ω-氨基脂肪酸的生產的制作方法
【專利摘要】本發明涉及全細胞催化劑，其表達重組α-雙加氧酶、或重組脂肪酸還原酶和將所述脂肪酸還原酶進行磷酸泛酰巰基乙胺化的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶的組合，且其除了表達α-雙加氧酶和/或脂肪酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶的組合以外還表達轉氨酶，其中，所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶和/或轉氨酶優選地為重組體；還涉及用于將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯轉化成胺的方法，所述方法包括下述步驟：通過與烷烴羥化酶和/或醇脫氫酶接觸，將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯氧化成氧化產物，使所述氧化產物與磷酸泛酰巰基乙胺基化的脂肪酸還原酶或α-雙加氧酶接觸以產生醛，和使所述醛與轉氨酶接觸。
【專利說明】ω-氨基脂肪酸的生產
[0001]本發明涉及全細胞催化劑，其表達重組α-雙加氧酶、或重組脂肪酸還原酶和將所述脂肪酸還原酶進行磷酸泛酰巰基乙胺化的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶的組合，且其另外表達轉氨酶，其中，所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶和/或轉氨酶優選地為重組體；還涉及用于將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯轉化成胺的方法，所述方法包括下述步驟:通過與烷烴羥化酶和/或醇脫氫酶接觸，將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯氧化成氧化產物，使所述氧化產物與磷酸泛酰巰基乙胺基化的脂肪酸還原酶或α -雙加氧酶接觸以產生醛，和使所述醛與轉氨酶接觸。
[0002]聚酰胺是一類以重復的酰胺基為特征的聚合物。術語“聚酰胺”不同于化學上有關的蛋白，通常涉及合成的、商購可得的熱塑性塑料。聚酰胺源自伯胺或仲胺，所述伯胺或仲胺常規地在烴裂化中得到。但是，衍生物(更精確地講，氨基羧酸、內酰胺和二胺)也可以用于聚合物生產。也感興趣的是作為起始物(Edukt)的短鏈氣態烷烴，其可以通過生物技術方法從可再生原料開始得到。
[0003]許多具有巨大商業需求的聚酰胺從內酰胺生產。例如“聚酰胺6”可以通過ε -己內酰胺的聚合得到，“聚酰胺12”可以通過月桂內酰胺的聚合得到。其它商業上感興趣的產物包括內酰胺的共聚物，例如ε-己內酰胺和月桂內酰胺的共聚物。
[0004]胺的常規工業化學生產依賴于化石原料的供給，且是低效的，并且在該過程中，形成大量不希望的副產物，在許多合成步驟中，多達80%。這樣的過程的一個例子是月桂內酰胺的生產。常規地，這通過多級過程來實現，所述多級過程不僅提供低產率，而且同時需要提供昂貴的基礎設施。
[0005]考慮到這些缺點，開發了使用生物催化劑從可再生原料得到胺的方法。可能的可再生原料具體地是脂肪酸源，其可以以下述形式得到:菜油、大球花薊油、棕櫚堅果油、椰子油、葵花子油和得自許多生物學來源(尤其是植物)的類似天然產物。
[0006]PCT/EP2008/067447描述了使用細胞來生產化學上有關的產物(更精確講，ω-氨基羧酸)的生物技術系統，所述細胞具有許多合適的酶活性，且能夠將羧酸轉化成對應的ω -氨基羧酸。所述方法包括一系列酶促催化的反應，尤其是將末端碳原子處的脂肪酸氧化為醛，隨后使用轉氨酶和作為胺供體的氨基酸進行胺化，所述胺供體可以通過氨基酸脫氫酶再生。
[0007]但是,在其中使用的得自惡臭假單胞菌iPseudomonas putida) GPOl的AlkBGT氧化酶系統的已知缺點在于，它不能執行脂族烷烴至伯醇的選擇性氧化。相反，形成大量氧化產物，尤其是，更高度氧化的產物(諸如對應的醛、酮或對應的羧酸)的比例隨著反應時間增加而增加(C.Grant, J.M.Woodley 和 F.Baganz (2011), Enzyme and MicrobialTechnology 48，480-486)，這會相應地降低期望的胺的產率。
[0008] 形成的氧化產物在結構上非常類似的事實，會加重相對非選擇性氧化的問題。這意味著，非常難以有效地和在沒有顯著產率損失下將它們與期望的氧化產物分離。
[0009]該方法的另一個缺點在于，過度氧化的副產物(例如用作起始物的脂肪酸的二羧酸)、疏水溶劑和疏水液體陽離子交換劑(根據PCT/EP2011/071491，其可以用于從水性反應混合物中分離產物)的重復利用是以資源利用效率為代價。
[0010]在這方面，應當強調的是，如PCT/EP2008/067447所述的具有一系列反應(其中的每個單獨反應由一種特定酶催化)的生物技術系統的復雜性使得難以優化反應條件。因此，在基本上以反應性的ω-氨基脂肪酸作為產物的情況下，存在從細胞內部的某種臨界濃度起它們將與生物體的必需組分反應的可能性，并因而具有毒性效應。如果這是事實，那么生物體的生長和合成能力會受損，甚至導致細胞的死亡，而開發者不能直接識別毒性或甚至將它歸因于特定起始物、中間體或產物。也難以預測何種生物體耐受化學反應性物質的何種濃度。
[0011]也關于要提高的產物產率和要減少的副產物形成，本領域技術人員常規地不能鑒別系統(諸如在PCT/EP2008/067447中描述的系統)中的限制性因素和決定性因素。如果產物產率過低，那么這可能是因為酶之一以過低的濃度存在，而不知道這是可能的酶中的哪一種，即由于合成能力不足，在預測的時間段中或在被競爭酶降解之前，起始物未被轉化。可替換地，完全可能的是，酶實際上在細胞中以多肽的形式是可檢測的，但是在該特定細胞中，不具有為活性必需的折疊，或者缺乏迄今未知的、但是為活性所必需的輔因子。同樣地，如已提及的，代謝產物可以是對細胞有毒的，或者被降解。最后，必須考慮與內源酶(即在用作全細胞催化劑的細胞中天然存在的那些)的干擾性相互作用。
[0012]因此，需要從脂肪酸生產ω-氨基脂肪酸的方法，其中酶促催化的反應更選擇性地進行，并且使不希望的副產物的形成最小化。
[0013]在該背景下，作為本發明的基礎的問題是，提供就產率、碳和/或氮平衡和/或純度而言盡可能有效的生產ω-氨基脂肪酸的生物技術方法。
[0014]作為本發明的基 礎的另一個問題是，提供就產率、碳和/或氮平衡、使用的試劑的可復用性和/或產物的純度而言盡可能有效的將羧酸酯轉化成胺化的羧酸酯的生物技術方法。在此方面下，有效的碳和/或氮平衡優選地被理解為是指，在期望的終產物中重現用于轉化合適底物形式的羧酸酯而供料到細胞的盡可能高的碳和/或氮含量，而不是例如轉化成不期望的產物。
[0015]作為本發明的基礎的另一個問題是，提高得自羧酸酯轉化的多相反應混合物的可處理性，尤其是就用于處理使用的疏水溶劑和液體陽離子交換劑的可復用性而言，和就兩相系統中的相形成和相分離而言，所述兩相系統包含水相(在其中進行羧酸酯的轉化)和有機相(含有有機溶劑和/或液體陽離子交換劑)。
[0016]本申請的主題和尤其是附帶的獨立權利要求的主題解決了這些和其它問題，其中實施方案來自從屬權利要求。
[0017]在第一方面，全細胞催化劑解決了作為本發明的基礎的問題，所述全細胞催化劑表達重組α -雙加氧酶、或重組脂肪酸還原酶和將所述脂肪酸還原酶進行磷酸泛酰巰基乙胺化的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶的組合，且其另外表達轉氨酶，其中所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶和/或轉氨酶優選地為重組體。
[0018]在第一方面的第一個實施方案中，全細胞催化劑解決了所述問題，所述全細胞催化劑另外表達優選地為重組體的氨基酸脫氫酶。
[0019]在也是第一個實施方案的一個實施方案的第二個實施方案中，全細胞催化劑解決了所述問題，所述全細胞催化劑另外表達優選地為重組體的烷烴羥化酶。[0020]在也是第一至第二個實施方案的一個實施方案的第三個實施方案中，全細胞催化劑解決了所述問題，所述全細胞催化劑另外表達優選地為重組體的AlkL家族的多肽。
[0021]在也是第一至第三個實施方案的一個實施方案的第四個實施方案中，全細胞催化劑解決了所述問題，所述全細胞催化劑另外表達優選地為重組體的醇脫氫酶。
[0022]在也是第一至第四個實施方案的一個實施方案的第五個實施方案中，全細胞催化劑解決了所述問題，其中與全細胞催化劑的野生型相比，在氧化中涉及的至少一種酶的活性降低。
[0023]在也是第一至第五個實施方案的一個實施方案的第六個實施方案中，全細胞催化劑解決了所述問題，其中與全細胞催化劑的野生型相比，BioH或其變體的活性降低。
[0024]在也是第一至第六個實施方案的一個實施方案的第七個實施方案中，全細胞催化劑解決了所述問題，其中與全細胞催化劑的野生型相比，FadL或其變體的活性增加。
[0025]在第二方面，一種用于將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯轉化成胺的方法解決了作為本發明的基礎的問題，所述方法包括下述步驟
a)通過與烷烴羥化酶和/或醇脫氫酶接觸，將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯氧化成氧化產物，
b)使所述氧化產物與磷酸泛酰巰基乙胺基化的脂肪酸還原酶或α-雙加氧酶接觸以產生醛,和
c)使所述醛與轉氨酶接觸。
[0026]在第二方面，一種方法解決了作為本發明的基礎的問題，其中在步驟c)中，存在氨基酸脫氫酶。
[0027]在第二方面的第一個實施方案中，一種方法解決了所述問題，其中以根據本發明的第一方面的全細胞催化劑的形式，提供選自磷酸泛酰巰基乙胺基化的脂肪酸還原酶、α-雙加氧酶、轉氨酶、氨基酸脫氫酶和烷烴羥化酶的至少一種酶，優選得自該組的使用的所有酶。
[0028]在也是第一個實施方案的一個實施方案的第二個實施方案中，一種方法解決了所述問題，其中所述脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯是式(I)的化合物
R1-A- COOR2(I)
其中 R1 選自-H、-CHO, -OH 和 C00R3，
其中R2和R3各自且彼此獨立地選自H、甲基、乙基和丙基，
前提條件是，殘基R2和R3中的至少一個是H，且
其中A代表無分支的、支鏈、直鏈、環狀、被取代的或未被取代的、具有至少4個碳原子的烴基。
[0029]在也是第一至第二個實施方案的一個實施方案的第三個實施方案中，一種方法解決了所述問題，其中A具有式-(CH2)n _，其中η是至少4，優選至少10。
[0030]在第三方面，通過使用根據第一方面的全細胞催化劑或根據第二方面的方法用于將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯胺化，解決了作為本發明的基礎的問題。
[0031]在第四方面，一種反應混合物解決了作為本發明的基礎的問題，所述反應混合物包含在水溶液中的根據第一方面的全細胞催化劑和式(I)的脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯
R1-A- COOR2(I)，
其中 R1 選自-H、-CHO, -OH 和 C00R3，
其中R2和R3各自且彼此獨立地選自H、甲基、乙基和丙基，
前提條件是，殘基R2和R3中的至少一個是H，且
其中A代表無分支的、支鏈、直鏈、環狀、被取代的或未被取代的、具有至少4個碳原子的烴基，優選式-(CH2)n -，其中η是至少4，特別優選至少10。
[0032]本發明是基于發明人的以下發現:用于從脂肪酸生產ω-氨基脂肪酸且具有適當酶組合物(Ausstattung)的全細胞催化劑中的在功能上共表達的重組脂肪酸還原酶或α-雙加氧酶會令人驚訝地增加ω-氨基脂肪酸的產率。
[0033]此外，本發明是基于發明人的以下發現:用于從脂肪酸生產ω-氨基脂肪酸且具有適當酶組合物的全細胞催化劑中的在功能上共表達的重組脂肪酸還原酶或α-雙加氧酶會令人驚訝地降低得到的產物中的干擾性副產物(尤其是二羧酸及其酯形式的過度氧化的脂肪酸)的濃度。
[0034]此外，本發明是基于發明人的以下發現:用于從脂肪酸生產ω-氨基脂肪酸且具有適當酶組合物的全細胞催化劑中的在功能上共表達的重組脂肪酸還原酶或α-雙加氧酶會提高液體陽離子交換劑(諸如油酸)的純度和可復用性，所述液體陽離子交換劑用于從含有全細胞催化劑的發酵溶液中除去ω-氨基脂肪酸。
[0035]本發明涉及一種改進的將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯轉化成胺的方法，其特征在于，除催化脂肪酸經由它的多個氧化階段轉化為胺的反應的酶外，也存在至少一種脂肪酸還原酶或α -雙`加氧酶、或者兩種酶的組合，優選地，當將全細胞催化劑用于執行所述方法時。在一個優選的實施方案中，本文中使用的術語“脂肪酸還原酶”被理解為是指這樣的酶:其在消耗ATP和NAD(P)H下催化ω-羧基酸(也被描述為二羧酸或ω-羧基脂肪酸)向對應的ω-氧代脂肪酸的轉化。在現有技術中，例如在W0/2010/135624中，描述了用于生產ω-羥基脂肪酸的脂肪酸還原酶，但是不是作為用于生產ω-氨基脂肪酸的系統的一部分。在一個更優選的實施方案中，所述脂肪酸還原酶選自含有以下氨基酸序列及其變體的脂肪酸還原酶:ΥΡ_887275.1、ΖΡ_11001941.1、ΖΡ_06852401.1、ΝΡ_959974.1、ΥΡ_001070587.1、ΖΡ_05217435.1、ΥΡ_882653.1、ΥΡ_639435.1、ΖΡ_10800193.1、ΥΡ_006452763.1、ΥΡ_006730440.1、ΖΡ_11196216.1、ΥΡ_005349252.1、ΖΡ_05224908.1、ΥΡ_005338837.1、ΥΡ_006307000.1、ΥΡ_005343991.1、ΖΡ_11001942.1、ΖΡ_09979565.1、ΥΡ_005003162.1、ΥΡ_953393.1、ΥΡ_001850422.1、ΖΡ_11011489.1、ΖΡ_12689264.1、ΥΡ_905678.1、ΖΡ_09976919.1、ΥΡ_004746059.1、ΝΡ_217106.1、ΥΡ_004525443.1、ΝΡ_337166.1、ΖΡ_09685823.1、ΥΡ_978699.1、ΖΡ_06437984.1、ΖΡ_06514086.1、ΝΡ_856267.UCAA19077.1、ΝΡ_301424.1、ΖΡ_06522140.1、ΖΡ_06518098.1、ΖΡ_11008938.1、ΖΡ_07432374.2、AAR91681.1、ΥΡ_006808747.1、ΥΡ_001851230.1、ΖΡ_15327751.1、ΖΡ_15455857.1、ΖΡ_12874284.1、ΖΡ_15332534.1、ΖΡ_15512956.1、ΖΡ_14244106.1、ΖΡ_15470899.1、ΖΡ_11439367.1、ΥΡ_001703694.1、ΖΡ_15446742.1、ΥΡ_006808978.1、ΖΡ_07964926.1、ΥΡ_006521379.1、WP_007769435.1、ΖΡ_15512957.1、ΖΡ_12874283.1、ΥΡ_005350955.1、ΖΡ_14243341.1、ΥΡ_001705436.1、ΖΡ_15329649.1、
【權利要求】
1.全細胞催化劑，其表達重組α-雙加氧酶、或重組脂肪酸還原酶和將所述脂肪酸還原酶進行磷酸泛酰巰基乙胺化的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶的組合，且其另外表達轉氨酶，其中，所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶和/或轉氨酶優選地為重組體。
2.根據權利要求2所述的全細胞催化劑，其中，所述全細胞催化劑另外表達優選地為重組體的氨基酸脫氫酶。
3.根據權利要求1-2中任一項所述的全細胞催化劑，其中，所述全細胞催化劑另外表達優選地為重組體的烷烴羥化酶。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的全細胞催化劑，其中，所述全細胞催化劑另外表達優選地為重組體的AlkL家族的多肽。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的全細胞催化劑，其中，它另外表達優選地為重組體的醇脫氫酶。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的全細胞催化劑，其中，與全細胞催化劑的野生型相比，在β-氧化中參與的至少一種酶的活性降低。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的全細胞催化劑，其中，與全細胞催化劑的野生型相比，BioH或其變體的活性降低。
8.根據權利要求1-6中任一項所述的全細胞催化劑，其中，與全細胞催化劑的野生型相比，FadL或其變體的活性增加。
9.用于將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯轉化成胺的方法，所述方法包括下述步驟 a)通過與烷烴羥化酶和/或醇脫氫酶接觸，將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯氧化成氧化產物，` b)使所述氧化產物與磷酸泛酰巰基乙胺基化的脂肪酸還原酶或α-雙加氧酶接觸以產生醛,和 c)使所述醛與轉氨酶接觸。
10.根據權利要求9所述的方法，其中，在步驟c)中，存在氨基酸脫氫酶。
11.根據權利要求9-10中任一項所述的方法，其中，以根據權利要求1-8中任一項所述的全細胞催化劑的形式，提供選自磷酸泛酰巰基乙胺基化的脂肪酸還原酶、α -雙加氧酶、轉氨酶、氨基酸脫氫酶和烷烴羥化酶的至少一種酶，優選得自該組的使用的所有酶。
12.根據權利要求9-11中任一項所述的方法，其中，所述脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω_氧代脂肪酸或其單酯是式(I)的化合物 R1-A- COOR2(I) 其中 R1 選自-H、-CHO, -OH 和 C00R3， 其中R2和R3各自且彼此獨立地選自H、甲基、乙基和丙基， 前提條件是，殘基R2和R3中的至少一個是H，且 其中A代表無分支的、支鏈、直鏈、環狀、被取代的或未被取代的、具有至少4個碳原子的烴基。
13.根據權利要求9-12中任一項所述的方法，其中，A具有式-(CH2)n_，其中η是至少4，優選至少10。
14.根據權利要求1-8中任一項所述的全細胞催化劑或根據權利要求8-12中任一項所述的方法用于將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯胺化的用途。
15.反應混合物，其包含在水溶液中的根據權利要求1-8中任一項所述的全細胞催化劑和式(I)的脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯R1-A- COOR2(I)， 其中 R1 選自-H、-CHO, -OH 和 C00R3， 其中R2和R3各自且彼此獨立地選自H、甲基、乙基和丙基， 前提條件是，殘基R2和R3中的至少一個是H， 其中A代表無分支的、支鏈、直鏈、環狀、被取代的或未被取代的、具有至少4個碳原子的烴基，優選式-(CH 2)n _，且其中η是至少4，特別優選至少10。
【文檔編號】C12P13/04GK103881933SQ201310707410
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2012年12月21日
【發明者】S.沙費爾, J.吉倫, M.維澤爾, H-G.赫內曼, H.赫格爾, T.哈斯, W.布呂姆克 申請人:贏創工業集團股份有限公司