一種豬偽狂犬病病毒變異株prv-zj01及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及豬偽狂犬病毒【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種豬偽狂犬病毒變異株P(guān)RV-ZJ01，其保藏號(hào)為CGMCCNo.8170。所述的豬偽狂犬病病毒變異株P(guān)RV-ZJ01在制備疫苗中的應(yīng)用。采用PRV-ZJ01株病毒液制成水溶性滅活疫苗，與Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗進(jìn)行豬體免疫保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，ZJ01毒株滅活疫苗安全性較好，免疫保護(hù)效率明顯高于Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗免疫組，Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗對(duì)ZJ01超強(qiáng)毒株不能提供完全保護(hù)。ZJ01滅活疫苗對(duì)PRV變異株和傳統(tǒng)毒株均有較好免疫保護(hù)作用。PRV-ZJ01株106.0TCID50/mL滴鼻感染85日齡非免疫豬，可致全部發(fā)病和死亡。證明該病毒株毒力明顯增強(qiáng)，抗原性發(fā)生變異，滅活后具有較好免疫原性，可用于該病疫苗和診斷方法研究與開(kāi)發(fā)。
【專利說(shuō)明】—種豬偽狂犬病病毒變異株P(guān)RV-ZJ01及應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及豬偽狂犬病毒【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種豬偽狂犬病毒變異株P(guān)RV-ZJ01，還涉及豬偽狂犬病毒變異株P(guān)RV-ZJOl的應(yīng)用。
[0002]【背景技術(shù)】
偽狂犬病毒(PRV)屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科成員，可引起新生仔豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，生長(zhǎng)豬呼吸道癥狀，并能導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎與弱仔。美國(guó)與部分歐洲國(guó)家已宣布消滅和根除該病。我國(guó)廣泛使用該病基因缺失弱毒疫苗有效控制并逐步凈化。但是，自2011年底起，我國(guó)很多該病免疫豬場(chǎng)相繼出現(xiàn)仔豬嘔吐和神經(jīng)癥狀、生長(zhǎng)豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，死亡率明顯增高，妊娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、弱仔等，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，但對(duì)流行毒株的致病性和抗原性均不清楚。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】
為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的疫情不能得到有效控制的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種豬偽狂犬病毒變異株P(guān)RV-ZJOI。
[0004]本發(fā)明還提供了所述豬偽狂犬病毒變異株P(guān)RV-ZJOl在制備免疫疫苗的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)以下步驟得到的:
一種豬偽狂犬病病毒變異株P(guān)RV-ZJOl，其保藏號(hào)為CGMCC N0.8170。采用IO6 qTCID5q滴鼻感染85日齡健康豬，非免疫豬全部發(fā)病和死亡。
[0006]所述的豬偽狂犬病病毒變異株P(guān)RV-ZJOl在制備疫苗中的應(yīng)用。
[0007]優(yōu)選所述疫苗為水溶性滅活疫苗。
[0008]疫苗的制備過(guò)程為:取PRV-ZJOl病毒液滅活，加入卡波姆佐劑混合均勻即得。病毒液中病毒含量為107_°TCID5(l/mL。
[0009]疫苗中病毒抗原含量大于106_°TCID5(l/mL。
[0010]本研究采集我國(guó)某發(fā)病豬群患病仔豬腦組織病料，無(wú)菌處理后接種BHK21細(xì)胞，盲傳2代，培養(yǎng)2~3天出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，病毒空斑純化3次后連續(xù)傳代15次，均出現(xiàn)相同病變，病毒TCID5tl為10_7_ 5/mL, PCR鑒定為PRV，命名為PRV-ZJOl毒株。病毒gE和gB基因序列測(cè)定結(jié)果顯示其與其他已公布的毒株序列同源性分別為97.1%~99.6%和98.1%~99.5%，其gE基因推導(dǎo)的氨基酸序列在第54和448位發(fā)生D-1和V-1突變，第496位插入D。采用10頭24日齡仔豬進(jìn)行人工感染發(fā)病試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該分離株可引起PRV典型臨床癥狀和病理變化，100%死亡。采用24頭85日齡健康育肥豬滴鼻接種IO2 tlTCID5tl ^lO6 0 TCID50PRV-ZJOI株病毒液，結(jié)果為，攻毒組豬均出現(xiàn)發(fā)熱，精神沉郁，嘔吐，咳嗽，呼吸困難和神經(jīng)癥狀等典型癥狀，106_° TCID5tl病毒感染組豬在攻毒后7天內(nèi)全部死亡，病毒LD5tl為IO313TCID5(l/mL。該毒株與50份Bartha_K61、Bucharest、HB-98疫苗毒株血清及其抗血清交叉中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該分離毒株抗原發(fā)生明顯變異，變異系數(shù)R值為0.378、.448，首次證明PRV-ZJOl毒株為PRV超強(qiáng)毒抗原變異毒株，屬于血清2亞型超強(qiáng)毒株。
[0011]本發(fā)明的有益效果:采用PRV-ZJOl株病毒液(106_°TCID5(l/mL)制成水包油型滅活疫苗，與Bartha-K61活疫苗進(jìn)行豬體免疫保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，ZJOl毒株滅活疫苗安全性較好，免疫保護(hù)效率明顯高于Bartha-K61活疫苗免疫組，Bartha-K61活疫苗對(duì)ZJOl超強(qiáng)毒株不能提供完全保護(hù)。證明該病毒株具有較好免疫原性，可用于該病疫苗和診斷方法研究與開(kāi)發(fā)。
[0012]菌株保藏信息
保藏時(shí)間:2013年9月18日，
保藏單位:中國(guó)微生物菌株保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，
保藏編號(hào):CGMCC N0.8170，
保藏單位地址:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，
分類命名:豬偽狂犬病毒。
[0013]【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】 圖1.PRV-ZJOl的分離與PCR鑒定，其中A為病毒感染BHK-21細(xì)胞形成的細(xì)胞病變；B為病毒感染BHK21細(xì)胞形成的空斑；C為分離病毒株P(guān)CR檢測(cè)(1-4泳道為Fl，F(xiàn)5，F(xiàn)lO與F15代次病毒，第5泳道為細(xì)胞對(duì)照)。
[0014]圖2.24日齡仔豬攻毒后不同時(shí)間仔豬死亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果；
圖3上兩行圖片為24日齡仔豬攻毒后死亡豬肉眼病變觀察結(jié)果，下兩行為24日齡仔豬攻毒后死亡豬病理組織學(xué)觀察結(jié)果，其中，a為肝臟；b為腦；c為肺臟；d為脾臟；e為腎臟；f為淋巴結(jié)；
圖4為24日齡仔豬攻毒后2周不同組織中PRV核酸定量檢測(cè)結(jié)果；
圖5為85日齡豬攻毒后不同時(shí)間豬死亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果；
圖6上兩行為攻毒后死亡豬肉眼病變觀察結(jié)果；下兩行為攻毒后死亡豬病理組織學(xué)觀察結(jié)果,其中a為肝臟；b為腦；c為肺臟；d為脾臟；e為腎臟；f為淋巴結(jié)；
圖7為85日齡豬攻毒后2周不同組織中PRV核酸定量檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明:
實(shí)施例1
1.病毒分離與PCR鑒定
將采集的發(fā)病豬的腦組織剪碎混漿處理(組織與滅菌PBS重量體積比為1:10)，12000rpm離心10 min取上清經(jīng)0.22 μ m濾器過(guò)濾用于病毒的分離。將ImL過(guò)濾的病料上清接種剛長(zhǎng)滿單層的BHK-21細(xì)胞，37°C孵育Ih后棄去培養(yǎng)瓶中液體并加入2% DMEM于含5%CO2的37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)病變。待70%細(xì)胞出現(xiàn)病變后，反復(fù)凍融3次，接種BHK21細(xì)胞。病毒空斑純化3次，采用PRV PCR方法擴(kuò)增gE基因，反應(yīng)體系:1U AccuPrime? pfx DNA Polymerase 與2.5uL 10XAccuPrime? pfx Mix (Invitrogen),上下游引物各10 pmol, DNA模板IOOng,滅菌雙蒸水補(bǔ)足50 μ L。PCR反應(yīng)條件:951^預(yù)變性5 min ;95°C變性45s，62°C退火45s，68°C延伸3 min，上述3步驟進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；68°C后延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析。
[0016]結(jié)果為:病料組織無(wú)菌處理后接種長(zhǎng)滿單層的BHK-21細(xì)胞，20h后出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，折光性變強(qiáng)，形成形態(tài)各異的合胞體(圖1A)，并可以形成空斑(圖1B)。病毒經(jīng)3次空斑純化，連繼傳代15次，病毒TCID5tl為107 5/1111^0?檢測(cè)？1，？5，？10與F15代細(xì)胞毒，均擴(kuò)增出目的條帶188bp(圖1C)，證明該分離株屬于PRV，毒株命名為ZJ01。
[0017]株基因序列測(cè)定與分析
采用PCR方法擴(kuò)增gE與gB基因，反應(yīng)體系同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析，回收目的片段，克隆至載體pEASYTM-Blunt Zero (TransGen)，進(jìn)行基因測(cè)序分析。結(jié)果為:新分離毒株的這兩個(gè)基因與其他已公布的PRV毒株序列同源性分別為97.1%~99.6%和98.1%~99.5%?；蜻M(jìn)化樹(shù)分析圖中，新分離株位于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支中。gE基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，新分離株與大多數(shù)毒株相比，在54與448位發(fā)生了 54位(D-1)與448 (V-1)突變，在第496位插入D。
[0018]日齡仔豬致病性試驗(yàn)
選擇PRV陰性的24日齡仔豬10頭，隨機(jī)分成兩組，每組5頭，第I組每頭豬滴鼻接種IO6 0 TCID50 PRV-ZJOl株病毒液(F5)，對(duì)照組滴鼻接種等量細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液作為對(duì)照。隔離飼養(yǎng)，自由采食。每天觀察實(shí)驗(yàn)豬發(fā)病癥狀(如精神萎靡，食欲不振，發(fā)熱，神經(jīng)癥狀，呼吸道癥狀與死亡等)，對(duì)死亡豬系統(tǒng)解剖后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)與腦組織冷凍保存，并將上述組織于4%多聚甲醛固定，制備組織切片，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，同時(shí)用熒光定量PCR方法檢測(cè)各組中PRV核酸含量。見(jiàn)圖2-4。
[0019]結(jié)果為:(I)仔豬攻毒后2天即出現(xiàn)發(fā)熱(>41°C)，精神沉郁、嘔吐、咳嗽、呼吸困難和神經(jīng)癥狀等臨床表現(xiàn)，所有 攻毒組仔豬在5天內(nèi)全部死亡，而對(duì)照組全部健活，見(jiàn)圖2。
(2)肉眼病變?yōu)?脾臟與肝臟表面出現(xiàn)白色壞色點(diǎn)，腦組織水腫，肺臟紋理增強(qiáng)，腎臟表面有出血點(diǎn)，淋巴結(jié)腫大出血。(3)組織病變?yōu)?肝細(xì)胞變性壞死，脾細(xì)胞壞死，肺臟間質(zhì)性肺炎、上皮細(xì)胞壞死，腎臟出血，淋巴結(jié)壞死、出血，非化膿性腦炎(“衛(wèi)星現(xiàn)象”，“噬神經(jīng)元現(xiàn)象”且在高倍鏡下可見(jiàn)病毒包涵體)。見(jiàn)圖3，。(4)PRV DNA載量均在肺臟中最多，其次是腦組織，見(jiàn)圖4。
[0020]日齡育肥豬致病性試驗(yàn)
選擇PRV陰性的24頭85日齡健康豬，隨機(jī)分成6組，每組4頭，其中第1-5組為攻毒組，每頭豬分別滴鼻接種IO2 0TCID50~106_° TCID50 PRV-ZJOl株病毒液，第6組為對(duì)照組，滴鼻接種等量細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液。自由采食，隔離飼養(yǎng)，觀察2周，記錄發(fā)病癥狀與死亡情況，按Reed-Muench法計(jì)算LD5tl。同時(shí)，取死亡豬和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)豬，進(jìn)行剖檢，觀察肉眼病變，并取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)與腦組織冷凍保存，并將上述組織于4%多聚甲醛固定，制備組織切片，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。同時(shí)，用熒光定量PCR方法檢測(cè)各組中PRV核酸含量。見(jiàn)圖5-7.結(jié)果為:攻毒組實(shí)驗(yàn)豬均出現(xiàn)發(fā)熱(> 41°C )，精神沉郁，咳嗽，呼吸困難，神經(jīng)癥狀與死亡等臨床表現(xiàn)，IO6 ci TCID5tl病毒組在攻毒后7天內(nèi)全部死亡，對(duì)照組全部健活。見(jiàn)圖5。病毒對(duì)85日齡豬LD5tl為IO313 TCID5(l/mL。肉眼病變與24日齡攻毒仔豬相似，主要為:脾臟邊緣出血，肝臟表面出現(xiàn)局灶性壞死，腎臟、淋巴結(jié)、肺臟與腦組織。組織病變?yōu)?肝細(xì)胞變性壞死，脾臟出血，肺臟間質(zhì)性肺炎，腎臟出血，淋巴結(jié)壞死，非化膿性腦炎(“袖套現(xiàn)象”)。見(jiàn)圖6.PRV DNA載量均在肺臟中最多，其次是腦組織。見(jiàn)圖7。
[0021]病毒血清交叉中和試驗(yàn)
選擇PRV陰性的30日齡健康豬50頭，隨機(jī)分成5組，每組10頭，第I組肌肉注射IO20TCID50 PRV-ZJOl株病毒液，第2-5組按說(shuō)明書分別接種4種PRV疫苗，即Bartha_K61清偽靈(LT 1205476，輝瑞)、Bartha-K61 (LT 20120602，武漢中博)、Bucharest 撲偽佳(LTA289184，輝瑞)、HB-98株(LT 121041，武漢科前)。免疫后4_5周采集血液，分離血清，抗血清56°C水浴30min滅活處理，用于病毒血清交叉中和試驗(yàn)。血清倍比稀釋后分別與100TCID50原免疫病毒和ZJOl毒株混合，37°C孵育lh，每個(gè)血清稀釋度設(shè)置4個(gè)重復(fù)。接種96孔板BHK-21細(xì)胞單層，100 μ L/孔，置5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)4d，于顯微鏡下觀察細(xì)胞病變CPE，記錄病變孔數(shù)目。按照Reed-Muench法計(jì)算中和抗體效價(jià)。運(yùn)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。并采用以下公式計(jì)算R值。結(jié)果見(jiàn)表1，
【權(quán)利要求】
1.一種豬偽狂犬病病毒變異株P(guān)RV-ZJOl，其保藏號(hào)為CGMCC N0.8170。
2.—種權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病病毒變異株P(guān)RV-ZJOl在制備疫苗中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述疫苗為水溶性滅活疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于疫苗的制備過(guò)程為:取含有PRV-ZJOl病毒的病毒液，滅活，加入佐劑混合均勻即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于病毒液中病毒含量為107_°TCID5(l/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于疫苗中病毒抗原含量大于106°TCID5(l/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述病毒液與佐劑的重量比為4:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4`-6中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述佐劑為卡波姆。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK103627678SQ201310701688
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】姜平, 顧真慶, 白娟 申請(qǐng)人:姜平