟為:
a)提取待檢測菌株的DNA;
b)多重PCR擴增:以待檢測菌株的DNA為模板進行多重PCR擴增；
多重 PCR 反應體系:10 XPCR Buffer 2.5 μ 1,4.5U Taq 酶、dNTPs 0.2 μ M、MgCl2 2mM、DNA 模板 2 μ 1、引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ IDN0.5和SEQ ID N0.6各0.07 μ M，最后加滅菌雙蒸水至25 μ I ;
多重PCR反應條件:94°C預變性5 min;94°C變性25 s、60°C退火25 s、72°C延伸25 s,共30個循環；72°C延伸10 min, 10°C保存；
c)1.5% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，經含有1% (w/v)的EB染色液染色后，觀測凝膠中DNA條帶大小，擴增得到885-bp DNA條帶為禾谷鐮刀菌，擴增得到416_bpDNA條帶為輪枝鐮刀菌，擴增得到220-bp DNA條帶為層出鐮刀菌。
[0009]本發明的優點在于，所提供的三組引物及其多重PCR方法能夠一次性通過多重PCR擴增體系快速準確鑒定引起玉米穗腐病的三種鐮刀菌(禾谷鐮刀菌、輪枝鐮刀菌和層出鐮刀菌)，檢測引物具有很好的特異性，僅能從目標菌中擴增到特異大小的條帶，不能從近源種或其他病原真菌中檢測到條帶；而且整個PCR和電泳過程僅耗時2h，因此，本發明的引物與檢測方法可以用來快速、簡便、準確區分引起玉米穗腐的三種不同鐮刀菌。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1a為采用引物組SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2進行PCR特異性檢測樣品擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖1b為采用引物組SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4進行PCR特異性檢測樣品擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖1c為采用引物組SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6進行PCR特異性檢測樣品擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖；
在圖1a圖1b圖1c中:泳道M為DNA標準物，泳道Y為陰性對照，泳道1_3為禾谷鐮刀菌/7.gramine arum、泳道_ 4_6為輪枝鐮刀菌/7.verticil I ioides、泳造_ 7_9為層出鐮刀菌Z7.proliferatum10-15依次分別為亞洲鐮刀菌Z7.aWica?、水稻惡苗病菌/7./i/j'iiaro1、尖孢鐮刀菌/7.稻痕病菌orjzea、灰葡萄孢漢ciflerea和油菜
菌核病菌 S Sclero tiorium。
[0011]圖2為1-10個待測玉米樣品的多重PCR檢測擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0012]【具體實施方式】:
下面結合具體實施例，進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0013]實施例1 DNA的提取
實施例所涉及試劑:CTAB提取液:含有20 mM EDTAU00 mM Tris-HClU.4 M NaCl以及體積比為2% CTAB。
[0014]實施例所涉及菌株:3株禾谷鐮刀菌(/7.株輪枝鐮刀菌(/7.ver ticillioide)^3 株層出鍵刀菌(Z7.pro Ii fera turn )、I 株亞洲鍵刀菌(Z7.asi a ti cum )、I株水稻惡苗病菌(/7.fujikuroi )、I株尖孢鐮刀菌(/7.0xysproum)Λ株稻痕病菌i Magnaporthe oryzea)^ \株灰葡萄抱QBotrytis cinerea )和I株油菜菌核病菌{Sc Ier ο tinia sclero ti ori um )。上述菌株均為常見的植物病原真菌，可以通過常規的分離純化方法獲得，即:取植物感病樣品的病健交界處，無菌操作條件下使用70%乙醇消毒5s，再在無菌水中清洗3次，置于含有殺細菌的鏈霉素的PDA平板上培養，然后通過已有報道的形態學特征和分子檢測方法進行驗證，后保存在4°C冰箱。
[0015]分別對上述菌株通過以下方法提取DNA:
用無菌的接種針從PDA平板上刮取約100 mg的新鮮菌絲，置于1.5 ml的離心管中，加500 μ I的CTAB提取液，用電鉆驅動玻璃棒充分研磨，震蕩均勻，在室溫靜置10 min后13200 rpm離心10 min ;取上清液到1.5ml的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，混合均勻，在-20°C冰箱放置20 min后13200 rpm離心10 min，棄上清，將沉淀用I ml的70%乙醇洗滌，室溫放置干燥后溶解于100 μ I的滅菌雙蒸水，放于_20°C冰箱備用。
[0016]實施例2引物設計及合成
根據不同鐮刀菌編碼的酮酸-還原異構酶的TZ作基因和編碼留醇24-C還原酶的基因的堿基差異，設計了三組等位專化PCR引物Fg-F + Fg-R,Fv-F + Fv-R和Fp-F+ Fp-R，引物序列如下表1。
【權利要求】
1.一種針對鐮刀菌的多重PCR檢測的引物，其特征在于:多重PCR檢測的引物由三組引物對組成，它們分別是序列號為SEQ ID N0.1的Fg-F和序列號為SEQ ID N0.2的Fg-R，序列號為SEQ ID N0.3的Fv-F和序列號為SEQ ID N0.4的Fv-R,以及序列號為SEQ ID N0.5的Fp-F和序列號為SEQ ID N0.6的Fp-R。
2.—種如權利要求1所述多重PCR檢測的引物在針對禾谷鐮刀菌(/7.Graminearum)^輪枝鐮刀菌(/7.VerticiIlioide)和層出鐮刀菌iF.Proliferatum)檢測中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其具體步驟為: a)提取待檢測菌株的DNA; b)多重PCR擴增:以待檢測菌株的DNA為模板進行多重PCR擴增； 多重 PCR 反應體系:10 XPCR Buffer 2.5 μ 1,4.5U Taq 酶、dNTPs 0.2 μ M、MgCl2 2mM、DNA 模板 2 μ 1、引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ IDN0.5和SEQ ID N0.6各0.07 μ M，最后加滅菌雙蒸水至25 μ I ; 多重PCR反應條件:94°C預變性5 min;94°C變性25 s、60°C退火25 s、72°C延伸25 s,共30個循環；72°C延伸10 min, 10°C保存； c)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，經含有1%的EB染色液染色后，觀測凝膠中DNA條帶大小，擴增得到885-bp DNA條帶為禾谷鐮刀菌，擴增得到416_bp DNA條帶為輪枝鐮刀菌，擴增得到220-b p DNA條帶為層出鐮刀菌。
【文檔編號】C12N15/11GK103740815SQ201310707580
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】劉馨, 史建榮, 徐劍宏, 仇劍波, 王健 申請人:江蘇省農業科學院